抗體純化的方法有哪些

抗體純化的方法有哪些？抗體制備出來之后，需要進(jìn)一步純化得到純的多抗或單抗，既有利于保存也有利于排除雜蛋白對結(jié)果的影響。常規(guī)用于純化的材料是腹水和細(xì)胞培養(yǎng)上清，而通常經(jīng)過免疫制備的抗體大多數(shù)是IgG的各種亞型，以及少數(shù)是IgM,二者電泳條帶分步大致如下：抗體非還原型PAGE/kDa還原型PAGE/kDaIgG15050，25IgM90065，25IgM單體18065，25硫酸銨沉淀法：基本原理：高濃度的硫酸銨通過與球蛋白競爭水分子破壞蛋白表明的水化膜，降低球蛋白的溶解性，是分離免疫球蛋白的常用方法，而且不同的免疫球蛋白適宜的硫酸銨濃度也稍有差別，一般用來分離抗體的硫酸銨飽和度在33~50%。適用于：鼠抗所有亞類、其他種屬抗體、任何種屬的IgM、IgG、IgA基本操作：過濾、離心腹水或者培養(yǎng)上清得上清；加入飽和硫酸銨至終濃度45%，靜置沉淀蛋白；沉淀蛋白用最小體積PBS或硼酸鹽緩沖液溶解，用PBS或硼酸鹽緩沖液透析除鹽；過聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠柱，PBS或硼酸鹽（含0.02%疊氮鈉）緩沖液洗脫；電泳檢測分子量大小，分光光度法測定抗體濃度；抗體保存濃度在0.1-30mg/mL適宜，-20°C保存不超過一個月，避免反復(fù)凍融。親和層析法基本原理:基因工程改造的proteinA和proteinG能特異性結(jié)合哺乳動物IgG的Fc區(qū)段，將proteinA和proteinG結(jié)合到柱料上，通過親和層析的方式，可將IgG及其亞類與片段純化出來。成員介紹：proteinA分離自Staphylococcusaureu啲細(xì)胞壁，分子量42kDa，由spa基因編碼，具有五個同型的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域由三個a螺旋構(gòu)成。proteinA的B結(jié)構(gòu)域

佶號壯為-詁.t鈿恂城佶號壯為-詁.t鈿恂城?H忠型甘合站構(gòu)ts定JSWttproteinA的各個結(jié)構(gòu)域proteinA可結(jié)合多數(shù)免疫球蛋白的Fc段（尤其是人的IgGl、IgG2、IgG4,豚鼠，獼猴，鼠類IgG2a、兔）以及人VH3家族的Fab段?；蚬こ谈脑斓膒roteinA通常使用大腸桿菌作為表達(dá)宿主，表達(dá)產(chǎn)物仍含有五個Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對其結(jié)構(gòu)上的改造主要是為了增加與多孔性材料的偶聯(lián)性能，也有的改造proteinA含有四個或六個同型Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域，另外結(jié)構(gòu)域數(shù)目較少的proteinA能得到更好的抗體純化效果。proteinG分離自GStreptococcu啲細(xì)胞壁，分子量65kDa,由spgproteinG分離自GStreptococcu啲細(xì)胞壁，分子量65kDa,由spg基因編碼，可結(jié)合抗體的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白?；蚬こ谈脑斓膒roteinG去掉了與白蛋白的結(jié)合位點(diǎn)僅僅保留Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其結(jié)合力較proteinA更強(qiáng)。proteinG的B結(jié)構(gòu)域L-'.proteinG的各個結(jié)構(gòu)域還有一種proteinA/G蛋白，是基因工程改造產(chǎn)物，是將proteinA的4個Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域與proteinG的2個Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)得到的。proteinA/G結(jié)合了二者的特性，能結(jié)合人和鼠的IgG所有亞型，不結(jié)合鼠的IgA、IgM。proteinA親和層析適用于：人（IgG3除外）、兔、豚鼠、豬的抗體；基本操作：1.過濾、離心腹水或者培養(yǎng)上清得上清；2?調(diào)節(jié)pH到8.0：腹水以10倍體積pH8.0PBS稀釋、培養(yǎng)上清用pH8.0PBS透析或強(qiáng)氧化鈉調(diào)節(jié)；過proteinA瓊脂糖凝膠柱,pH8.0PBS洗雜；檸檬酸緩沖液洗脫抗體（小鼠IgG1用pH6.5,IgG2a用pH4.5,IgG2b和IgG3用pH3.0），并注意收集管內(nèi)需加入Tris緩沖液中和滴下的抗體溶液；5?用PBS透析;6.電泳檢測分子量大小，分光光度法測定抗體濃度。proteinG親和層析與proteinA相比，proteinG通常情況下在低pH環(huán)境下與抗體結(jié)合力較強(qiáng)，不過高pH環(huán)境下小鼠IgGl和兔、人的抗體在仍可以與proteinG結(jié)合。適用于：小鼠IgGl、大鼠抗體、猴抗體、兔抗體、?？贵w、山羊抗體、馬抗體、綿羊抗體;基本操作：1?過濾、離心腹水或者培養(yǎng)上清得上清；2?調(diào)節(jié)pH到5.0：腹水以10倍體積0.1M醋酸鈉(pH5.0)稀釋、培養(yǎng)上清以2倍體積0.1M醋酸鈉(pH5.0)稀釋；過proteinG柱，0.1M醋酸鈉(pH5.0)洗雜；4.0.1M甘氨酸(pH2.8)洗脫抗體，并注意收集管內(nèi)需加入Tris緩沖液中和滴下的抗體溶液5?用PBS透析；6.電泳檢測分子量大小，分光光度法測定抗體濃度?？乖H和層析法抗原親和純化一般用在多抗的純化上，這種純化方式去掉了血清中那些非特異性結(jié)合的抗體分子，得到的抗體分子基本上都是能特異性與抗原結(jié)合的?？乖H和純化需要先將抗原偶聯(lián)到柱料上，然后通過親和層析的方式去除非特異性抗體及雜蛋白，得到特異性抗體。通常采用的柱料為溴化氫預(yù)處理和N-羥基琥珀酰亞胺預(yù)處理瓊脂糖凝膠柱料，前者適合偶聯(lián)大分子，后者適合偶聯(lián)小分子物質(zhì)，在實(shí)際操作中還是需要根據(jù)情況進(jìn)行選擇。適用于：多抗抗體的純化，對抗體亞型無限制偶聯(lián)基本操作：1.抗原用0.1MNaHC03偶聯(lián)緩沖液(含0.5MNaCl,pH8.3)溶解；2?用1mM稀鹽酸洗滌柱料；3?混合抗原和柱料，在室溫混懸1h或者4°C混懸過夜；用偶聯(lián)緩沖液洗滌偶聯(lián)的柱料去掉未偶聯(lián)抗原；5?用0.1MTris(pH8.0)或1M乙醇胺(pH8.0)處理偶聯(lián)柱料2h以封閉未偶聯(lián)位點(diǎn)；6.依次用0.1M醋酸鈉緩沖液(含0.5MNaCl，pH4.0)和0.1MTris(含0.5MNaCl，pH8.0)洗滌偶聯(lián)柱料五次，重復(fù)此操作三遍。純化基本操作：1.過濾、離心腹水或者培養(yǎng)上清得上清；2.0.01MPBS(pH7.4)平衡偶聯(lián)柱料；3?抗體樣品過柱，0.01MPBS(pH7.4)洗