茄子smnac1基因克隆及表達(dá)分析

茄子smnac1基因克隆及表達(dá)分析

nac（nam、ataf和cuc）是高等植物獨(dú)特的數(shù)量多的轉(zhuǎn)移因素。每個(gè)n端都包含大約150個(gè)氨基酸殘基的保護(hù)序列，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、器官建設(shè)、基質(zhì)處理和質(zhì)量改進(jìn)方面發(fā)揮著重要作用（邵鳳霞等，2008）。作為當(dāng)前植物基因功能和網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)研究的熱點(diǎn)（zhangetal.，2009）。第一個(gè)NAC基因NAM是Souer等在1996年從矮牽牛中克隆到的(Soueretal.,1996),隨后1997年Aida等(1997)在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了NAM、CUC2和ATAF1/2等3種基因,CUC2功能類似于NAM,與植物的發(fā)育相關(guān);ATAF1/2的功能與植物逆境應(yīng)答相關(guān)。目前研究表明:NAC轉(zhuǎn)錄因子在水稻基因組中有151個(gè)成員,煙草(Rushtonetal.,2008)和大豆(Leetal.,2011)中均有152個(gè),擬南芥中有117個(gè)(邢國(guó)芳等,2012)。李雪林等(2010)根據(jù)水稻的SNAC1是抗逆性轉(zhuǎn)錄因子(Huetal.,2006),且在非生物逆境脅迫(干旱、鹽漬)下SNAC1的表達(dá)可以提高抗逆性,將其導(dǎo)入棉花后通過NaCl脅迫篩選出了棉花轉(zhuǎn)化體系。李鵬(2011)研究了棉花中多種NAC基因及其受各種脅迫時(shí)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)GhNAC1在棉花纖維中特異表達(dá),其它NAC轉(zhuǎn)錄因子在各個(gè)組織中均有表達(dá),且GhNAC12明顯受低溫脅迫的誘導(dǎo),GhNAC20明顯受低溫、高鹽和PEG處理誘導(dǎo),GhNAC16主要對(duì)高鹽處理敏感。玉米ZmNAC1可以被低溫、PEG、高鹽和ABA誘導(dǎo)(柳展基等,2009)。細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌侵染辣椒后CaNAC1被快速誘導(dǎo),而在非寄主病菌侵染與抗病信號(hào)分子SA和ET處理辣椒后CaNAC1的誘導(dǎo)表達(dá)也很強(qiáng)烈(Ohetal.,2005)。在中國(guó)北方地區(qū),設(shè)施栽培中的低溫弱光是生產(chǎn)中最大的限制因素(閆世江等,2010),土壤次生鹽漬化也較為嚴(yán)重(史慶華等,2004;張海軍等,2013)。茄子(SolanummelongenaL.,2n=2x=24)是設(shè)施栽培的主要蔬菜,目前關(guān)于茄子耐寒性(高志奎等,2000;任國(guó)三等,2007;王鋒,2008)、耐鹽性(吳雪霞等,2010,2011)已有一些報(bào)道,但主要是研究其對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育過程中生理指標(biāo)的影響,而有關(guān)茄子抗逆性基因分子育種的研究較少。作者從茄子中分離鑒定出NAC1轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng),對(duì)其在逆境脅迫下時(shí)空表達(dá)模式做出初步分析,以期為茄子抗逆性分子育種奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1種子處理與生物量的制備選用北京農(nóng)學(xué)院蔬菜育種課題組選育茄子品系ETC01,于2012年7月中旬播種于塑料大棚,待幼苗長(zhǎng)出2~3片真葉時(shí)摘取所有幼苗葉片,混合后每份1g,用錫紙包成若干份,液氮速凍,置于–80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?013年6月中旬將茄子種子播種于直徑15cm的營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi),營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)為草炭︰蛭石=1︰1(體積比)。營(yíng)養(yǎng)缽放置于北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng),待幼苗長(zhǎng)到2~3片真葉時(shí)進(jìn)行不同因素處理。(1)配制濃度50mg·L-1GA溶液,每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中加入200mL;(2)低溫4℃處理,每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中加入200mL蒸餾水后將整個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽置于4℃的培養(yǎng)箱中;(3)配制濃度為20g·L-1的NaCl溶液,每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中加入200mL。每個(gè)因素處理3個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽(每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽20~25株幼苗),在0~12h內(nèi)定時(shí)取各處理的根、莖、葉樣品,液氮速凍,置于–80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。各處理均設(shè)加入200mL蒸餾水的1個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽(20~25株幼苗)作為處理0h的對(duì)照。1.2ssr-pcr檢測(cè)pus1的表達(dá)采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)提取茄子總RNA,用DNaseⅠ(TaKaRa)去除總RNA中基因組DNA的污染,用RW1(博邁德)去除總RNA中的蛋白污染,最后用Thermo公司的NANODROP2000檢測(cè)其濃度并采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。以提取的總RNA為模板合成cDNA,cDNA合成體系的總體積為20μL,反應(yīng)過程為:總RNA和10μmol·L-1Oligo(dT)18混合液于70℃水浴10min;然后加入ReverseTranscriptaseM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U·μL-1)、dNTP(10mmol·L-1)、RNaseInhibitor(40U·μL-1)及滅菌的雙蒸水,置于42℃保溫60min,后于70℃變性15min,最后存于–20℃冰箱作為基因擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timequantitativePCR,RT-qPCR)的模板備用。在NCBI中搜索,根據(jù)GenBank中已公布的辣椒NAC(AY714222)、甘藍(lán)型油菜NAC1(AY245879)、番茄NAC(AY573802)、番茄NAC1(NP_001234482.1)設(shè)計(jì)兼并引物擴(kuò)增SmNAC1的保守區(qū)。上游S1:CAYCCDACKGAYGAAGA,下游A1:TTCTTSTTGTADATTCGACA。采用Clontech的SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit分別克隆SmNAC1的3′端和5′端序列,用PrimerPrimier5.0設(shè)計(jì)特異引物3′S:GCTGGAAAAGCACCAAGAGGAAT和5′A:GGTTCCTGCTGCTCGGTTCGGC;UPM通用引物L(fēng)ong:5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′,Short:5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′,由RACE擴(kuò)增試劑盒提供。94℃預(yù)變性4min;94℃30s,72℃3min,5個(gè)循環(huán);94℃30s,70℃30s,72℃3min,5個(gè)循環(huán);94℃30s,68℃30s,72℃3min,25個(gè)循環(huán);72℃延伸10min;4℃保存。利用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)將擴(kuò)增產(chǎn)物回收,凝膠電泳檢測(cè)后,用北京全式金生物技術(shù)公司pEASY-T3CloningKit連接,轉(zhuǎn)化于Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞,藍(lán)白斑篩選,經(jīng)菌液PCR初步鑒定后送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。最后根據(jù)DNAMAN軟件拼接序列獲得茄子SmNAC1全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)拼接出的序列利用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)特異性引物QS:AAAATAAACAGCGAAGAGAGA;QA:CTACACCAAAAAACCAAGAAA擴(kuò)增SmNAC1全長(zhǎng),同樣將擴(kuò)增產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化、篩選后送測(cè)序。1.3熒光定量pcr方法采用SYBRGreen熒光染料法,用CFX96(Bio-Rad)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)SmNAC1在不同處理下的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析(Ficko&Cernelc,2005)。擴(kuò)增目標(biāo)基因SmNAC1的上游引物SmNAC1-S:CTTGAGGCTTGATGAATGG和下游引物SmNAC1-A:GTGGTAATTGTGTGGGTAAA。茄子內(nèi)參基因(宋琴,2011)Smβ-ACTIN(GenBank登錄號(hào):GU984779)的引物Smβ-S:GTCGGAATGGGACAGAAGG;Smβ-A:CAGTCAGGAGAACAGGGTG。按照寶生物公司試劑盒RealMasterMix(SYBRGreen)PCR操作步驟進(jìn)行,將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA分別進(jìn)行梯度稀釋(1、1︰10、1︰100、1︰1000、1︰100000)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),繪制相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)樣cDNA和待測(cè)樣均設(shè)3次重復(fù)。RT-qPCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20μL,包括10μLRealMasterMix混合液、2μLcDNA、0.5μLSmNAC1-F(10μmol·L-1)、0.5μLSmNAC1-R(10μmol·L-1)、7μLddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性2min,94℃變性20s,53℃退火25s,72℃延伸20s,每次循環(huán)第3步進(jìn)行熒光采集,40次循環(huán)。內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20μL:10μLRealMasterMix混合液、2μLcDNA、0.5μLSmβ-S(10μmol·L-1)、0.5μLSmβ-A(10μmol·L-1)、7μLddH2O。其反應(yīng)程序與SmNAC1的反應(yīng)程序相同。2結(jié)果與分析2.1承擔(dān)smnac1的基因?qū)U(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行回收、克隆、鑒定后測(cè)序,得到長(zhǎng)426bp的中間序列,Blast在線對(duì)比后初步證實(shí)是NAC基因家族,含有NAC家族保守結(jié)構(gòu)域。根據(jù)上述保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物,最終獲得794bp長(zhǎng)的3′端cDNA片段序列(圖1,a)、長(zhǎng)396bp的5′端cDNA片段(圖1,b)。利用引物QS和QA特異性擴(kuò)增出茄子SmNAC1全長(zhǎng)基因(圖1,c),測(cè)序結(jié)果顯示cDNA全長(zhǎng)序列為1279bp,NCBI在線分析同源性后,命名該基因?yàn)镾mNAC1(登錄號(hào):KF668813)。該基因含有1個(gè)編碼302個(gè)氨基酸的完整開放閱讀框,序列如圖2,起始密碼子ATG位于124bp,終止子TAG位于1032bp處。利用DNAMAN推測(cè)氨基酸序列與其他物種NAC家族序列進(jìn)行多重序列比對(duì)(圖3):茄子SmNAC1含有NAC家族共有特點(diǎn),即N端都包含一段保守的氨基酸序列,約150個(gè)氨基酸殘基,保守域包含A、B、C、D、E等5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。2.2蛋白及其細(xì)胞結(jié)構(gòu)Protparam在線分析顯示:茄子SmNAC1蛋白由20種基本的氨基酸組成,其分子式為C1570H2376N430O461S12,其中含量最高的氨基酸是Lys(7.6%)、Pro(7.6%),含量最低的氨基酸是Cys(1.3%),酸性氨基酸(Asp+Glu)總數(shù)為38個(gè),堿性氨基酸(Arg+Lys)總數(shù)為40個(gè),預(yù)測(cè)相對(duì)分子量約為35.04kD,理論等電點(diǎn)為8.18,總平均親水性(GRAVY)為–0.858,不穩(wěn)定指數(shù)37.02,推測(cè)其屬于穩(wěn)定蛋白。利用NPSA中的MLRC方法在線(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat)預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu):SmNAC1蛋白包含有63處α–螺旋(Alphahelix),占20.86%,41處延伸鏈(Extendedstrand),占13.58%;198處無規(guī)則卷曲(Randomcoil),占65.56%。運(yùn)用TMHMMServerv.2.0預(yù)測(cè)此蛋白無跨膜區(qū)域,PSORTWWWServer中PSORTPrediction工具預(yù)測(cè)細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到其同源模型,利用網(wǎng)站Expasy中SwissModel程序同源建模,推測(cè)蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型如圖4。2.3不同的同源性adq將SmNAC1蛋白序列通過NCBI中BLAST在線分析同源性,結(jié)果表明SmNAC1與番茄NAC1(NP_001234482.1)、馬鈴薯(CAC42087.1)、番茄NAC2(ADL60119.1)、甜椒(AAW48094.1)、煙草(ADQ08688.1)的同源性分別為90%、90%、89%、84%和82%。進(jìn)一步通過DNAMAN軟件將SmNAC1與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)登錄的14種NAC氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5),可見茄子SmNAC1與番茄、馬鈴薯、煙草親緣關(guān)系最近,與擬南芥ATAF2在進(jìn)化上有相同的起源,與矮牽牛、擬南芥CUC2、CUC1親緣關(guān)系較遠(yuǎn),推測(cè)茄子SmNAC1同樣具有ATAF2與植物逆境應(yīng)答相關(guān)的功能。2.4現(xiàn)實(shí)脅迫下子根、莖、葉中smnac1的表達(dá)通過RT-qPCR對(duì)內(nèi)參基因引物(Smβ-S、Smβ-A)和SmNAC1基因特異性引物(SmNAC1-S、SmNAC1-A)進(jìn)行鑒定,熔點(diǎn)曲線圖顯示內(nèi)參基因和SmNAC均只有1個(gè)峰,Tm值分別為82℃和76℃,表明內(nèi)參基因和SmNAC1所用引物都具有高度特異性,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)分別為90.8%和0.997;SmNAC1的擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)分別為112.5%和0.997,表明試驗(yàn)具有較高的重復(fù)性和擴(kuò)增效率。最后將熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)均是目的片段,無引物二聚體。用50mg·L-1的GA處理茄子幼苗,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)根、莖、葉中SmNAC1的相對(duì)表達(dá)量(圖6)可見:隨著時(shí)間的變化SmNAC1在根、莖、葉中均有表達(dá),同時(shí)在短時(shí)間內(nèi)表達(dá)量都上升達(dá)到最大值,處理后0.5h,在根和莖中的表達(dá)量與0h時(shí)相比,大約分別增長(zhǎng)4倍和8倍,隨后下降到較低水平,甚至低于0h時(shí)表達(dá)量后又有所恢復(fù);而葉片中在處理1h時(shí)達(dá)到最高,與0h時(shí)相比約為其2倍,整體表達(dá)量隨時(shí)間變化波動(dòng)趨勢(shì)較小,約在0.8~1.5間波動(dòng)。4℃低溫脅迫下,SmNAC1在根、莖、葉中都有表達(dá)(圖7);0.5h時(shí)根中的相對(duì)表達(dá)量下降到最低,莖和葉中都較0h升高;整體上都隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,說明在不同器官中低溫脅迫處理對(duì)SmNAC1的表達(dá)都有一定的誘導(dǎo)作用,如在根和葉片中,脅迫9h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值,在莖中處理6h時(shí)表達(dá)量水平最高。由圖8可知,在20g·L-1的NaCl脅迫下,茄子根、莖、葉中SmNAC1都有表達(dá),根中的表達(dá)量變化較大,莖和葉中波動(dòng)較平緩。在根中處理1h時(shí)SmNAC1的相對(duì)表達(dá)量由0h的0.95達(dá)到峰值4.26,可見SmNAC1在根中短時(shí)間迅速的誘導(dǎo)表達(dá),隨后處理時(shí)間延長(zhǎng)其相對(duì)表達(dá)量降低;在莖中處理1h時(shí)相對(duì)表達(dá)量有所升高,6h時(shí)達(dá)到最大值1.95,隨后降低;在葉片中9h時(shí)達(dá)最大值1.32,其整體在0.59~1.32范圍波動(dòng)。由上述結(jié)果可見:在茄子根、莖、葉中SmNAC1均能表達(dá),說明此基因編碼的蛋白是一種在茄子根、莖、葉各器官普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子;外源GA和非生物脅迫處理后表達(dá)量均發(fā)生變化,基本呈先增后降的趨勢(shì),初步認(rèn)定SmNAC1是一個(gè)可誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子;而在這些不同器官中SmNAC1表達(dá)的水平不同,根中的表達(dá)水平整體相對(duì)高于莖和葉片中,顯示在根中優(yōu)勢(shì)表達(dá),而葉片中表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定,可見該轉(zhuǎn)錄因子在不同器官發(fā)育過程中所起的作用有一定差異。3擬南駁岸中smnac1的表達(dá)NAC作為植物中最大一類轉(zhuǎn)錄因子,不僅參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過程的調(diào)控、激素調(diào)控,而且在植物抗病、抗非生物脅迫應(yīng)答中也具有重要的生物調(diào)控功能。本研究中從茄子中克隆出全長(zhǎng)1279bp的SmNAC1基因,編碼含有302個(gè)氨基酸的完整開放閱讀框,含有NAC家族經(jīng)典保守區(qū)域,包括A、B、C、D、E亞結(jié)構(gòu)域,可能負(fù)責(zé)與DNA及其它蛋白結(jié)合(Ernstetal.,2004),軟件預(yù)測(cè)相對(duì)分子量約為35.04kD,理論等電點(diǎn)為8.18,推測(cè)其為穩(wěn)定蛋白。綜合氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,SmNAC1與番茄、馬鈴薯、煙草親緣關(guān)系最近,與擬南芥ATAF2在進(jìn)化上有相同的起源,可能具有ATAF2與植物逆境應(yīng)答相關(guān)的功能。有研究顯示,擬南芥中NAC1特異介導(dǎo)其側(cè)根發(fā)生過程中的生長(zhǎng)素信號(hào),表達(dá)強(qiáng)度與生長(zhǎng)素濃度、側(cè)根原基的發(fā)生量呈高度正相關(guān),并發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)上游lkb范圍內(nèi)含有3個(gè)赤霉素反應(yīng)元件(GAresponsecomplex),存在受赤霉素作用的特征(Xieetal.,2000)。煙草NAC1也在根尖、側(cè)根原基特異性表達(dá),王友華(2005)驗(yàn)證了該基因的表達(dá)受生長(zhǎng)素誘導(dǎo)并且進(jìn)一步量化了生長(zhǎng)素和赤霉素對(duì)其的