馬尾松球孢白僵菌遺傳異質(zhì)性分析

馬尾松球孢白僵菌遺傳異質(zhì)性分析

森林是陸地生態(tài)的主體，根據(jù)生物多樣性綜合處理原則，以病蟲害防治為重點(diǎn)的持續(xù)森林病蟲害控制措施，是保持森林健康并實(shí)現(xiàn)森林可持續(xù)發(fā)展的一項(xiàng)重要任務(wù)。在過去40年中，中國大力推廣昆蟲綠生菌（以下簡稱白僵尸），防治重要的森林害蟲和松茸毛蟲，并取得了輝煌的成績。蟲生真菌是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組分.林相復(fù)雜的天然闊葉林中蟲生真菌群落多樣性極其豐富,結(jié)構(gòu)也非常復(fù)雜.在皖西大別山區(qū)的天然闊葉林中,由50多種蟲生真菌組成的群落的優(yōu)勢(shì)種為粉棒束孢(Isariafarinosa),其相對(duì)多度約26.96%;其次是細(xì)腳棒束孢(IsariaTenuipes)和下垂蟲草(Cordycepsnutans),而白僵菌只有10.03%.在皖南宣城市麻姑山林相單純的馬尾松純林中,蟲生真菌群落只包括14個(gè)物種,白僵菌的相對(duì)多度(36.10%)僅次于環(huán)鏈棒束孢(Isariacateniannulata)而居第二;而在直線距離僅千米的宣城敬亭山的馬尾松純林中,白僵菌在4種蟲生真菌的611個(gè)菌株中相對(duì)多度更是多達(dá)54.20%.因此,白僵菌是馬尾松純林中的重要優(yōu)勢(shì)蟲生真菌,對(duì)于松林蟲害的自然控制起著重要作用.白僵菌的自然種群中存在較大的異質(zhì)性和較高的遺傳多樣性,森林中的白僵菌多為異質(zhì)種群.由于不同菌株對(duì)寄主昆蟲的毒力和侵染力都存在較大差異,不同的種群結(jié)構(gòu)可能對(duì)森林蟲害的持續(xù)控制起著不同作用.然而,過去的研究存在著樣本少、來源分散、種群過大、研究手段不夠精確等缺陷,且多數(shù)研究以來自全球不同國家的菌株作為一個(gè)種群,因此局部小面積生態(tài)系統(tǒng)中球孢白僵菌異質(zhì)性的研究更具有現(xiàn)實(shí)意義.簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性(ISSR,由Zietkiewicz等創(chuàng)建)分子標(biāo)記,由于其引物序列較長,退火溫度高,具有更高的重復(fù)性,且操作簡單,已被廣泛用于檢測(cè)真菌的種內(nèi)遺傳變異.本研究應(yīng)用該技術(shù),分析了分離自小范圍內(nèi)馬尾松人工純林中的白僵菌,了解不同種群間遺傳多樣性、遺傳分化以及優(yōu)勢(shì)性和基因流,旨在更好地了解該菌對(duì)森林中蟲生真菌穩(wěn)定性的影響以及對(duì)生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能和效益的作用.1材料和方法1.1真菌蟲株鑒定2007年3月至2008年1月在安徽省宣州市麻姑山林場(chǎng)的一片約1800hm2、25年生馬尾松純林隨機(jī)采集感染真菌蟲尸,經(jīng)分離、純化,共有111株被鑒定為白僵菌,現(xiàn)保存于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.菌株信息如表1所示.1.2培養(yǎng)基的制備將供試菌株接種到加鋪玻璃紙的SDAY培養(yǎng)基上.置于光照培養(yǎng)箱中(25±1)℃培養(yǎng)6d左右.待大量產(chǎn)生菌絲后,從玻璃紙上剝離菌體,凍干菌絲備用.1.3提取dna和依斯r索引物質(zhì)參照朱衡等方法提取菌體總DNA,用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量.參考李旻等和余艷等,選出合適的引物序列(表2).1.4pcr擴(kuò)增及pcr擴(kuò)增ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)在FlexigenePCR儀上進(jìn)行.反應(yīng)體系(15μl)如下:1.5μl10×PCRBuffer(緩沖液),0.25μldNTPs,0.6μl引物,0.5UTaqDNApolymerase和20ng模板DNA.PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性2min,接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán):94℃變性45s,48℃～54℃復(fù)性45s,72℃延伸1.5min.循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min.PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離,EB染色后于GIS-2008凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)拍照.用AlphaEaseFC軟件分析.1.5白陷菌種群分類將電泳圖譜利用BandScan5.0軟件進(jìn)行電泳條帶遷移率分析,把同一遷移率的條帶視為公共帶,其余為特異帶,表示有多態(tài)性.分別記為“1”(代表顯性基因)和“0”(代表隱性基因),把遷移率數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成0、1矩陣.按不同月份和不同寄主進(jìn)行分類分析白僵菌種群的相關(guān)參數(shù).1.5.1多態(tài)位pcr的比率多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPL)為所有檢測(cè)到的位點(diǎn)中多態(tài)位點(diǎn)所占的比率.計(jì)算公式為:ΡΡL=多態(tài)位點(diǎn)數(shù)檢測(cè)到的位點(diǎn)總數(shù)×100%PPL=多態(tài)位點(diǎn)數(shù)檢測(cè)到的位點(diǎn)總數(shù)×100%利用此公式分別計(jì)算不同月份和不同寄主的多態(tài)位點(diǎn)百分率,并進(jìn)行比較分析.1.5.2物種均勻度指數(shù)Shannon信息多樣性指數(shù)源于信息理論,指數(shù)越高,群落所含的信息量越大,此外還反映物種的均勻度.其算式為:I=-∑Pilog2Pi式中:Pi為某一擴(kuò)增帶出現(xiàn)的頻率.1.5.3位前兩位雜合度平均雜合度指各亞種群在某微衛(wèi)星位點(diǎn)平均雜合子的比例.假設(shè)一個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)上n個(gè)等位基因的頻率分別為P1、P2…Pn,則j=m∑i=1pi2Ηe=1-m∑i=1pi2J=ΙLm∑i=1jiΗ=1-J=1-ΙLm∑i=1ji式中:j為位點(diǎn)純合度;He為位點(diǎn)雜合度;J為平均位點(diǎn)純合度;H為平均位點(diǎn)雜合度;L為位點(diǎn)數(shù);m為某位點(diǎn)的等位基因數(shù);Pi為某位點(diǎn)第i個(gè)等位基因的頻率.1.5.4有效等位基因數(shù)ni實(shí)際觀察等位基因數(shù)為種群在該位點(diǎn)所實(shí)際測(cè)到的等位基因數(shù)目,有效等位基因數(shù)(Ne)是位點(diǎn)純合度的倒數(shù),反映了基因間的相互影響,也可作為遺傳變異的一個(gè)測(cè)度.Νe=1/j=1/m∑i=1pi2=1(1-Ηe)1.5.5種群總雜合度Nm=1/4(1/Gst-1)式中:HT為種群總雜合度;Hs為亞種群雜合度,即各亞種群平均雜合度.Gst越高,Hs/HT值就越小,表明亞種群遺傳分化對(duì)種群總遺傳分化貢獻(xiàn)越小.2結(jié)果與分析2.1引物篩選及其擴(kuò)增的電泳條帶對(duì)所合成的ISSR引物進(jìn)行篩選,選擇了擴(kuò)增結(jié)果較穩(wěn)定、多態(tài)性較好的7個(gè)引物進(jìn)行分析.ISSR-PCR所確定的7個(gè)引物總位點(diǎn)數(shù)58條,總的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)54條,總的多態(tài)位點(diǎn)比率為93.10%,每個(gè)引物擴(kuò)增的DNA帶的數(shù)量在5～12條,平均多態(tài)位點(diǎn)7.3條.圖1為引物P11對(duì)部分(35株)白僵菌菌株擴(kuò)增的電泳條帶.2.2白僵尸遺傳多態(tài)位點(diǎn)分析2.2.1各月各月各月各月的多態(tài)位點(diǎn)比率從表3可知,不同月份種群的多態(tài)位點(diǎn)比率在70.27%～98.21%,其各月的多態(tài)位點(diǎn)比率按大小排列:2007年6月>2007年9月>2007年5月>2007年7月>2007年8月>2007年11月>2008年1月>2007年3月.2.2.2黃一般連鎖目昆蟲多態(tài)性分布不積極,2從表4可以看出,不同寄主昆蟲的白僵菌亞種群多態(tài)位點(diǎn)比率都較大.其中分離自鞘翅目昆蟲的亞種群最高(93.10%),可能是由于該目昆蟲中白僵菌寄主的種類和數(shù)量豐富所致.寄生直翅目和同翅目昆蟲的白僵菌都只有2株,其擴(kuò)增條帶較少.按不同寄主昆蟲分成不同的亞種群,菌株數(shù)較多的多態(tài)位點(diǎn)比率也較大,其中,鞘翅目(93.10%)>鱗翅目(88.46%)>半翅目(88.00%)>雙翅目(81.58%)>膜翅目(79.17%)>直翅目、同翅目.2.3白僵尸群體的遺傳異質(zhì)性2.3.1亞種群間的遺傳分化和多樣性分析為分析白僵菌種群內(nèi)的遺傳異質(zhì)性,采用Popgen32軟件中的Shannon指數(shù)和Nei指數(shù)分別估算種群的遺傳分化和遺傳變異.從顯示不同月份遺傳變異數(shù)據(jù)的表5可以看出,2007年6月等位基因數(shù)(Na)最高,這一結(jié)果與2007年6月的多態(tài)位點(diǎn)比率的結(jié)論一致.而有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon指數(shù)(I)和Nei基因多樣性指數(shù)(He)最高的月份出現(xiàn)在2007年9月,這說明2007年9月白僵菌的遺傳異質(zhì)性比其他各月份高.這與種群的多態(tài)位點(diǎn)比率10月最高的結(jié)果略有差異.按不同月份劃分亞種群,亞種群內(nèi)的基因多樣性遠(yuǎn)大于亞種群間的基因多樣性(表6),表明遺傳變異主要存在于亞種群內(nèi).亞種群間的基因分化系數(shù)(Gst)達(dá)0.2269,說明在整個(gè)種群有77.31%的遺傳變異存在于亞種群內(nèi),而僅有22.69%的遺傳變異存在于亞種群間,按照Wright的標(biāo)準(zhǔn),亞種群內(nèi)發(fā)生了高度的遺傳分化(0.25>Gst>0.15);這種分化是由于亞種群內(nèi)基因流較弱(Nm=0.8518<1),遺傳交換較少造成的(表5).表明白僵菌種群的遺傳異質(zhì)性隨月份而發(fā)生的變化主要是由某一月份內(nèi)存在的遺傳異質(zhì)性形成,由月份轉(zhuǎn)換而垂直發(fā)生的遺傳飄變則很少.2.3.2鹽堿土和2007年7月和2007年7月的遺傳距離是一個(gè)時(shí)間表7表明,不同月份亞種群間的遺傳一致度在0.8222～0.9600,相對(duì)較小.按月份劃分的8個(gè)亞種群遺傳距離在0.0408～0.1958,2007年5、7、8月3個(gè)亞種群間的遺傳距離較小,遺傳關(guān)系很近.遺傳距離最小的是2007年5月和2007年7月,為0.0408;遺傳距離最大的月份出現(xiàn)在2007年3月和2008年1月,為0.1958.根據(jù)不同月份亞種群的遺傳距離用UPGMA法基于Nei指數(shù)進(jìn)行無加權(quán)計(jì)算,獲得白僵菌各月份的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2).從圖中可以看出,按月份分成的8個(gè)亞種群被劃分為3組,其中2007年3月和11月亞種群聚在一起,2007年5、6、7、8月聚為一類,2007年9月和2008年1月聚成一類.從該樹狀圖可以看出,各個(gè)亞種群的遺傳關(guān)系與不同月份的溫度相關(guān)性明顯,即溫差不大的月份所采集的菌株遺傳距離不大,聚為一類.2.4白僵尸群落的主異質(zhì)性2.4.1物種多樣性分析將菌株按不同寄主來源分成7個(gè)亞種群,分析白僵菌種群的遺傳變異.應(yīng)用Popgen32軟件中Shannon指數(shù)和Nei指數(shù)分別估算種群的遺傳分化和遺傳變異.Nei基因多樣性指數(shù)(He)為0.2623,Shannon指數(shù)(I)為0.3884.從各個(gè)亞種群來看,寄主為鱗翅目昆蟲的白僵菌的He值(0.3423)最高,I值為0.5147,而寄主為同翅目和雙翅目的白僵菌He值(0.1897)最低,I值為0.2629.從表8可以看出,不同寄主的基因多樣性指數(shù)和Shannon指數(shù)差異較大,以鱗翅目最大,采集菌株數(shù)越少的亞種群的基因多樣性指數(shù)和Shannon指數(shù)也越小.這一結(jié)論與種群的多態(tài)位點(diǎn)比率結(jié)論基本一致.2.4.2亞種群間的遺傳分化據(jù)表9可知,按不同寄主昆蟲劃分成7個(gè)亞種群,亞種群內(nèi)的基因異質(zhì)性遠(yuǎn)大于亞種群間的基因異質(zhì)性.亞種群間的基因分化系數(shù)(Gst)達(dá)0.1965,說明有80.35%的遺傳變異存在于亞種群內(nèi),而僅有19.65%的遺傳變異存在于亞種群間;不同寄主亞種群間有一定的遺傳分化,亞種群間的基因流為1.0223,僅略大于1,說明遺傳交換比較有限,因遺傳飄變而引起的遺傳分化稍有減少;高的寄主分類單元(目)的差別對(duì)白僵菌種群的遺傳分化影響極小,寄主?；灾饕w現(xiàn)在目以下的分類單元上.2.4.3不同種多克隆抗體白匹菌的遺傳聚合分析按不同寄主劃分的7個(gè)亞種群,其遺傳一致度變化較大,遺傳一致度最大的是鞘翅目亞種群和鱗翅目亞種群(0.9839),其對(duì)應(yīng)遺傳距離最小(0.0163);遺傳一致度最小的是直翅目亞種群和同翅目亞種群(0.7128),其對(duì)應(yīng)的遺傳距離最大(0.3386)(表10).其中鞘翅目、鱗翅目、半翅目、膜翅目和雙翅目亞種群白僵菌的遺傳距離很小,遺傳關(guān)系接近.根據(jù)不同寄主昆蟲的遺傳距離用UPGMA法基于Nei指數(shù)進(jìn)行無加權(quán)計(jì)算,獲得白僵菌不同寄主的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3),可將7個(gè)亞種群劃分為3組,其中鞘翅目、鱗翅目、半翅目、膜翅目和雙翅目5個(gè)亞種群聚在一起,而同翅目和直翅目亞種群各自聚為一類.2.5白穩(wěn)菌遺傳結(jié)構(gòu)測(cè)定根據(jù)白僵菌個(gè)體間的遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析,結(jié)果(圖4)顯示:所研究的111株白僵菌菌株分布比較散亂,并沒有聚集成明顯的幾個(gè)組分,而且沒有發(fā)現(xiàn)完全同質(zhì)的個(gè)體或明顯的優(yōu)勢(shì)菌株.這說明所研究的白僵菌種群遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜,存在高度的遺傳異質(zhì)性.3shrenon指數(shù)i本文利用ISSR分子標(biāo)記方法研究了人工馬尾松純林白僵菌種群的遺傳異質(zhì)性.結(jié)果表明,雖然該松林植被單調(diào)、人為干預(yù)頻繁,但白僵菌種群存在著豐富的菌株類型,呈現(xiàn)出較高的遺傳異質(zhì)性和較低的優(yōu)勢(shì)性;引起松林中昆蟲白僵病的是一個(gè)高度異質(zhì)性而優(yōu)勢(shì)性不明顯的種群.這種豐富的種群遺傳異質(zhì)性有利于種群結(jié)構(gòu)甚至群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定.但與瑯琊山的次生闊葉林和大別山的天然闊葉林相比,該林區(qū)白僵菌菌株間的遺傳距離普遍較小.按不同寄主和不同采集時(shí)間分成不同的亞種群,其多態(tài)位點(diǎn)比率(PPL)均為93.10%,不同寄主亞種群的Nei基因多樣性指數(shù)(He)值為0.2623,Shannon指數(shù)(I)值為0.3884;不同采集時(shí)間亞種群的He值為0.2552,I值為0.3825.這說明海拔較低、林農(nóng)交界、人為干擾多的丘陵崗地上的人工馬尾松純林白僵菌種群多樣性單調(diào),白僵菌的遺傳異質(zhì)性不僅低于大別山的天然闊葉林(He=0.3187),也低于瑯琊山的天然次生闊葉林(He=0.2781)(另文發(fā)表).這可能與馬尾松純林林相簡單、寄主(以松茸毒蛾主)昆蟲單一等有關(guān).本文按不同寄主和不同調(diào)查時(shí)間研究麻姑山林場(chǎng)白僵菌的遺傳分化指數(shù),發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間的該指數(shù)(0.2269)>不同寄主的該指數(shù)(0.1965),即不同月份亞種群間遺傳分化大于不同寄主亞種群間的遺傳分化.這說明在麻姑山林場(chǎng),由換季而垂直發(fā)生的遺傳飄變和基因交換很少.但不同寄主亞種群間,特別是目以下的寄主亞種群間卻存在著一定的基因交換(Nm=1.0223),從而在一定程度上影響了遺傳分化.這可能是由于自然界中白僵菌存在廣泛的寄主轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,加強(qiáng)了不同寄主白僵菌基因交換.丁德貴等在馬尾松純林生態(tài)系中發(fā)現(xiàn)的寄主轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,有助于人工施放的白僵菌菌株在林間目標(biāo)寄主缺乏時(shí),利用其他寄主將食物鏈維持下去,也促進(jìn)了不同寄主白僵菌基因的交換.趙學(xué)球等利用28SrD