昆蟲體內草魚胺和酪胺的生物合成及調控

昆蟲體內草魚胺和酪胺的生物合成及調控

眾所周知，腎上腺信號轉導路徑決定了人體生命活動中的許多生理活動。相應的神經變質（激素）、腎上腺和脫甲基腎上腺只存在于后口動物家族中。在原口動物包括昆蟲體內,與腎上腺素和去甲腎上腺素系統對應的是章魚胺(octopamine,OA)和酪胺(tyramine,TA),它們之間結構相似,并發(fā)揮著類似的生理作用(表1)。OA和TA作為神經遞質(neurotransmitter)、神經調質(neuromodulator)以及神經激素(neurohormone),控制或調控著昆蟲的很多行為和生理過程(Orchard,1982;Roeder,1999,2005;Hauseretal.,2006)。OA最早在章魚唾腺中被發(fā)現至今已近60年(ErspamerandBoretti,1951),但至今我們對其在章魚唾腺中的功能還不了解。更有趣的是,竟有4名諾貝爾獎獲得者(AxelrodJ,GreengardP,HorvitzHR和KandelER)從事關于OA的研究。他們分別在章魚胺受體(octopaminereceptors,OARs)識別、秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans體內章魚胺功能以及脊椎動物體內痕量生物胺(traceamine)探尋等相關領域開展研究(NathansonandGreengard,1973;Saavedraetal.,1974;Evans,1981;Horvitzetal.,1982;Arakawaetal.,1990;Changetal.,2000)。潘燦平等(1999,2005)曾對昆蟲體內OA的分布、生理功能以及作用機理和受體等研究進行了綜述,并設計了多種OARs的激動劑,對它們的合成和構效關系等進行了研究(潘燦平等,1998)。OA作為昆蟲體內重要的神經活性物質與昆蟲的晝夜節(jié)律、內分泌、好斗與飛行以及學習與記憶等諸多重要生理功能有關(Roeder,1999),它主要通過與其特異性受體OAR結合從而調節(jié)胞內第二信使環(huán)腺苷酸(cAMP)或鈣離子水平來發(fā)揮作用(NathansonandGreengard,1973;BlenauandBaumann,2001)。因此,對OA受體藥理學特性的研究也因其可作為殺蟲劑的潛在靶標而備受關注。TA作為神經遞質,只是在近些年才被廣泛關注。以前人們一直視其為OA的合成前體,而不把它作為獨立的神經遞質。而研究表明它不但像OA一樣可作為神經遞質、神經調質和神經激素,而且發(fā)揮著截然不同的作用(Nagayaetal.,2002;Lange,2009)。我國昆蟲學家張宗炳教授及其研究小組很早就發(fā)現,在用DDT、溴氰菊酯以及殺蟲脒處理昆蟲后,利用三套層析系統檢測技術,檢測到中毒蟲體內TA含量急劇增加,并且殺蟲脒和DDT或溴氰菊酯合用時還有增效作用(張宗炳等,1984a,1984b;唐小麗等,1987);DDT處理同時還誘導相應的酪氨酸脫羧酶活性增加(羅遠等,1985),而此酶的作用就是催化昆蟲體內的酪氨酸生成酪胺。他們還發(fā)現殺蟲脒類殺蟲劑可引起蟲體內cAMP含量的增加(馬燕和張宗炳,1989),后來證明這類殺蟲劑的作用靶標正是OA受體,而且很可能正是由于與OA受體偶聯的相應G蛋白的激活引起了下游第二信使cAMP含量的增加。Borowsky等(2001)在老鼠等哺乳動物體內中檢測到了TA,而其含量甚少故稱之為痕量生物胺(traceamines);而在昆蟲、甲殼綱和軟體動物等無脊椎動物神經組織中則含有大量的TA(RobertsonandJuorio,1976)。Saudou等(1990)首先在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中克隆到了酪胺受體(tyraminereceptor,TAR),而有趣的是,同樣的受體基因同年也在《Neuron》雜志上被報道(Arakawaetal.,1990),但它卻被命名為章魚胺受體(OAR)。直到今日有關TAR和OAR的分類問題依然困擾著從事于此領域的生物學家和藥理學家們。2009年在《Neuron》雜志上發(fā)表的TA參與秀麗隱桿線蟲C.elegans逃生反應的實驗也證明了TA不僅可作為神經調質還可作為神經遞質與特定受體結合參與逃避等應急性反應(BranickyandSchafer,2009;Pirrietal.,2009),而調控這種反應的酪胺受體類型(tyramine-gatedchloridechannels)目前在昆蟲中還未發(fā)現。盡管TA作為新的神經傳遞物質日益受到關注,但是對其受體以及受體藥理學特性的研究還是相對較少。1兩種脫羧酶法合成ta和高度自由基物體ta和其它基的植株和去甲腎上腺素pa的合成如前所述,昆蟲體內的OA和TA與脊椎動物體內的腎上腺素和去甲腎上腺素功能頗為相似,在體內也都是以酪氨酸(Tyr)為底物通過一系列酶促反應合成的(圖1)。酪氨酸可通過酪氨酸羥化酶(TH)羥基化作用生成多巴(DOPA),而酪氨酸與多巴又可分別在酪氨酸脫羧酶(TDC)和多巴脫羧酶(DDC)脫羧基作用下生成相應的TA和多巴胺(dopamine,DA),TA和多巴胺可進一步通過酪胺β-羥化酶(TβH)和多巴胺β-羥化酶(DβH)發(fā)生β-羥基化作用而生成相應的OA與去甲腎上腺素,從此可看出兩條合成途徑的相似性,去甲腎上腺素則可進一步在苯乙醇胺-N-甲基轉移酶(PNMT)作用下生成腎上腺素(Cazzamalietal.,2005;Roeder,2005;Lange,2009)。另外,如果不存在酪氨酸脫羧酶(TDC),生物體內還有一些補救途徑來完成TA和OA的合成(如圖1中虛線箭頭所示),目前還不知道這些補救途徑有何生理作用(Roeder,2005)。2ta與aa神經元的分布在昆蟲體內的許多生物胺都有著特有的分布特征,而OA和TA在昆蟲體內的分布更是有趣。因為TA一直被視為OA的合成前體,其通過TβH作用生成OA(圖1),所以OA的神經元也應該同時包含TA,因此,很有可能OA和TA被同一神經元所釋放并作為協同的神經遞質(co-transmitters)。另一方面,TA的神經元卻不一定包含OA,Downer等(1993)就通過高效液相色譜與電化學檢測(HPLC-ECD)相結合的方法,在蝗蟲Locusta的中樞神經系統(centralnervoussystem,CNS)中發(fā)現,TA的分布并不與OA相對應。而且,在CNS的不同區(qū)域以及中樞神經和骨骼肌之間,TA和OA的分布比例也各不相同。在蝗蟲的CNS中,OA的含量是TA的3～7倍,而在骨骼肌中TA的含量卻是OA的2～9倍(DoniniandLange,2004;SilvaandLange,2008)。關于OA和TA在大型昆蟲(如蝗蟲)和小型昆蟲(如果蠅)體內神經中的分布情況,Roeder等(2003)已經做了詳盡的描述。在蝗蟲中大約有100個神經元含有這些神經遞質,它們的分布與其特異的重吸收系統(章魚胺-轉運體蛋白神經元)基本上是一致的;而在果蠅成蟲的神經系統內大約有40種不同的神經元包含OA和TA,它們分布在果蠅的腦部、胸部和腹部的神經元中,奇怪的是在果蠅幼蟲腦部卻未發(fā)現具免疫活性的章魚胺神經元(Roeder,2005)。Busch等(2009)通過免疫組織化學染色等手段,成功定位了果蠅成蟲腦部27種獨特的OA神經元,根據形態(tài)和遺傳標記分布,他們發(fā)現這些OA神經元大都位于腦部的復雜結構中,有著明顯隔開的樹突和突觸前區(qū)域,而且這些樹突大都限定于大腦中的特定區(qū)域內,每個神經元的作用對象清晰而又各不相同,整個OA神經纖維網遍布于CNS內,使得它們能夠相互結合并構成整體,并被分配到不同神經中行使各自功能。近年來,對TA在昆蟲體內分布研究顯示,昆蟲腦部神經節(jié)、咽下神經節(jié)和胸腹部神經節(jié)中均有TA存在,尤其是在咽下神經節(jié)、胸部神經節(jié)以及腹部神經節(jié)這3個腹面不成對中間(ventralunpairedmedian,VUM)神經元中含量較多,這些VUM神經元連接著末梢肌肉組織對昆蟲行為有著重要影響。更有意思的是,在蝗蟲腹部第7和第8神經節(jié)中有大量對TA免疫的活性物質存在,而這些神經節(jié)與蝗蟲的輸卵管和受精囊活動有關(DoniniandLange,2004;LangeandSilva,2007;SilvaandLange,2008),而且TA還存在于昆蟲非神經組織—馬氏管中(Coleetal.,2005)。因此,TA很可能對昆蟲的交配生殖和排泄行為都有所影響?？傊?對OA和TA及其相應受體在昆蟲體內分布的研究,可幫助我們更好地了解其生理學功能。3無臟器體內的轉運體kraft在昆蟲體內,一旦OA和TA從突觸中釋放,便結合于對應的受體引起一系列生理反應,那么它們在完成自己的作用后會發(fā)生什么變化呢?OA和TA在引起突觸后細胞發(fā)生反應并產生相關信號后,它們的作用也就需要被終止,而最主要的方式就是被重吸收進入突觸前結構中。對于很多神經遞質,如OA、TA、多巴胺、5-羥色胺和組胺等生物胺來說,被神經細胞再攝取是它們主要的失活方式,而在通常情況下,這一步是通過特異的神經遞質轉運體(neurotransmittertransporters)來完成的。在被突觸釋放完成作用后,這些生物胺被存在于質膜上的轉運體蛋白移除,轉運體蛋白本身的活性的調節(jié)則主要依賴于胞內鈉離子與氯離子的濃度梯度。相比而言,人們比較清楚脊椎動物中的轉運體體系。在氨基酸組成上,它們是一些糖蛋白(glycoproteins),可能含有12個跨膜結構域(transmembranedomains),大約有50%～70%的序列相似性(Shafqatetal.,1993;Evans,2002;Malutanetal.,2002)。而在無脊椎動物體內,也已經識別出了對5-羥色胺、多巴胺、OA和TA特異的轉運體(Malutanetal.,2002;DonlyandCaveney,2005),這些無脊椎動物體內的轉運體與脊椎動物體內的轉運體有著結構和藥理特性上的相似性。Downer等(1993)首先報道了在蝗蟲神經中樞中對TA有特異性重吸收現象的證據,而直到2002年,Malutan等(2002)才在粉紋夜蛾Trichoplusiani中克隆到了新的單胺轉運體cDNA,并把它命名為OA轉運體,在昆蟲細胞系中表達顯示其對章魚胺和酪胺均有很高的親和力(affinity)。這個轉運體的獨特性還在于它對藥物的介入非常不敏感,如能夠選擇性抑制其他單胺轉運體的三環(huán)類抗抑郁藥(tricyclicantidepressants)等對其并沒有阻斷作用(Malutanetal.,2002;Gallantetal.,2003)。系統進化分析顯示,這種鱗翅目幼蟲的OA轉運體屬于一種新類型,它與無脊椎動物的DA轉運體以及脊椎動物兒茶酚胺轉運體(catecholaminetransporters)不屬于同一類(Malutanetal.,2002)。OA轉運體基因與TβH基因在神經元中是共表達的,所以它存在于所有含OA的神經元中。如前所述,這些神經元也包含TA,因此如果OA和TA都被釋放的話,OA轉運體很可能既協調對OA的攝取又參與對TA的再攝取。而奇怪的是,在黑腹果蠅D.melanogaster、岡比亞按蚊Anophelesgambiae、意大利蜜蜂Apismellifera和秀麗隱桿線蟲C.elegans的基因組中均沒有發(fā)現該類轉運體,而且黑腹果蠅中的多巴胺轉運體對OA幾乎沒有親和性(DonlyandCaveney,2005)。另外,已經在6種鱗翅類昆蟲如菜粉蝶Pierisrapae、歐洲玉米螟Ostrinianubilalis等及毛翅目、鞘翅目、直翅目、半翅目、廣翅目和網翅目中克隆到了OA/TA的轉運體基因,而在雙翅目和膜翅目昆蟲中卻沒有發(fā)現(Lange,2009)。以上研究證明,OA/TA的膜轉運體廣泛存在于很多昆蟲種類的體內,并參與到這兩種神經遞質的再攝取機制中,造成OA和TA的失活或轉移。既然OA和TA在果蠅中發(fā)揮著重要生理作用,而果蠅體內又不存在相應的轉運體,所以很可能在雙翅目和膜翅目中存在著其他的替代途徑來完成OA和TA的轉運。因此,有關OA和TA在昆蟲體內,尤其是在雙翅目和膜翅目昆蟲體內的轉運方式有待于進一步研究和探討。另外,OA和TA以及類似的生物胺類如DA等,還可被一些單胺氧化酶(monoamineoxidase,MAO)類降解或被臨近的神經膠質細胞(glialcells)吸收儲存(Roder,2005)。4自組織的生長和生理作用對OA和TA在昆蟲體內生理功能的研究一直沒有中斷過(表2)。目前,人們對OA的生理功能研究較為深入,最著名的就是它在北美螢火蟲Photinuspyralis發(fā)光器官中所起到的神經傳遞作用(Nathanson,1979)。令人驚奇的是,在果蠅體內敲除了能夠催化TA生成OA(圖1)的TβH基因后,果蠅的行為幾乎是正常的,只是雌性個體因不能正常產卵而不可育,該結果證明了OA可能參與調控輸卵管的肌肉組織(Monastiriotietal.,1996;Monastirioti,2003)。在外周神經系統中(peripheralnervoussystem,PNS),OA起著調控昆蟲飛翔肌、外周淋巴器官(如脂肪體和血淋巴)、輸卵管以及幾乎所有感覺器官的功能;而在CNS中,OA具有調控昆蟲運動、覺醒、脫敏、學習與記憶以及晝夜節(jié)律等生理活動的功能(Stern,1999;Farooquietal.,2003;Schwaerzeletal.,2003)。而且,有關OA在昆蟲的記憶力恢復、嗅覺識別、飛翔和好斗性等方面所扮演的角色也是近年來關于OA生理功能研究的熱點(HammerandMenzel,1995,1998;Roeder,1999;Farooquietal.,2003;Schwaerzeletal.,2003;Mizunamietal.,2009)(表2)。相比于OA而言,人們對TA在昆蟲體內的生理作用還不甚了解。然而近年來的研究表明,TA在生物體內發(fā)揮著自己特有的生理作用(Nagayaetal.,2002)。TA可以通過控制果蠅幼蟲骨骼肌中的中央模式發(fā)生器(centralpatterngenerator)來控制果蠅幼蟲的移動(Foxetal.,2006)。另外,它還存在于東亞飛蝗Locustamigratoria的受精囊和非神經元組織——馬氏管中,并可能參與調控其排卵、受精、排泄和遷移等諸多生理行為(Blumenthal,2003;Rogersetal.,2004;Coleetal.,2005;LangeandSilva,2007;SilvaandLange,2008;Lange,2009),TA還影響著意大利蜜蜂A.mellifera雌蜂的卵巢發(fā)育等(SasakiandHarano,2007)(表2)?？傊?昆蟲體內的OA和TA幾乎調控著昆蟲大部分的器官和生理行為,而有關OA和TA對昆蟲中樞淋巴器官(centrallymphoidorgan)和周圍淋巴器官(peripherallymphoidorgan)的調控以及對昆蟲神經、生殖、消化、內分泌乃至免疫和社會行為等諸多生理活動的影響,仍需要進一步研究與論述。5安氏原螯蝦對g蛋白偶聯受體的影響一種影響神經系統的化學物質,不管它是作為突觸間隙的神經遞質還是作為進入血液循環(huán)調控組織行為的神經激素,都需要通過細胞膜或者細胞內部的受體來完成其對細胞的影響,達到傳遞神經信號的目的。與腎上腺素和去甲腎上腺素相似,OA和TA也是通過與一系列的G蛋白偶聯受體(Gprotein-coupledreceptors,GPCRs)相作用來完成神經信號傳遞,發(fā)揮其生理作用(Roeder,2005)。由于具有開發(fā)成為新一代殺蟲劑靶標的可能性,近年來,關于它們對應受體的基因克隆及藥理學特性的研究頗多。5.1結構分類及作用途徑目前已經在多種昆蟲中克隆到了編碼OARs和TARs的cDNAs,包括黑腹果蠅D.melanogaster、意大利蜜蜂A.mellifera、美洲大蠊Periplanetaamericana以及一些蛾類,如煙草天蛾Manducasexta、煙芽夜蛾Heliothisvirescens和家蠶Bombyxmori等(Ebertetal.,1998;Blenauetal.,2000;Dacksetal.,2005;EvansandMaqueira,2005;Ohtanietal.,2006;Huangetal.,2009;Rotteetal.,2009),而這些受體通常有著雙重術語——章魚胺/酪胺受體(OA/TAreceptors)。盡管一些研究者通過體外表達實驗證實了這些受體對OA和TA的不同親和性,并據此將其命名為相應的受體(OAR或TAR),但其在昆蟲活體內的確切配體(ligand)還不明了,仍需進一步研究驗證。與之前在果蠅、蜜蜂、家蠶或者蝗蟲中克隆到的TARs基因不同,Cazzamali等(2005)從果蠅中克隆到了一個新的TAR基因,在中國倉鼠卵巢細胞(CHO)和爪蟾卵母細胞(Xenopusoocytes)中表達顯示,它對TA的特異性非常高而與其他生物胺包括OA無交叉反應。而且在岡比亞按蚊A.gambiae、意大利蜜蜂A.melliefera和赤擬谷盜Triboliumcastaneum基因組數據庫中也發(fā)現了與此受體類似的基因序列,并隨之在家蠶中克隆到了該受體,被命名為BmTAR2(Hauseretal.,2008;Huangetal.,2009)。這些結果也再次證實了TA完全可以獨立于OA而在昆蟲體內通過特異性受體發(fā)揮作用。根據已經克隆到受體的功能和藥理學性質及其與哺乳動物腎上腺受體不同亞型結構功能相似性的比較,可以將OARs和TARs各自分為兩大類共4種受體類型:α1-adrenergic-likeOARs,α-adrenergic-likeOARs,α1-adrenergic-likeTARs和α2-adrenergic-likeTARs(EvansandMaqueira,2005;Huangetal.,2009,2010)。到目前為止,在果蠅和家蠶中的這4種OARs和TARs亞型都被克隆得到并做了功能驗證,我們在二化螟Chilosuppressalis體內也克隆得到了這4種亞型,并進一步對其功能進行驗證。有關昆蟲體內OARs的研究較為廣泛,關于其作用途徑也相對了解較多。需要指出的是,有的受體可能同時扮演OARs和TARs的角色,這要看與之結合的神經激素或神經遞質類型(HannanandHall,1996;Ohtaetal.,2003;EvansandMaqueira,2005)。5.2其他生物胺受體的偶聯作用OARs和TARs被激活后會引起胞內信號分子濃度的改變,與受體作用的G蛋白(G-protein)類型不同引起的信號分子改變也不同,如:環(huán)腺苷酸(cAMP)和胞內鈣離子(Ca2+)濃度,它們的濃度可能提高或降低(Gudermannetal.,1996,1997)。一種途徑是當受體結合了能夠與質膜上腺苷酸環(huán)化酶(adenylylcyclase,AC)作用的G蛋白時(圖2),就能夠激活此酶的活性,并導致ATP生成cAMP。而cAMP濃度的提高則能夠進一步激活蛋白激酶A(proteinkinaseA,PKA),PKA又叫cAMP依賴性蛋白激酶,它能夠將ATP的磷酸基團轉移到特定蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸殘基上進行磷酸化,并調控多種分子底物的特性,包括細胞溶質蛋白、配體門控的離子通道以及一些轉錄因子如CREB,CREM和ATF-1等(DeCesareetal.,1999);另外,一些生物胺受體也有可能偶聯抑制cAMP濃度提高的G蛋白。另一種途徑則是激活的受體引起胞內Ca2+濃度的改變(圖2),與這些受體偶聯的G蛋白亞基能夠結合并激活磷脂酶C(phospholipaseC,PLC)的活性(RheeandBae,1997),而此酶則能夠水解一種膜結合底物——磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol4,5-bisphosphate),產生兩種第二信使——三磷酸肌醇(inositoltriphosphate,IP3)和二?；视?diacylglycerol,DAG),IP3能夠結合于內質網膜上的特異受體,它們是一些門控Ca2+通道,能夠使通道打開并引起胞內Ca2+庫中的Ca2+釋放到細胞質中,Ca2+通過直接控制酶或離子通道的活性在細胞許多功能中發(fā)揮著至關重要的作用。除此之外,Ca2+能夠與很多蛋白結合,如鈣調蛋白、鈣結合蛋白、鈣視網膜蛋白等,它們通過蛋白互作而起著調控許多蛋白效應器的活化。而DAG是存在于質膜上的第二信使,它能夠與Ca2+一起激活蛋白激酶C(PKC)的活性,而PKC如前所述的PKA一樣,都能夠使很多蛋白的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化,從而改變這些蛋白的功能(BlenauandBaumann,2001)(圖2)?？傊?GPCRs的激活導致了胞內各級信號濃度的改變,而且不同胞內信號途徑可能在同一個細胞中被激活,這也必將引起細胞內反應信號的放大或縮小從而達到信號傳遞的功能。另外,在果蠅中克隆到的命名為OAMB(octopaminereceptorinmushroombodies)的一種OAR,在神經和生殖系統的體外表達顯示它具有兩種異構體(isoforms),即OAMB-AS和OAMB-K3,并分別具有不同的信號轉導通路,一個是只提高胞內Ca2+濃度,另一個則既提高胞內cAMP又提高Ca2+濃度,此Ca2+主要是連接鈣調蛋白依賴型的蛋白激酶Ⅱ而并非激活PKA或PKC(Leeetal.,2009)。因此,同一個受體在不同組織或細胞類型中表達,可能會偶聯不同的信號分子,從而行使不同的功能。有的受體僅僅依靠影響cAMP或Ca2+濃度來傳遞信號,而有的受體則既影響cAMP的濃度又影響胞內Ca2+濃度,這些特性給受體研究者們帶來了驚喜,可給受體分類學者帶來了困惑。而無疑的是,對OARs和TARs的研究不僅對理解它們在昆蟲體內的生理學作用十分重要,也將為人們以其為靶標設計新殺蟲劑用于害蟲防治帶來突破(IshaayaandHorowitz,2009)。5.3其他方面的研究對于昆蟲體內OARs的藥理學性質研究較為深入(EvansandMaqueira,2005),而關于TARs的藥理學研究相對較少。有很多對OARs高度特異的激動劑(agonist)和拮抗劑(antagonist),而且已有針對OARs的殺蟲劑在生產上使用,如殺蟲脒(chlordimeform)和雙甲脒(amitraz)就是通過各自代謝體與OARs特異結合來產生殺蟲毒理作用的(Roeder,2005)。而由于一直沒有把TARs作為殺蟲劑作用靶標來開發(fā),因此除了TA之外,還沒有發(fā)現其他TARs的激動劑,唯一一個藥理學上與TARs有關的復合物是對脊椎動物α2-腎上腺素受體(α2-adrenergicreceptors)有拮抗作用的育亨賓(yohimbine)——一種從育亨賓樹上得到的生物堿,它對昆蟲TARs同樣有著高度特異的拮抗作用。由于缺少相關藥理學實驗工具,這對我們研究昆蟲體內酪胺受體介導的神經傳遞帶來了很大不便(Lange,2009)。目前,這些受體在細胞體外表達的藥理學實驗中,大多使用那些在脊椎動物體內對腎上腺素受體藥理學性質比較清楚的化學劑,如OA、β-苯基乙胺(β-phenylethylamine)、色胺(t