第二十章比色法和分光光度法

第二十章比色法和分光光度法第1頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.1概述20.1.1光度分析法的特點(diǎn)20.1.2物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收第2頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.1.1光度分析法的特點(diǎn)

有色物質(zhì)顏色的深淺和濃度有關(guān)，利用比較溶液顏色深淺來(lái)測(cè)定含量的分析方法稱為比色分析法。目視比色稱為比色法；利用分光光度計(jì)測(cè)試，稱為分光光度法。光度分析法特點(diǎn)：(1)具有較高的靈敏度。一般物質(zhì)可測(cè)到10-3~10-6mol

L-1

(2)有一定的準(zhǔn)確度。相對(duì)誤差為2%~5%(3)操作簡(jiǎn)便、快速，選擇性好，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單。(4)應(yīng)用廣泛。第3頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.1.2物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收

在可見光區(qū)(400~760nm)不同波長(zhǎng)的光具有不同的顏色。溶液呈現(xiàn)一定的顏色是對(duì)光選擇性吸收的結(jié)果。當(dāng)一束白光通過一有色溶液時(shí)，某些波長(zhǎng)的光被溶液吸收，另一些波長(zhǎng)的光則透過，溶液的顏色由透過光決定。透射光與吸收光又可組成白光，這兩種光稱為互補(bǔ)色光。

第4頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月如CuSO4溶液呈藍(lán)色就是吸收了白光中黃光。第5頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

如果將不同波長(zhǎng)的光通過一固定濃度和厚度的有色溶液，測(cè)量每一波長(zhǎng)下有色溶液對(duì)光的吸收程度（吸光度A），然后以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得一曲線，稱吸收曲線。第6頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三條曲線，代表同一被測(cè)物質(zhì)含量由高到低的吸收曲線。鄰二氮雜菲亞鐵溶液的吸收曲線第7頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）同一種物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸光度不同。吸光度最大處對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng)λmax（2）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似，λmax不變。而對(duì)于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同。（3）在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測(cè)定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長(zhǎng)的重要依據(jù)。第8頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.2光吸收的基本吸收定律20.2.1朗伯-比爾定律20.2.2吸光度的加和性20.2.3對(duì)朗伯-比爾定律的偏離第9頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.2.1朗伯-比爾定律

當(dāng)一束平行的單色光通過均勻、透明的有色溶液時(shí)，如溶液的濃度越大、液層厚度越大，則光強(qiáng)度的減弱越顯著。I0：入射光強(qiáng)度；It：透射光強(qiáng)度

“A”稱為吸光度，量綱為1。溶液對(duì)光的吸收程度越大，則透射光強(qiáng)度越小，A越大。第10頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月吸光度測(cè)量中，也用透光度T表示透過光強(qiáng)度越大，T值越大。第11頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月b：液層的厚度cm；c：溶液的濃度g·L-1K：吸光系數(shù)

L·g-1·cm-1如“c”的單位：mol·L-1，此時(shí)的吸光系數(shù)稱為摩爾吸光系數(shù)k

k：摩爾吸光系數(shù)L

·mol-1·

cm-1

式中M為摩爾質(zhì)量

第12頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月k是吸光物質(zhì)在一定波長(zhǎng)和溶劑條件下的特征常數(shù)。

在溫度和波長(zhǎng)等條件一定時(shí)，k僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測(cè)物濃度無(wú)關(guān)。

k是吸光物質(zhì)吸光能力的量度，k值越大，光度法測(cè)定該物質(zhì)的靈敏度越高。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算時(shí)，常以被測(cè)物質(zhì)的總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，這樣計(jì)算的k值實(shí)際上是表觀摩爾吸光系數(shù)。第13頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

分光光度分析的靈敏度還可以用桑德爾靈敏度S表示。S是指當(dāng)儀器的檢測(cè)極限為A=0.001時(shí)，單位截面積光程內(nèi)所能檢測(cè)出來(lái)的吸光物質(zhì)的最低含量，其單位為μg·cm-2。

S=M/k第14頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月例20-1：已知含F(xiàn)e2+濃度為1.0mg·L-1的溶液，用鄰二氮菲光度法測(cè)定鐵(Fe2+與鄰二氮菲反應(yīng)，生成橙紅色配合物)。使用厚度為2cm的吸收池，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)得吸光度A=0.390。計(jì)算該配合物的

摩爾吸光系數(shù)。。解：已知鐵的相對(duì)原子質(zhì)量為55.85。第15頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月例：用雙硫腙光度法測(cè)定Pb2+。Pb2+的濃度為0.08mg/50mL，用2cm比色皿在520nm下測(cè)得T=53%，求k。解：已知鉛的相對(duì)原子質(zhì)量為207.2第16頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.2.2吸光度的加和性在含有多組分的體系中，若各組分對(duì)同一波長(zhǎng)的光都有吸光作用，且各組分的吸光物質(zhì)彼此不發(fā)生作用，則測(cè)得的吸光度等于各組分的吸光度之和。

A=A1+A2+…+A3第17頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.2.3對(duì)朗伯-比爾定律的偏離1.比爾定律的局限性2.非單色入射光引起的偏離

3.由于溶液本身發(fā)生化學(xué)變化的原因引起的偏離

第18頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.比爾定律的局限性

通常在用分光光度法進(jìn)行分析時(shí)，多采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法。即固定液層厚度、入射光的波長(zhǎng)，測(cè)定一系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，此時(shí)A與c應(yīng)成直線關(guān)系。

在實(shí)際工作上，特別是在濃度較高時(shí)，常出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不為直線，即偏離了朗伯—比爾定律。第19頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

比爾定律是一個(gè)有限制性的定律，它假設(shè)入射光為單色光，吸收粒子間沒有干擾。因此僅在稀溶液中才適用。在高濃度時(shí)，由于吸光物質(zhì)微粒間相互影響，從而改變了它對(duì)光的吸收能力，使吸光度與濃度的線性關(guān)系發(fā)生偏離。第20頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.非單色光引起的偏離比爾定律假設(shè)入射光為單色光，但是目前儀器所能提供的入射光不是嚴(yán)格的單色光，是由波長(zhǎng)范圍較窄的光帶組成的復(fù)合光。

A=kbc，k在一定波長(zhǎng)下是一常數(shù)，如入射光不為單色光，則k不為常數(shù)，A與c不成直線關(guān)系。第21頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在最大吸收波長(zhǎng)附近通常有一個(gè)吸收強(qiáng)度相差較小的區(qū)域，如入射光在此范圍內(nèi)，因k變化較小，引起的偏離也較小，A與c基本上呈直線關(guān)系。

λ

Aλmax第22頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

3.由于溶液本身發(fā)生化學(xué)變化

的原因引起的偏離

由于被測(cè)物質(zhì)在溶液中發(fā)生締合、離解或溶劑化、互變異構(gòu)、配合物的逐級(jí)形成等化學(xué)因素，造成對(duì)比耳定律的偏離。

Cr2O72-+H2O2CrO42-+2H+橙色黃色

應(yīng)控制條件，使溶液中僅存在Cr2O72-或CrO42-，這樣，c與A之間才成直線第23頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.3比色法和分光光度法及其儀器20.3.1目視比色法20.3.2分光光度計(jì)的基本部件20.3.3常用的幾種分光光度計(jì)第24頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.3.1目視比色法

目視比色法是一種用眼睛辨別溶液顏色的深淺，以確定帶測(cè)組分含量的方法。常用標(biāo)準(zhǔn)系列法，在一套等體積的比色管中，加入不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入等量顯色劑及其它試劑，待測(cè)液在同樣條件下顯色。稀釋至刻度，搖勻。比較待測(cè)液和標(biāo)準(zhǔn)色階溶液的顏色深淺，確定待測(cè)液的濃度。目視比色法儀器簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，但準(zhǔn)確度較差。第25頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.3.2分光光度計(jì)的基本部件

1.光源作用：發(fā)出所需波長(zhǎng)范圍內(nèi)的連續(xù)光譜。要求具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的使用壽命?？梢姽鈪^(qū)常用鎢燈、或碘鎢燈，波長(zhǎng)范圍：320~2500nm光源單色器吸收池檢測(cè)系統(tǒng)讀數(shù)指示器第26頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.單色器

作用：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光。單色器由棱鏡和光柵等色散元件及狹縫和透鏡組成。

①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。第27頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.吸收池作用：用于盛放試樣溶液。也叫比色皿。吸收池主要有石英和玻璃兩種。在紫外區(qū)須采用石英吸收池，可見區(qū)一般用玻璃吸收池。吸收池大多是長(zhǎng)方形的，一般儀器都配有一套厚度為0.5、1、2、3cm的吸收池。吸收池放置的位置應(yīng)使透光面垂直于光束方向。第28頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.檢測(cè)系統(tǒng)作用：將光強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為電流進(jìn)行測(cè)量。光電轉(zhuǎn)換器對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光有快速靈敏的響應(yīng)，產(chǎn)生的電流應(yīng)與光電轉(zhuǎn)換器上的光強(qiáng)度成正比。常用的光電轉(zhuǎn)換器有硒光電池、光電管。5.讀數(shù)指示器作用：把光電流或放大的信號(hào)以適當(dāng)?shù)姆绞斤@示或記錄下來(lái)。第29頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.3.3常用的幾種分光光度計(jì)

72型、722型、751型等。第30頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.4顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇20.4.1對(duì)顯色反應(yīng)的要求20.4.2顯色反應(yīng)條件的選擇第31頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.4.1對(duì)顯色反應(yīng)的要求將待測(cè)組分轉(zhuǎn)化為有色化合物的反應(yīng)叫顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)有配位反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)。1.靈敏度高因?yàn)楣舛确ㄒ话阌糜跍y(cè)定微量組分含量，故通常選擇靈敏度高的顯色反應(yīng)。生成的有色化合物摩爾吸光系數(shù)大，靈敏度高，通常k值達(dá)104~105，認(rèn)為靈敏度較高。2.選擇性好即顯色劑只與一種或少數(shù)幾種物質(zhì)反應(yīng)而顯色。3.有色化合物組成固定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定4.顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收第32頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.4.2顯色反應(yīng)條件的選擇

1．顯色劑的用量

通常顯色反應(yīng)可用下式表示：M(被測(cè)離子)+HR(顯色劑)MR+H+

從平衡角度看，顯色劑過量越多，越有利于有色配合物的形成。但顯色劑過量太多，有時(shí)會(huì)引起副反應(yīng)，故有一適宜用量，通常由實(shí)驗(yàn)確定。

固定其它條件，改變顯色劑的濃度，測(cè)A，作A~c

R曲線，選擇原則：選擇曲線上平坦部分

第33頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月吸光度與顯色劑用量關(guān)系曲線cRcRcRAAA(a)適合進(jìn)行光度分析(對(duì)顯色劑濃度控制不嚴(yán)格)(b)只能選擇較窄的顯色劑濃度范圍(c)必須嚴(yán)格控制顯色劑濃度。

第34頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.酸度

酸度對(duì)顯色反應(yīng)的影響是多方面的：H+濃度大，不利于有色配合物的形成；酸度還影響有些顯色劑的顏色；某些被測(cè)組分與顯色劑能形成不同組成的配合物；金屬離子在酸度下降時(shí)會(huì)水解。

適宜的酸度范圍由實(shí)驗(yàn)確定：固定其它條件，改變pH值測(cè)A，作A~pH曲線，選擇曲線平坦部分對(duì)應(yīng)的pH值作為測(cè)量條件。第35頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月吸光度與pH關(guān)系曲線pHA第36頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3．顯色時(shí)的溫度和時(shí)間多數(shù)顯色反應(yīng)在室溫下能很快進(jìn)行，有些反應(yīng)需要加熱。多數(shù)顯色反應(yīng)須經(jīng)一定時(shí)間才能完成，有些有色物質(zhì)放置時(shí)受到空氣和光的作用，顏色會(huì)減弱。適宜顯色時(shí)間可通過實(shí)驗(yàn)確定。

第37頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月AtAt(2)(1)(1)隨著時(shí)間的增加，有色化合物的濃度增大，A增大。反應(yīng)完成后，A保持不變。(2)有色化合物性質(zhì)不太穩(wěn)定，隨著放置時(shí)間的增加，在日光，空氣的的作用下，有色化合物分解，濃度下降，A降低。第38頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.溶劑的影響許多有色配合物在水中解離度較大，而在有機(jī)溶劑中解離度較小。有些配合物易溶于有機(jī)溶劑。5.干擾物質(zhì)的影響及消除干擾離子本身有顏色或與顯色劑作用顯色等，都將干擾測(cè)定。消除干擾的方法有：(1)加掩蔽劑(2)選擇適當(dāng)?shù)娘@色條件如通過控制酸度，使干擾離子不作用(3)選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)量條件如波長(zhǎng)、參比溶液等(4)分離干擾離子第39頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.5分光光度法儀器測(cè)量誤差及其消除20.5.1入射光波長(zhǎng)的選擇20.5.2光度計(jì)讀數(shù)范圍的選擇20.5.3參比溶液的選擇20.5.4溶液濃度的測(cè)定

第40頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.5.1入射光波長(zhǎng)的選擇

入射光波長(zhǎng)應(yīng)根據(jù)吸收光譜曲線選擇。1)在一般情況下選擇最大吸收波長(zhǎng)作為入射光的波長(zhǎng)，因此時(shí)k

最大，測(cè)定的靈敏度高；2)如干擾物在待測(cè)物的最大吸收波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈的吸收，則選擇非最大吸收波長(zhǎng)作為入射光的波長(zhǎng)，這時(shí)靈敏度雖有下降，但卻消除了干擾。第41頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月曲線A為鈷絡(luò)合物的吸收曲線曲線B為顯色劑的吸收曲線吸光度測(cè)定條件的選擇第42頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.5.2光度計(jì)讀數(shù)范圍的選擇

任何光度計(jì)都有一定的測(cè)量誤差，誤差來(lái)源于：入射光源不穩(wěn)定；吸收池玻璃厚薄不均勻；池壁不夠平行、表面有水跡、油污或劃痕等；光電池不靈敏、疲勞現(xiàn)象及檢流計(jì)刻度不準(zhǔn)等。以上因素造成測(cè)量誤差的總和，表現(xiàn)為透光度讀數(shù)誤差△T。T與c之間是對(duì)數(shù)關(guān)系，同樣的△T對(duì)不同濃度造成的△c不同。在不同的吸光度范圍內(nèi)讀數(shù)，引入的濃度測(cè)量誤差是不同的，因此必須選擇合適的吸光度讀數(shù)范圍。第43頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)朗伯-比爾定律：

或求微分：

兩式相除：

以有限值表示：

第44頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月濃度的相對(duì)誤差；

T：透光度讀數(shù)的絕對(duì)誤差

何時(shí)濃度的相對(duì)誤差最??？

T=0.368或A=0.434時(shí)，濃度的相對(duì)誤差最小。第45頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

一般分光光度計(jì)的

T在±0.2%~±1%之間，如果為±0.5%，根據(jù)上式計(jì)算不同A或T%時(shí)濃度的相對(duì)誤差。如圖18-9、表18-29(p351)。T%：10~70A：1.0~0.15，濃度的測(cè)量誤差較小。而A過高或過低，因讀數(shù)造成的濃度的相對(duì)誤差都是很大的。第46頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

為了減小測(cè)量的相對(duì)誤差可采取如下措施：(1)控制溶液的濃度，如改變?cè)嚇拥姆Q出量或改變稀釋度等。(2)如溶液已顯色，則可選擇合適厚度的比色皿，使吸光度在上述范圍內(nèi)。第47頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.5.3參比溶液的選擇

參比溶液用來(lái)調(diào)節(jié)儀器的零點(diǎn)，以消除吸收池壁及溶劑等對(duì)入射光的反射和吸收帶來(lái)的影響，使測(cè)得的吸光度能真正反映被測(cè)物質(zhì)的含量。選擇參比溶液的原則：(1)如果僅所測(cè)物質(zhì)有吸收，顯色劑及其它試劑均無(wú)吸收，可用純?nèi)軇┳鲄⒈?，如蒸餾水；(2)如顯色劑和其他試劑略有吸收，則應(yīng)用不含被測(cè)組分的試劑溶液（空白溶液）作參比溶液；第48頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(3)如果試樣中其他組分有吸收，但不與顯色劑作用，當(dāng)顯色劑無(wú)吸收時(shí)，可用試樣溶液（不加顯色劑）作參比；當(dāng)顯色劑也略有吸收，或干擾離子也與顯色劑作用且產(chǎn)物有吸收，可在試液中加掩蔽劑，掩蔽待測(cè)組分，再加顯色劑，以此溶液作參比。第49頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20.5.4溶液濃度的測(cè)定1.工作曲線法配制一系列不同濃度的被測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的λmax和最佳操作條件下，測(cè)得吸光度，作工作曲線（A~c），為一直線，也叫標(biāo)準(zhǔn)曲線。在完全相同條件下，測(cè)得試樣溶液的吸光度，從工作曲線上查得相應(yīng)濃度。第50頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.比較法同一波長(zhǎng)的光，通過兩個(gè)厚度相同而濃度不同的溶液，則濃度之比等于吸光度之比。A標(biāo)=kbc標(biāo)

A試=kbc試第51頁(yè)，課件共57頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月