人教版高二生物選修一教學(xué)課件《專題5課題3 血紅蛋白的提取和分離》 (共39張PPT)

課題3血紅蛋白的提取和分離

血紅蛋白只存在于紅細(xì)胞內(nèi)，含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)血紅蛋白的特點(diǎn)：一、基礎(chǔ)知識(shí):【思考1】:1、分離生物大分子的基本思路是什么？2、不同蛋白質(zhì)的特性在哪些方面存在差異？3、本課題我們將利用血紅蛋白與雜質(zhì)蛋白哪方面的差異進(jìn)行提純？4、為什么不用雞的血紅細(xì)胞而用哺乳動(dòng)物的血紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料？5、用什么方法分離相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)？一、基礎(chǔ)知識(shí)--蛋白質(zhì)提取和分離原理

蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)－－蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別。提取分離方法凝膠色譜法

凝膠電泳法

1、原理：2、材料-小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；多孔性的多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。凝膠(一)凝膠色譜法（分配色譜法）：根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法分子量大小直徑大小運(yùn)動(dòng)方式運(yùn)動(dòng)速度運(yùn)動(dòng)路徑洗脫次序一、基礎(chǔ)知識(shí)---蛋白質(zhì)分離和提取的原理大于凝膠顆?？紫吨睆?，被阻擋在顆粒的外面小于凝膠顆?？紫吨睆?，可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部垂直向下移動(dòng)垂直向下移動(dòng)，無規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入顆粒內(nèi)部較快較慢較短較長(zhǎng)先從凝膠柱洗脫出來后從凝膠柱洗脫出來3、具體過程一、基礎(chǔ)知識(shí)---蛋白質(zhì)分離和提取的原理凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過程的動(dòng)畫演示

1、什么是緩沖液？2、緩沖液的作用是什么？【思考2】:（二）、緩沖溶液-在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液。由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸鈉，NaH2PO4/Na2HPO4等能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PH值的影響，維持PH基本不變。洗脫劑3、緩沖液是如何配制的？4、本實(shí)驗(yàn)加的是什么緩沖液？為何要加緩沖液？通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。磷酸緩沖液在本課題中使用的緩沖液是:__________,其目的是:利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的pH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)2.原理：(三)電泳1.電泳的概念指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程.①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。②在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。凝膠電泳原理示意圖在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率完全取決于分子大小。(三)電泳3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。4.聚丙稀酰胺凝膠電泳分離過程：二、實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白釋放；離心分離等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定?！ㄒ唬悠诽幚硌貉獫{水分固體物質(zhì)：血漿蛋白、無機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)血液的成分（一）樣品處理及粗分離1、紅細(xì)胞的洗滌：（2）目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固血液＋檸檬酸鈉→低速短時(shí)離心→吸出上層血漿→紅細(xì)胞＋5倍體積生理鹽水→緩慢攪拌10min→低速短時(shí)離心→吸出上清液→反復(fù)洗滌直至上清液無黃色（1）步驟：柜式離心機(jī)初次離心后的結(jié)果3次洗滌后的結(jié)果在蒸餾水和甲苯作用下攪拌，紅細(xì)胞破裂釋放2、血紅蛋白的釋放：蒸餾水的作用是加入甲苯的作用是充分?jǐn)嚢璧哪康氖鞘辜t細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂攪拌器轉(zhuǎn)子磁力攪拌器攪拌器正在工作3.分離血紅蛋白分離過程紅細(xì)胞混合液中速離心10min離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)燒杯紅細(xì)胞破碎混合液→中速長(zhǎng)時(shí)離心（2000r/min×10min）→濾紙過濾除去脂質(zhì)→分液漏斗分離出血紅蛋白，得到紅色透明液體。分離血紅蛋白溶液有機(jī)溶劑無色透明的甲苯層脂類物質(zhì)白色脂溶性物質(zhì)沉淀層血紅蛋白溶液紅色透明液體紅細(xì)胞破碎物沉淀暗紅色沉淀物20mmol/L磷酸緩沖液1mL1mL4、透析（粗提?。貉b入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。利用透析袋透析透析過程（二）純化－－凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：3.樣品的加入和洗脫（二）凝膠色譜操作1、凝膠色譜柱的制作：

①取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。如P68圖5-19注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液裝填:2.凝膠色譜柱的裝填：步驟操作要求①②③④⑤立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴

凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計(jì)算稱量凝膠固定色譜柱注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。

3、洗脫液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。

2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。4、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。裝配好的凝膠柱如圖5-213.樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩