農(nóng)學動物生物化學課件13 DNA的生物合成-復制

第13章DNA的生物合成

—復制（Replication）第13章DNA的生物合成1本章主要內(nèi)容：

中心法則

DNA復制的半保留性參與DNA復制的酶類和蛋白因子

DNA的復制過程

DNA的損傷和修復

反轉錄本章主要內(nèi)容： DNA復制的半保留性DNA的復制過程2

現(xiàn)代生物化學和分子生物學的一個最基本的觀點--在生命有機體中，基因是唯一能夠復制，并且能永遠存在的單位，而其意義最終須通過蛋白質才體現(xiàn)出來。從DNA到蛋白質，遺傳信息的流動遵循著中心法則。1.中心法則 現(xiàn)代生物化學和分子生物學的一個最基本的觀點--從DNA到蛋32.DNA的半保留復制半保留復制(semiconservativereplication)： 復制時，親代的雙鏈DNA解開成兩條單鏈，然后各自作為模板指導合成新的互補鏈。

所形成的兩個子代DNA分子與親代DNA分子堿基順序完全相同—復制。每個子代DNA分子中的一條鏈來自親代，另一條鏈為新合成的—半保留。2.DNA的半保留復制半保留復制(semiconserva42.DNA的半保留復制半保留復制實驗依據(jù)1958年M.Messelson等用實驗加以證實雙螺旋結構是半保留復制的分子基礎2.DNA的半保留復制半保留復制實驗依據(jù)1958年M.Me5半保留復制的意義復制的這種方式可保證親代的遺傳特征完整無誤的傳遞給子代，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復制的意義復制的這種方式可保證親6復制DNA的生物合成逆轉錄復制（replication）：即DNA的生物合成，以親代DNA為模板合成兩個完全相同的子代DNA分子的過程。復制DNA的生物合成逆轉錄復制（replication）：即7復制的反應

dATPdCTPdGTP dTTPDNA聚合酶

DNA模板DNA+（

n1+n2+n3+n4)PPiPPi隨即被焦磷酸酶水解，從而推動聚合反應的進行。

DNA復制是在酶的催化下的脫氧核苷酸聚合 過程。需要4種dNTP為底物外，還需要多種酶、 蛋白因子、親代DNA單鏈模板及RNA引物。復制的反應dCTPDNA聚合酶DNA+（PPi隨即被焦磷酸83.DNA的復制過程3.1與復制有關的酶和因子

原核生物：以大腸桿菌為例1.原料：4種dNTP2.解開成單鏈的DNA模板3.引物（primer），小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游離的3’-OH。4.引物酶（primase，DnaG），用于合成復制所必需的RNA引物3.DNA的復制過程3.1與復制有關的酶和因子1.原95.DnaA蛋白，與復制起始部位上（OriC）特定的序列結合。E.Coli上固定的復制起始點稱為Ori.C5.DnaA蛋白，與復制起始部位上（OriC）特定的序106.DnaB（解螺旋酶helicase，rep蛋白）：由多種蛋白因子協(xié)助在復制的起始點上解開雙螺旋。7.單鏈結合蛋白（SSB，singlestrandedbindingprotein）：穩(wěn)定已經(jīng)解開成兩股的DNA單鏈，防止其退火復性。6.DnaB（解螺旋酶helicase，rep蛋118.拓撲異構酶（DNAtopoisomerase）拓撲一詞的含義是指物體或圖象做彈性移位而又保持物體不變的性質。DNA分子中存在打結，纏繞、連環(huán)的現(xiàn)象。拓撲異構酶可松弛正超螺旋，還可引入負超螺旋，有利于復制叉的行進及DNA的合成。I型酶II型酶8.拓撲異構酶（DNAtopoisomerase）拓撲一詞12DNA拓撲異構酶（DNAtopoiSOmerase）108局部解鏈后DNA拓撲異構酶（DNAtopoiSOmerase）108局139.DNA聚合酶（DNApolymerase）全稱：依賴DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase,DNA-pol或DDDP）DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ原核生物的DNA聚合酶：9.DNA聚合酶（DNApolymerase）全稱：依賴14聚合酶I：用于切除引物RNA,并填補留下的空隙5’→3’

聚合酶活性，延伸多核苷酸鏈3’→5’

外切酶的作用，切除可能錯配的核苷酸5’→3’外切酶的作用是切除引物聚合酶I：用于切除引物RNA,并填補留下的空隙5’→3’15小片段

323個氨基酸5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個氨基酸

DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶小片段 323個氨基酸大片段/Klenow片段 60416聚合酶II：活性弱5’→3’聚合酶活性，延伸多核苷酸鏈3’→5’核酸外切酶活性聚合酶III：主要的復制酶，并有校讀、糾錯的功能

5’→3’聚合酶活性，延伸多核苷酸鏈，活性很強，有模板依賴性，其延伸的方式是依據(jù)堿基互補配對的原則，將原料dNTP與游離的3’-OH上連接，同時釋出一個PPi。

3’→5’核酸外切酶活性，切除可能錯配的核苷酸聚合酶II：活性弱5’→3’聚合酶活性，延伸多核苷酸鏈聚17DNA-polIII:

由10種亞基組成的不對稱聚合體

催化效率最高其中α亞基具有5'→3'聚合DNA的酶活性，因而具有復制DNA的功能；而ε亞基具有3'→5'外切酶的活性，因而與DNA復制的校正功能有關。φεεDNA-polIII:由10種亞基組成的不對稱聚合體18[農(nóng)學]動物生物化學課件13DNA的生物合成—復制19負責鏈的延長

(活性高)＋＋

切去引物物RNA，補上 正確的的DNA片段與修復有關(活性低)＋＋＋＋＋DNA聚合 酶ⅠDNA聚合 酶Ⅱ原核生物DNA聚合 酶Ⅲ5'→3'3'→5'核酸外切核酸外切聚合功能DNA聚合酶5'→3'大腸桿菌3種DNA聚合酶的性質比較

催化活性負責鏈的延長＋＋ 切去引物物RNA，補上＋＋＋DNA聚合原物20真核生物的DNA聚合酶

在復制延長中起催化作用在沒有其他DNA-pol時才發(fā)揮催化作用 在線粒體DNA復制中起催化作用在復制延長中起催化作用 在復制過程中起校讀、修復和填補缺 口的作用DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

真核生物的DNA聚合酶 在復制延長中起催化作用DNA-2110.DNA連接酶（ligase）

將不連續(xù)的DNA片段以磷酸二酯鍵連接起來，原核生物通過分解NAD為NMN和Pi提供能量，真核生物則消耗ATP10.DNA連接酶（ligase） 將不連續(xù)的DNA片段以22SM哺乳動物的細胞周期DNA合成(synthesis)期

G1分為起始、延長、終止三個階段3.DNA的復制過程

G2SM哺乳動物的細胞周期DNA合成(synthesis)期23聚合反應的特點：1、聚合反應具有方向性:5

3

2、DNA聚合酶不能催化兩個游離的脫氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的3

-OH逐個添加脫氧核苷酸，使核苷酸鏈不斷延長。3.DNA的復制過程聚合反應的特點：1、聚合反應具有方向性:5324DNA聚合酶延伸多核苷酸鏈總是5’→3’方向聚合酶催化的鏈延長反應DNA聚合酶延伸多核苷酸鏈總是5’→3’方向聚合酶催化的鏈延25相關的幾個概念：1、復制起始點（E.coli-OriC）

復制從特定的位點開始，這一位置叫復制原點。原核生物的DNA上一般只有一個復制原點，但在迅速生長時期，第一輪復制尚未完成，就在起點處啟動第二輪復制。真核生物則有多個復制原點，可以同時啟動復制過程。相關的幾個概念：1、復制起始點（E.coli-OriC） 復26

5

3

新鏈3

5

3

2、復制叉（replicationfork）

復制時DNA雙鏈解開分成二股單鏈，新鏈沿 著張開的二股單鏈生成，復制中形成的這種Y字形 的結構稱為復制叉。

5

3

5

親代DNA

復制方向 5新鏈32、復制叉（replicationfork）27A放射自顯影圖像orioriori復制示意B圖

θ形

3、雙向復制

原核生物例如E.coli，是從固定的復制起始點開始，同時向兩個方向進行復制，稱為雙向復制。A放射自顯影圖像orioriori復制示意B θ 3、雙向復28復制起始點真核原核

復制叉復制起始點真核原核293.DNA的復制過程

3.2DNA復制過程

3.2.1復制的起始需要解決兩個問題：1、DNA解開成單鏈，提供模板2、合成引物，提供3

-OH末端3.DNA的復制過程需要解決兩個問題：1、DNA解開成單鏈30DnaA蛋白辨認起始點,形成起始復合物DnaB蛋白解螺旋DnaC蛋白協(xié)助DnaB★在多種蛋白質參與下，DNA雙螺旋解開，形成單鏈SSB維持單鏈穩(wěn)定DnaA蛋白辨認起始點,形成起始復合物DnaB蛋白解螺旋Dn31OH★合成引物DnaADnaB、DnaCDNA拓撲異構酶引物酶SSB5

3

3

5

OH★合成引物DnaADnaB、DnaCDNA拓撲異32總結：

①復制的起始在原核生物只有一個起始點（Ori.C），而在真核生物有多個起始點。②DnaA，DnaB（解螺旋酶，rep蛋白）和DnaC參與解鏈，形成復制叉（replicationfork），SSB結合并穩(wěn)定解開的單股DNA鏈；引物酶（DnaG）與上述因子、酶構成引發(fā)體（primosome），并合成RNA引物。解鏈造成的超螺旋，由拓撲異構酶實現(xiàn)超螺旋的轉型，即把正超螺旋轉變?yōu)樨摮菪??？偨Y： ①復制的起始在原核生物只有一個起始點②DnaA，33辨認功能起始點并結合于位點解開DNA雙鏈協(xié)助解螺旋酶催化RNA引物生成穩(wěn)定解開的單鏈理順DNA鏈E.coli的復制起始點名稱DnaA蛋白(四聚體)解螺旋酶（DnaB蛋白，rep蛋白）DnaC蛋白引物酶（DnaG蛋白）SSB拓撲異構酶oriC（245bp的DNA組分）參與復制起始的各種因子和酶辨認功能起始點并結合于位點名稱參與復制起始的各種因子和酶34原核生物復制的起始原355’3’5’DNA-polDNA-polDNA-polDNA-poldGTPdTTPdCTP dTTP

dATPdGTPdATPdCTP3.2.2DNA鏈的延伸

DNA聚合酶催化游離的脫氧核苷酸結合 到新鏈3’末端，使其不斷延長。5’3’5’DNA-polDNA-polDNA-polDN36半不連續(xù)復制示意圖半不連續(xù)復制示意圖37這種前導鏈連續(xù)合成，隨后鏈斷續(xù)合成的方式，稱為半不連續(xù)復制。

隨后鏈中合成的多個DNA片段，稱為岡崎片段。岡崎片段的長度原核細胞中約1000-2000個核苷酸，真核細胞中約100-200個核苷酸。這種前導鏈連續(xù)合成，隨后鏈斷續(xù)合成的方式，稱為半不連續(xù)復制。38復制叉的推進①先導鏈的合成引物酶在復制原點附近合成一段RNA引物；DNA聚合酶Ⅲ(原核細胞)在引物的3'末端逐個添加脫氧核苷酸。隨著復制叉的推進，親代DNA雙螺旋不斷被解開，先導鏈也不斷延伸。復制叉的推進①先導鏈的合成引物酶在復制原點附近合成一段R39②隨后鏈的合成引物的合成：隨后鏈的每個岡崎片段都需要合成RNA引物。也是由引物酶催化。岡崎片段的合成：DNA聚合酶Ⅲ(原核細胞)在引物的3'末端使DNA鏈延伸，直至抵達其下游的另一個岡崎片段的RNA引物的5'端。岡崎片段的連結：DNA聚合酶Ⅰ一面以其DNA聚合活性在上游岡崎片段的3'-OH末端添加脫氧核苷酸，一面以其5'→3'核酸外切活性切除引物，直至將引物全部切除。DNA連接酶將最后的缺口補好。②隨后鏈的合成引物的合成：隨后鏈的每個岡崎片段都需要合成40③先導鏈和隨后鏈中DNA的延伸由同一個DNA聚合酶Ⅲ全酶二聚體催化隨后鏈的模板回折成環(huán)，從而使岡崎片段的延伸方向與先導鏈的延伸方向一致，它們的3'末端分別落在DNA聚合酶Ⅲ全酶的雙活性部位。因此，隨著聚合酶的移動，兩條鏈同時延伸。③先導鏈和隨后鏈中DNA的延伸由同一個DNA聚合隨后鏈的模41復制叉的結構復制叉的結構42

由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填補空隙，由DNA連接酶將DNA片段連接起來。在真核生物，由端粒酶（telomerase）催化在真核線性DNA的末段形成一種特殊的結構并與蛋白質結合成端粒（telomere）。3.2.3復制的終止 由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填補在真核生物，由端粒酶43

連接酶將DNA片段連接起來完成復制DNA聚合酶I正在一邊切除RNA引物，一邊合成新的DNA以填補空隙引物岡崎片段 連接酶將DNA片段DNA聚合酶I正在一邊引物岡崎片段44大腸桿菌DNA的復制大腸桿菌DNA的復制45至少依賴三種機制1、遵守嚴格的堿基配對規(guī)律。聚合酶在復制 延長中對堿基的選擇功能（按模板要求選 擇底物）。2、復制出錯時有即時的校讀功能3、切除引物4、聚合時的方向5、修復作用★復制忠實性的保證至少依賴三種機制1、遵守嚴格的堿基配對規(guī)律。聚合酶在復制2、46聚合酶催化的鏈延長反應聚合酶催化的鏈延長反應47胸腺嘧啶二聚體

DNA的突變有點突變（堿基的錯配）、堿基的缺失、DNA片段的重排等形式。4.DNA的損傷與修復

4.1DNA的損傷

DNA的突變(損傷)大多數(shù)是 自發(fā)的，是進化與分化的基礎。 環(huán)境中的理化因素，如紫外 輻射引起兩個嘧啶堿基的共價 聚合。許多化學誘變劑，它們 常是致癌物,如亞硝酸鹽，常 導致DNA突變。胸腺嘧啶二聚體 DNA的突變有點突變（堿基4.DNA的損傷48直接修復：如光復活酶,普遍存在在生物機體中,可以把嘧啶二聚體恢復正常狀態(tài)。切除修復：找出損傷位置并切除，進行修復合成并連接。重組修復：先復制再修復。子代鏈在對應模板鏈的損傷處留下 缺口，先將同源母鏈DNA上相應的核苷酸片段轉移替補， 然后再合成一段序列填充缺口。SOS系統(tǒng)：復雜的應急反應。既有避免差錯的修復又有引起差錯的修復，后者有高變異率但也增加了生存機會。4.DNA的損傷與修復4.2DNA損傷的修復直接修復：如光復活酶,普遍存在在生物機體中,可以把嘧啶二聚體49

重組修復切除修復 重組修復50逆轉錄酶(reversetranscriptase)逆轉錄(reversetranscription)以RNA為模板，合成與其互補的DNA的過程。逆轉錄酶依賴RNA的DNA聚合酶5.逆轉錄作用—以RNA為模板合成DNA逆轉錄酶(reversetranscriptase)51

逆轉錄也稱反轉錄，是某些生物（如雞的肉瘤病毒、HIV等）的特殊復制方式。它們的遺傳信息載體是RNA而不是DNA。因此，在感染細胞時，首先經(jīng)過逆轉錄作用成為雙鏈DNA，才能整合到宿主基因組中去。 這個過程由逆轉錄酶催化，它具有以RNA為模板合成DNA，水解雜交鏈上的RNA以及以DNA為模板合成DNA三種活性。 逆轉錄現(xiàn)象和逆轉錄酶（reversetranscriptase）（H.Temin，1970）是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)，是對經(jīng)典中心法則重 逆轉錄也稱反轉錄，式。它們的遺傳信息載體是RNA而不是DN52RNADNA以RNA為模板，合成DNA的過程。

反轉錄酶反轉錄酶有三個作用 以RNA為模板合成DNA(cDNA） 水解RNA模板第二以新合成單鏈DNA為模板合成條DNARNADNA以RNA為模板，合成DNA的過程。反轉錄酶有三53逆轉錄病毒細胞內(nèi)的逆轉錄現(xiàn)象：

RNA模板

逆轉錄酶

DNA-RNA

雜化雙鏈

RNA酶

單