廣東柘林灣沉積物中甲藻孢囊的多樣性

廣東柘林灣沉積物中甲藻孢囊的多樣性

1甲藻孢囊和浮游動物群落組成的演變浮游植物的睡眠是沉積物中的一種特殊生物。這些種類的組成和分布特征與海洋環(huán)境的養(yǎng)分含量、水溫和鹽分密切相關(guān)。同時，沉積物的類型、體積大小、沉積速度和人為因素也會對其分布產(chǎn)生顯著影響（geno耀等人，2011；prebble等人，2013；hessil等人，2013）。因此，沉積物中浮游植物的睡眠是有效的生物指標(biāo)和信號源，以及對海洋環(huán)境變化的評價指標(biāo)和信號載體（matarian等人，1999；zonneved等人，2012；lietal，2013）。甲藻孢囊是甲藻有性生殖的產(chǎn)物,具有較厚的細胞壁,能抵御酸堿腐蝕和缺氧、黑暗環(huán)境.研究發(fā)現(xiàn),甲藻孢囊的分布能夠較為全面地反映海域富營養(yǎng)化的演變歷史(Matsuoka,1999;Zonneveldetal.,2012;Liuetal.,2013).甲藻孢囊萌發(fā)可為水體提供營養(yǎng)細胞,被認(rèn)為是引發(fā)赤潮的“種源”(Krempetal.,2000);而孢囊的形成又將大量營養(yǎng)細胞從水體轉(zhuǎn)移至沉積物中,是赤潮后期營養(yǎng)細胞大量減少、赤潮消亡的重要原因(Krempetal.,1999;Wangetal.,2007).柘林灣地處閩粵兩省交界,是南海西北部的一個半封閉型海灣,同時也是廣東最大的海產(chǎn)養(yǎng)殖基地之一.養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展與陸源排污排廢的影響,致使該海域富營養(yǎng)化問題日益突出,浮游植物與浮游動物的生物多樣性下降,群落組成呈小型化的趨勢,成為赤潮多發(fā)區(qū)(黃長江等,1999;周凱等,2002).為了了解甲藻孢囊在柘林灣的分布規(guī)律及其萌發(fā)趨勢,本研究采集柘林灣10個站位的表層沉積物樣品,對沉積物中甲藻孢囊進行定性定量分析,并對沉積物中浮游植物休眠體進行萌發(fā)實驗,對萌發(fā)的浮游植物群落結(jié)構(gòu)進行分析,以了解甲藻孢囊的分布狀況,揭示柘林灣海域赤潮發(fā)生潛勢.2材料和方法表面活性劑2.1表層沉積物的采集在柘林灣海域設(shè)置了10個采樣點(圖1),于2008年11月用彼得遜采泥器采集表層沉積物,樣品采集后,用透明PVC管垂直插入采集的沉積物中,得到深度約10cm的柱狀樣品,取上表層0~2cm沉積物,置于低溫(4℃)、缺氧(充入氮氣)、避光條件下保存待分析.2.2甲藻孢囊的分類稱取沉積物樣品3g左右,在70℃烘箱中烘干(24h),以測定沉積物中的含水率.另稱取沉積物樣品3~5g,用鹽酸和氫氟酸分別去除沉積物中的鈣質(zhì)、硅質(zhì),然后分別用125μm和20μm網(wǎng)篩過濾,收集20~125μm之間的懸浮液至小塑料瓶中,定容至10mL.取1mL處理后的樣品于計數(shù)框內(nèi),在LeicaDMIRB倒置顯微鏡下觀察,對甲藻孢囊進行定性定量分析,分別計數(shù)含有內(nèi)含物的活體孢囊和已經(jīng)萌發(fā)的空孢囊.重復(fù)取樣觀察,使每個樣品至少觀察到100~200個孢囊.表層沉積物中孢囊的密度以每克干沉積物中的孢囊數(shù)(cysts·g-1)表示.孢囊分類鑒定至種,在不能確定種名的情況下,則鑒定至屬.由于甲藻孢囊最初是孢粉學(xué)家研究的對象,早期孢囊分類學(xué)研究是根據(jù)孢囊的孢粉學(xué)特征進行分類命名,隨著孢囊研究的深入,發(fā)現(xiàn)現(xiàn)存甲藻也能形成孢囊,因此,孢囊分類學(xué)具有兩套分類系統(tǒng).孢粉學(xué)學(xué)名能更直觀反映孢囊的形態(tài)特征,而生物學(xué)學(xué)名則能反映孢囊與營養(yǎng)細胞的對應(yīng)關(guān)系,目前在孢囊研究中兩套分類系統(tǒng)并存,因此,本文中也同時列出了甲藻孢囊的孢粉學(xué)學(xué)名、營養(yǎng)細胞學(xué)名和中文名稱.孢囊分類鑒定主要參考文獻(Matuokaetal.,2000;王朝暉,2007).2.3實驗方法和材料由于浮游植物休眠體均具有一定時間的強制性休眠期,只有度過了強制性休眠期的休眠體方具有萌發(fā)潛勢.強制性休眠期的長短與種類及保存的環(huán)境狀況有關(guān),一般為2周至半年不等(Matsuokaetal.,2000).沉積物樣品在4℃下缺氧避光保存1年后再進行萌發(fā)實驗,以保證全部休眠體度過強制性休眠期,同時也可使表層沉積物中浮游植物營養(yǎng)細胞失去生長活性,確保觀察到的浮游植物全部為休眠體萌發(fā)而得.稱取1g表層沉積物樣品,加入到50mL的三角瓶中,加入培養(yǎng)基40mL.培養(yǎng)基用柘林灣海域陳舊的自然海水經(jīng)GF/C濾膜過濾后配制而成,培養(yǎng)基中添加的氮、磷、硅濃度根據(jù)自然海水中營養(yǎng)鹽水平配制,分別為500μg·L-1氮、74μg·L-1磷和1000μg·L-1硅,其余元素與1/2f培養(yǎng)基相同.培養(yǎng)基和所有試驗容器均經(jīng)過高壓蒸汽滅菌(121℃、15min)后備用.萌發(fā)溫度為25℃,在光照強度為100μmol·m-2·s-1、光暗比12∶12h(L∶D)的恒溫培養(yǎng)箱中進行萌發(fā),每天搖動1次.每個沉積物樣品設(shè)20d和40d萌發(fā)2組實驗,每個實驗組各設(shè)3個平行.在培養(yǎng)的第20d和40d,各取上清30mL,合并3個平行樣品,加入4%的甲醛溶液固定,靜置24h以上,逐步濃縮成2mL待觀察.在LeicaDMIRB顯微鏡下對萌發(fā)的浮游植物進行定性定量分析,萌發(fā)的浮游植物數(shù)量以每克干泥中萌發(fā)的浮游植物細胞數(shù)表示(cells·g-1).浮游植物分析鑒定根據(jù)文獻(郭玉潔等,2003;Hallegraeffetal.,2003)進行,一些不確定種僅鑒定至屬.其中一種小型薄壁甲藻的鑒定,則通過分離培養(yǎng)的細胞株進行rDNA序列測定,與GenBank上相關(guān)序列進行比對分析,結(jié)合掃描電子顯微鏡觀察,確定為Biecheleriopsisadriatica.3結(jié)果結(jié)果3.1甲藻繁殖囊的分布在托林灣的表面沉積物中3.1.1數(shù)據(jù)分析和擬石松屬分類本次調(diào)查中分析鑒定出的甲藻孢囊種類數(shù)不多,每個樣品出現(xiàn)的孢囊物種數(shù)在5~11種之間,其中,Z6站位孢囊種類數(shù)最多,其余各站位孢囊種類數(shù)均相差不大.有毒的亞歷山大藻孢囊和鏈狀裸甲藻孢囊在柘林灣表層沉積物中廣泛分布,而中國海域不常見的巴哈馬梨甲藻孢囊(Pyrodiniumbahamense)也有出現(xiàn).3.1.2干藻體結(jié)構(gòu)內(nèi)質(zhì)區(qū)柘林灣海域10個站位表層沉積物中甲藻孢囊密度為16.59~83.37cysts·g-1,平均密度為39.52cysts·g-1.從分布趨勢來看,孢囊密度呈現(xiàn)出由灣外向灣內(nèi)逐漸升高的趨勢(圖2).孢囊密度較高的區(qū)域分布在柘林灣北部,北方有黃岡河流入,而且大量的海水養(yǎng)殖基地均分布在該區(qū)域,致使孢囊密度較高;而在靠近海山島南及汛洲島南的海域,海域養(yǎng)殖業(yè)較少,孢囊密度也較小.甲藻具有自養(yǎng)型和異養(yǎng)型兩種營養(yǎng)類型,膝溝藻類、鈣質(zhì)孢囊類的全部物種及裸甲藻類中的鏈狀裸甲藻、旋溝藻和哈曼褐多溝藻屬于自養(yǎng)型甲藻,而全部原多甲藻類、翼藻類及裸甲藻類中的多溝藻屬于異養(yǎng)型甲藻.異養(yǎng)型甲藻孢囊在數(shù)量上占總孢囊數(shù)量的百分比較高,平均為58.1%,多出現(xiàn)在養(yǎng)殖密集區(qū)域的Z1、Z5、Z6、Z8、Z9等站位(圖3).在表層沉積物中存在的孢囊集群中有未萌發(fā)的活體孢囊和已萌發(fā)的空孢囊,活體孢囊一般為水體中新形成的孢囊,內(nèi)有細胞內(nèi)含物,經(jīng)歷了強制性休眠期后能夠萌發(fā)成營養(yǎng)細胞;空孢囊則是萌發(fā)后的孢囊,兩者數(shù)量及其百分比則可反映孢囊萌發(fā)狀況.本研究中空孢囊百分比均較高(圖3),平均百分比達到56.3%,說明大部分孢囊已經(jīng)萌發(fā).Z6站位的活體孢囊密度最高,為35.73cysts·g-1,Z8站位的空孢囊密度最高,為58.24cysts·g-1.3.2浮游植物群落的結(jié)構(gòu)3.2.1優(yōu)勢種和違法優(yōu)勢藻類柘林灣海域表層沉積物共萌發(fā)出浮游植物26屬33種.其中,硅藻19種,占總種數(shù)的57.6%,以擬菱形藻(Pseudonitzschiaspp.)、角毛藻(Chattocerosspp.)、中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)、圓篩藻(Coscinodiscusspp.)等為優(yōu)勢種;甲藻8種,有毒有害赤潮藻類種類較豐富,包括亞歷山大藻、斯氏藻、裸甲藻等常見的有害生物,一種woloszynskioid類甲藻Biecheleriopsisadriatica是主要優(yōu)勢種;其他浮游植物種類如藍細菌、綠藻、硅鞭藻等也有出現(xiàn).20d時萌發(fā)出的種類數(shù)較多,總種類數(shù)為26種,而且甲藻和硅藻種類數(shù)也較多;而40d時萌發(fā)出的總種類數(shù)僅為18種.3.2.2浮游植物群落優(yōu)勢種類萌發(fā)的浮游植物總細胞密度如圖4a所示.20d萌發(fā)出的浮游植物細胞密度為49~11436cells·g-1(以干重計,下同),平均為2015cells·g-1;最高值出現(xiàn)在Z4站位,優(yōu)勢種主要為藍細菌中的色球藻(Chroococcusspp.).40d萌發(fā)出的浮游植物細胞密度明顯高于20d,為70~113538cells·g-1,平均為31266cells·g-1.Z1、Z4站位浮游植物密度較高,優(yōu)勢種分別為定鞭藻中的金色藻(Chrysochromulinaspp.)和綠藻中的粘四集藻(Palmellamucosa).硅藻是萌發(fā)浮游植物群落的主要優(yōu)勢類群,整體來說,20d萌發(fā)的硅藻數(shù)量較低(圖4b).20d萌發(fā)中Z2站位硅藻密度較高,為621cells·g-1,優(yōu)勢種主要為擬菱形藻;40d萌發(fā)中Z7站位硅藻細胞密度最高,為7630cells·g-1,主要優(yōu)勢種也為擬菱形藻.Z3站位萌發(fā)的硅藻最少,20d和40d萌發(fā)后,硅藻密度均低于20cells·g-1.萌發(fā)的甲藻細胞密度遠遠低于硅藻,大部分站位的甲藻細胞密度小于100cells·g-1(圖4c).20d萌發(fā)后,Z6站位的甲藻細胞密度最高,為229cells·g-1,Biecheleriopsisadriatica為優(yōu)勢甲藻,Z4站位中未見甲藻出現(xiàn).40d萌發(fā)后,甲藻細胞密度更低,最高值僅為64cells·g-1,且有4個站位未見有甲藻出現(xiàn).其他類別的浮游植物在萌發(fā)的浮游植物中大量出現(xiàn),特別是40d萌發(fā)后密度更高(圖4d).優(yōu)勢種類主要是一些微微型(2~20μm)種類,如藍藻中的色球藻、定鞭藻中的金色藻、球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa)及綠藻中的粘四集藻等,如金色藻在Z1和Z4站位40d萌發(fā)中大量出現(xiàn),密度分別達50091和32603cells·g-1;球形棕囊藻也在Z4和Z5站位40d萌發(fā)中大量出現(xiàn),細胞密度達17784和6962cells·g-1;而粘四集藻則在各站位的40d萌發(fā)中均大量出現(xiàn)4討論4.1不同類型實踐中孢囊的數(shù)量和碳源的變化本研究中柘林灣海域10個站位僅觀察到甲藻孢囊16種,孢囊密度均低于100cysts·g-1,平均密度小于50cysts·g-1,甲藻孢囊種類豐富程度和密度要明顯低于2001年的調(diào)查結(jié)果(王朝暉等,2004).甲藻孢囊常在顆粒大小、沉降性質(zhì)與之相近的粘土中積累,顆粒較細的粘性沉積物中甲藻孢囊密度較高(Yamaguchietal.,1995).本調(diào)查孢囊種類和密度低的原因主要有:(1)本次調(diào)查區(qū)域位于黃岡河口、海山島附近,沉積物中砂質(zhì)較多,不利于孢囊的沉降和積累;而且黃岡河帶來大量懸浮物質(zhì)及養(yǎng)殖區(qū)的殘餌沉積,加快了沉積物的沉降,使得孢囊被稀釋,因而密度降低.而2001年調(diào)查的站位主要位于柘林鎮(zhèn)附近養(yǎng)殖區(qū),除了養(yǎng)殖污染外,生活污染也較為嚴(yán)重,初級生產(chǎn)力較高,因而孢囊產(chǎn)量也較高.(2)2001年的調(diào)查中,分析的是長度為20cm左右的垂直沉積物樣品,是近15~20年來孢囊沉降積累的結(jié)果,因而孢囊種類多樣性也較高,而且2001年調(diào)查中每個樣品中的種類數(shù)也不是很高.(3)本調(diào)查是表層沉積物樣品,由于沉積物擾動和底棲動物的攝食,可能會造成某些孢囊的損失.異養(yǎng)型甲藻孢囊的百分比是孢囊組成的重要部分.異養(yǎng)型甲藻屬于消費者,需要攝食其他小型浮游植物(一般為小型硅藻)才能生長,根據(jù)生態(tài)系統(tǒng)的能量流動規(guī)律,較高營養(yǎng)級生物的生長速度和生物量均較初級生產(chǎn)者低,因此,異養(yǎng)型甲藻及其孢囊的產(chǎn)量應(yīng)遠低于自養(yǎng)型物種.在孢囊集群中,如果異養(yǎng)型甲藻孢囊百分比上升,說明其食物來源豐富,也就是說小型硅藻類數(shù)量豐富,從而能在一定程度上表示海域較高的富營養(yǎng)化程度(Matsuoka,1999).本研究中,柘林灣表層沉積物中異養(yǎng)型甲藻的孢囊百分比超過了50%,也在一定程度說明了該海域較高的富營養(yǎng)化程度和初級生產(chǎn)力.而實際上柘林灣水體富營養(yǎng)化較為嚴(yán)重,初級生產(chǎn)力高,硅藻為浮游植物主要類群(周凱等,2002).孢囊一般需要溶解氧和適當(dāng)?shù)墓鈴姴拍苊劝l(fā)(Andersonetal.,1987),因此,沉積物中的孢囊必需進入水體真光層才能萌發(fā),而萌發(fā)后的孢囊殼(空孢囊)也會沉降至沉積物中.因此,空孢囊的比例還可作為孢囊萌發(fā)的依據(jù)(Krempetal.,1999).在擾動較大的海域,空孢囊的百分比也較高.柘林灣位于亞熱帶海域,水溫較高,營養(yǎng)鹽含量豐富,有利于孢囊萌發(fā),較高的空孢囊百分比說明該海域孢囊萌發(fā)率較高.同時也可能是由于研究海域處于人類活動比較劇烈的養(yǎng)殖海域與航道上,表層沉積物擾動劇烈,導(dǎo)致底層沉積物中已經(jīng)萌發(fā)的空孢囊上浮至表層沉積物中.4.2biecheeliopsis的簡介本研究中萌發(fā)的浮游植物種類多樣性較低,種類豐富程度遠低于同一海域浮游植物調(diào)查結(jié)果(周凱等,2002),而甲藻萌發(fā)的種類數(shù)也明顯低于沉積物中孢囊的種類數(shù).分析其原因,首先是由于并非所有浮游植物都能形成孢囊或休眠體,因此,休眠體種類豐富程度應(yīng)較浮游植物低.其次,本研究中沉積物休眠體分別經(jīng)過20、40d的萌發(fā)培養(yǎng),萌發(fā)出的營養(yǎng)細胞經(jīng)歷了一段時間的生長繁殖,生長速度快的細胞能夠在短時期內(nèi)迅速增長,成為營養(yǎng)細胞的優(yōu)勢種類,而其它競爭力差的種類在生長后期則慢慢消失,導(dǎo)致觀察到的種類較少,并且優(yōu)勢種類均為一些生長速度較快的小型種類,特別是40d萌發(fā)培養(yǎng)后.此外,影響萌發(fā)的因素很多,包括溫度、溶解氧、營養(yǎng)鹽、光照強度等環(huán)境條件(Kimetal.,2000)及生物內(nèi)在節(jié)律(Matraietal.,2005)等,可能導(dǎo)致沉積物中某些孢囊或休眠體不能在實驗室設(shè)定的培養(yǎng)條件下萌發(fā).在本研究中一種woloszynskioid類甲藻Biecheleriopsisadriatica是萌發(fā)甲藻的優(yōu)勢種,但在沉積物中卻未觀察到該藻孢囊的存在.可能是由于對該藻生活史和孢囊形態(tài)的認(rèn)識不足,不能辨別其孢囊,而在該藻培養(yǎng)過程中也未能觀察到其孢囊的形成,但Moestrup等(2009)曾觀察到了其疑似孢囊.Biecheleriopsisadriatic是一類薄壁甲藻類,細胞表面由大量小而薄的甲片覆蓋(Moestrupetal.,2009),在光學(xué)顯微鏡下很難觀察到其甲片,在形態(tài)上與裸甲藻非常相似,因此,通常被錯誤判斷為裸甲藻類(Moestrupetal.,2009;Takahashietal.,2014).最近有一些對這類薄壁甲藻進行深入的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究的報道,并建立了若干個新屬,Biecheleriopsis就是其中之一(Lindbergetal.,2005;Hansenetal.,2007;Moestrupetal.,2008,2009),而在以往的研究報道中將其定名為Gymnodiniumcorri或G.pygmaeum等(Moestrupetal.,2009).Biecheleriopsisadriatica是中國海域的新記錄種,這可能與個體微小、細胞壁薄有關(guān),在常規(guī)的浮游植物觀察中常常被忽視或者被誤定,估計在以往研究報道中與之大小相近的裸甲藻類可能都是該藻.而在本研究萌發(fā)浮游植物群落中出現(xiàn)了大量的Biecheleriopsisadriatica,說明其應(yīng)該是柘林灣浮游植物常見種類,而在廣東沿海其他沉積物萌發(fā)實驗中該藻(鑒定為Gymnodiniumcorri)也為優(yōu)勢甲藻(康偉等,2009;Wangetal.,2013).因此,應(yīng)密切關(guān)注其赤潮發(fā)生風(fēng)險.萌發(fā)的營養(yǎng)細胞中也出現(xiàn)了大量的其他類別的浮游植物,藍藻、綠藻及定鞭藻在某些站位的細胞數(shù)量都相當(dāng)豐富,而在以往的浮游植物調(diào)查中幾乎未有這些種類的報道.它們在萌發(fā)的浮游植物中大量出現(xiàn),說明它們理應(yīng)是柘林灣海域浮游植物常見種類,但由于浮游植物調(diào)查采樣時間間隔及樣品采集量的局限性,有些浮游植物可能未在常規(guī)浮游植物調(diào)查中出現(xiàn).