富馬酸依美蒂斯在健康人體血漿中的濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究

富馬酸依美蒂斯在健康人體血漿中的濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究

氨基乙酸鈉-2-氨基乙酸鈉甲基酯磺酸鹽是胺組織h的抗劑。與同類藥物相比，具有強(qiáng)療效、選擇性高、反應(yīng)快、副作用少、滴眼液等特點(diǎn)。3歲以上的兒童適合。于1993年,其在日本上市,用于治療過(guò)敏性鼻炎和慢性蕁麻疹。1997年,獲FDA批準(zhǔn)在美國(guó)上市,用于治療季節(jié)性過(guò)敏性結(jié)膜炎,劑型為滴眼液。由于富馬酸依美斯汀服藥量小,血漿濃度低,其人體藥代動(dòng)力學(xué)研究在國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道中多采用放射性受體測(cè)定法(redio-receptorassay)和C-14同位素標(biāo)記法;國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究建立了人血漿中富馬酸依美斯汀濃度的準(zhǔn)確高靈敏的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS-MS)測(cè)定法,并用于富馬酸依美斯汀在中國(guó)健康男性受試者體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。儀器與檢測(cè)方法1藥品、試劑與儀器試驗(yàn)制劑:富馬酸依美斯汀緩釋膠囊,規(guī)格:每粒2mg,批號(hào):030802;對(duì)照品:富馬酸依美斯汀,純度≥99.0%,杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司研制和提供;內(nèi)標(biāo):鹽酸哌唑嗪對(duì)照品,購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。甲醇色,譜純,德國(guó)Merck公司生產(chǎn);乙酸乙酯、醋酸銨均為分析純?cè)噭?南京化學(xué)試劑廠生產(chǎn);溶液配制均用自制雙蒸水;空白血漿,為南京紅十字會(huì)血站提供的健康人血漿。LC-TSQQuantumUltraAM色譜-串聯(lián)四極質(zhì)譜系統(tǒng),美國(guó)Thermo-Finnigan科技公司產(chǎn)品;TGL-16G離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。富馬酸依美斯汀對(duì)照溶液制備精密稱取富馬酸依美斯汀適量,以甲醇為溶劑溶解,并定量稀釋制成濃度分別為0.01,0.10μg·mL-1的溶液。鹽酸哌唑嗪(內(nèi)標(biāo))溶液制備精密稱取鹽酸哌唑嗪適量,以甲醇為溶劑溶解,并定量稀釋制成濃度為0.50μg·mL-1溶液。2受試者選擇12名男性健康志愿受試者,年齡為19~21歲,體重為56~70kg,身高為167~180cm。3給藥方法與血樣采集受試者禁食過(guò)夜;次日晨,口服富馬酸依美斯汀緩釋膠囊2mg。于服藥前及服藥后1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,24.0和36.0h,分別自肘靜脈取血約3.5mL,置肝素化離心管中,離心分取血漿,于-20℃保存,供血藥濃度測(cè)定。4液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件色譜SepaxHP-C18柱(250mm×4.6mm,5μm),(SepaxTechnologies,Inc.);流動(dòng)相:甲醇-0.25%醋酸銨溶液(85∶15);流量為0.6mL·min-1;柱溫:300C;進(jìn)樣體積30μL。質(zhì)譜API-ES正離子選擇性反應(yīng)檢測(cè),經(jīng)條件優(yōu)化確定質(zhì)譜參數(shù)。加熱毛細(xì)管溫度3500C,噴霧電壓4500V,碰撞誘導(dǎo)解離CID電壓均為35eV。富馬酸依美斯汀的SRM離子為m/z303→m/z246(依美斯汀);鹽酸哌唑嗪(內(nèi)標(biāo))的SRM離子為m/z384→m/z350(哌唑嗪)。5血樣處理精密吸取血漿0.50mL,置10mL離心管中,精密加入0.50μg·mL-1內(nèi)標(biāo)溶液20μL,并加入2mol·L-1氫氧化鈉溶液200μL,渦旋混勻0.5min;加乙酸乙酯5.0mL,渦旋3min;3500r·min-1離心10min,分取上層有機(jī)相4.0mL;370C水浴中,氮?dú)獯蹈?殘留物加入流動(dòng)相50μL渦旋溶解;15000r·min-1離心10min,取上清液30μL;按上述“液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜”進(jìn)行分析。6方法學(xué)考察與評(píng)價(jià)6.1專屬性空白血漿,空白血漿加富馬酸依美斯汀和鹽酸哌唑嗪、及健康受試者口服受試膠囊后的色譜見(jiàn)圖1。富馬酸依美斯汀的保留時(shí)間為6.3min,內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為5.0min,內(nèi)源性雜質(zhì)無(wú)干擾,內(nèi)標(biāo)響應(yīng)穩(wěn)定。6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備取空白血漿0.50mL,精密加入富馬酸依美斯汀對(duì)照溶液適量,制成富馬酸依美斯汀血漿濃度分別為0.05,0.1,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0和16.0ng·mL-1的系列血漿樣本,并分析測(cè)定。富馬酸依美斯汀血漿濃度在0.050~16.0ng·mL-1,色譜響應(yīng)有良好線性關(guān)系;標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為R=0.2155C+0.0039,γ=0.9987(C濃度,R峰面積比值)。A.Blankplasmasample;B.Blankplasmaspikedwith0.05ng·mL-1ofemedastinedifumarate(tR=6.3min)and20.0ng·mL-1ofprazosinehydrochloride(internalstandard,tR=5.0min);CTypicalplasmasampleafterpo2mgemedastinedifumaratesustainedreleasecapsulestoahealthyvolunteer;Emedastinedifumarate:tR=6.3min,C=5.9ng·mL-1;Internalstandard:tR=5.0min,C=20ng·mL-16.3萃取回收率與精密度制備血漿濃度分別為0.10,1.00,8.00ng·mL-1的低、中、高濃度血漿樣本(n=5),依法測(cè)定,并與平行測(cè)定的等量純品對(duì)照進(jìn)行比較計(jì)算萃取回收率。結(jié)果,富馬酸依美斯汀平均萃取回收率為86.5%,內(nèi)標(biāo)鹽酸哌唑嗪平均萃取回收率為81.3%,均>80%。低、中、高濃度血漿樣本的日內(nèi)、日間測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。表明精密度(均RSD<20%)和準(zhǔn)確度(均Diff<20%)良好。7數(shù)據(jù)處理用3P97程序計(jì)算,Cmax和tmas為實(shí)測(cè)值;AUC經(jīng)梯形積分法估算。n=5,meant±SD平均血藥濃度-時(shí)間曲線及主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)1血藥濃度-時(shí)間曲線12名健康受試者單劑量口服受試制劑2mg后,測(cè)得平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。2藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)健康受試者單劑量口服受試制劑2mg后,其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。n=12,mean±SD質(zhì)譜條件的選擇富馬酸依美斯汀服藥量小,人體血漿濃度很低,峰時(shí)血藥濃度每1毫升只有幾個(gè)納克,一般的色譜分離檢測(cè)方法無(wú)法測(cè)定。由于血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾,一級(jí)LC-MS聯(lián)用分析,也難以準(zhǔn)確進(jìn)行。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道,大多用放射性受體測(cè)定法或同位數(shù)標(biāo)記法測(cè)定,難以廣泛應(yīng)用。經(jīng)比較試驗(yàn),本文建立了液相色譜-串聯(lián)四極質(zhì)譜聯(lián)用的SRM方法,靈敏度高、專屬性強(qiáng)。所以,血漿樣品僅經(jīng)1次乙酸乙酯液-液萃取的預(yù)處理,并經(jīng)HPLC分離除去主要內(nèi)源性干擾后,即可由串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行專屬檢測(cè)。選擇甲醇-0.25%醋酸銨溶液(85∶15)為流動(dòng)相,不僅使內(nèi)源性雜質(zhì)較早出峰,而且由于甲醇比例較高,使ESI噴