一種微型角毛藻的分離鑒定

一種微型角毛藻的分離鑒定

1浮游植物的種類、生物學和浮游學小型浮游植物（粒度為2.20m）是海洋環(huán)境上的主要初級生產者，占海洋初始工業(yè)的很大一部分。特別是在盲水域，小型浮游植物可占初始工業(yè)的80%以上，顆粒層結構上的小型浮游植物對初始工業(yè)的貢獻相對較大。角毛藻屬于硅藻門(Bacillariophyta)、中心綱(Centriae)、盒形藻目(Biddulphiales)、角毛藻科(Chaetoceroceae)、角毛藻屬(Chaetoceros)。培養(yǎng)種類有牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、鈣質角毛藻[Chaetoceroscalcitrans(Paulsen)Takana]、纖細角毛藻(Chaetocerosgracilis)等,它們都是生長在海中的浮游微藻,細胞小,細胞壁薄,大多數是單個細胞,也有數個細胞集成群體的。殼面呈橢圓形或圓形,中間略突起,少數較平坦。殼環(huán)面呈長方形至四角形。殼環(huán)帶不明顯,角毛細而長,末端尖。培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)常有變化,細胞中間膨大,角毛縮短或消失,繁殖方式一般為無性的二分裂繁殖。環(huán)境不良時可形成休眠孢子。角毛藻屬耐高溫種類,適合在夏季培養(yǎng),是雙殼貝類,海參,海膽甲殼類等幼體的優(yōu)質餌料,角毛藻作為一種經濟藻類有十分廣闊的前景。微型角毛藻是指粒徑為2~20μm的角毛藻屬的藻類,目前對其系統(tǒng)的研究較少,研究較多的主要是作為餌料的種類,如牟氏角毛藻和纖細角毛藻,它們是對蝦、海膽、海參等養(yǎng)殖品種的優(yōu)質餌料。以前對浮游植物的分類學研究主要依靠形態(tài)學手段,但形態(tài)學的鑒定有諸多不足之處。首先,形態(tài)學的鑒定需要有經驗豐富的專業(yè)工作人員,而且工作量大;其次,生物的形態(tài)學特征有時會因環(huán)境的變化而改變,形態(tài)學鑒定無法解決這一難題。分子生物學分類方法以核酸序列的差異為分類依據,由于核酸序列在遺傳上的穩(wěn)定性要大大高于形態(tài)學特征,避免了環(huán)境因素造成的細微外觀差異引起的錯誤判斷,解決了依賴主觀判斷而存在的困擾,因而在近年來得到了廣泛的應用。本實驗從天然海水中分離到一種微型硅藻,借助光鏡和電鏡技術,初步判斷為角毛藻,進一步利用5.8SrDNA-ITS和18SrDNA序列的擴增和分析,對這株藻進行了分類鑒定。2實驗材料和方法2.1材料表面2.1.1有限稀釋法本實驗所用藻株C.sp.qd分離于青島太平角海域(36°02′N,120°20′E)。分離方法為96孔板有限稀釋法。藻株培養(yǎng)于不加硅的F/2培養(yǎng)基上,培養(yǎng)溫度為24℃,明暗時間比為12h∶12h,光照度為1300lx。2.1.2dnapurificicici本體系統(tǒng)和試劑凝膠回收試劑盒(AgaroseGelDNAPurificationKit)購自TakaRa公司,Taq酶等PCR試劑購自MBI公司,其他試劑為分析純。2.2方法2.2.1微生物濾膜富集使用96孔板分離培養(yǎng)的方法,從天然海水中純化微藻,利用500目篩絹和0.8μm微孔濾膜富集細胞大小為1~20μm的微藻,并在微藻放入f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)至適宜濃度。血球計數板計算密度,根據密度將藻液稀釋到每200μL含有1~2個單藻,并把它們分到96孔板中,定期鏡檢,直到100倍油鏡下觀察藻細胞形態(tài)一致即純化成功。2.2.2有明膠膜的制備用1.5mLEP管取1mL處于對數生長期的藻細胞,按1000r/min離心10min收集藻體,加1ml1%戊二醛固定2~3h,按1000r/m離心10min,用0.1mol/dm3的磷酸緩沖液漂洗3次,然后依次用30%,50%,70%,90%,100%的乙醇進行逐級脫水,用吸管將含有樣品的乙醇溶液滴在有明膠膜的蓋玻片上,可防止細胞被沖走,用臨界點干燥法干燥,用離子濺射鍍膜法鍍膜。2.2.3藻體水分含量測定用1.5mLEP管取1mL處于對數生長期的藻細胞,按1000r/min離心收集藻體,加500μL濃鹽酸,水浴煮沸20~30min,加高錳酸鉀溶液少許,靜置24h,加草酸褪色,水洗至中性,用銅網直接蘸取少許樣品,靜置片刻,用吸水紙吸去多余的水分,干燥后觀察。1.2.4藻細胞研磨液取角毛藻對數生長期的藻細胞3×106個/mL,5000r/min離心5min,收集藻細胞。將藻細胞于液氮中研磨后轉入1.5mL離心管。使用TIANGEN植物總DNA試劑盒(TIANGENBiotechBeijing)提取基因組DNA,操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。2.2.5pcr擴增產物根據NCBI數據庫中硅藻18S序列設計引物,PCR擴增18S序列;根據已測序的18S序列設計ITS-5.8SrDNA的正向引物,根據相關硅藻的ITS序列設計反向引物。PCR擴增包含5.8SrDNA在內的ITS1和ITS2片段、18SrDNA末端保守序列和28SrDNA前端保守序列,由上海博尚公司合成。實驗所涉及引物見表1。2.2.6外循環(huán)PCR擴增條件:94℃預變性5min;94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸2min,30個循環(huán);72℃延伸5min。PCR擴增結果用1%瓊脂糖進行電泳檢測。2.2.7質粒載體pmd18-t將PCR產物用TaKaRa凝膠回收試劑盒(AgaroseGelDNAPurificationKit)回收后再用T4DNA連接酶將目標片段連接到質粒載體PMD18-T上,轉入細菌DH5α,由北京華大生物公司測序。2.2.8角毛藻遺傳分析結果在NCBI服務器上用NucleotideBlast進行同源檢測,證實所得的序列為ITS1,ITS2,5.8SrDNA以及部分18SrDNA,28SrDNA區(qū)域。將測得的序列和其他角毛藻5.8SrDNA-ITS序列(來自GenBank)用計算機軟件進行序列對齊排序、系統(tǒng)進化樹構建、遺傳距離值計算分析。用ClustalX1.83進行多序列對位分析。采用MEGA3.1分別采用NJ法、ME法和UPGMA法建樹,用Kimura2-parameter計算遺傳距離值,重復1000次計算bootstrap值。3結果與討論3.1角毛藻屬的藻類從100倍油鏡下可看到此藻細胞體呈正方形(見圖1a),細胞長(7.78±1.99)μm,寬(5.44±1.67)μm,在細胞體四角各有一角毛,角毛長度為(16.11±2.42)μm。具有多個貼壁的色素體。細胞獨立生活,不連成群體。在光鏡下偶可觀察到脫殼的細胞體及細胞殼(見圖1b),透明狀的為脫下的細胞殼,還帶有角毛結構,陀螺狀的為脫殼后的藻細胞,已看不到角毛結構。此細胞可能為環(huán)境不良時形成的休眠孢子。在掃描電鏡下觀察到較完整的細胞(見圖1c),細胞呈圓柱形,環(huán)面觀近似正方形,細胞表面光滑,殼面觀呈橢圓形,殼面兩端邊緣各有兩條角毛,角毛基部隆起。還觀察到脫殼的細胞體,呈近似陀螺狀,形狀與在光鏡下看到的相符(見圖1d)。細胞中部有一環(huán)狀突起,細胞上部呈橢球形,下部呈陀螺狀。也可觀察到脫下的細胞殼(見圖1e),可見細胞壁較薄,細胞內容物已消失。圖1f為透射電鏡下觀察到得較完整的細胞,可見致密的細胞體。由于透射電鏡處理方法要用到濃鹽酸,離心后細胞基本已破碎,很難觀察到完整的細胞,由圖可看到細胞體并無明顯骨架結構。角毛呈網狀的硅質骨架結構,基部較中部致密(見圖1j)。每隔0.5μm左右有一互生的刺狀突起,頂端呈錐狀(見圖1g,i)。頂部放大觀察可分辨出網狀骨架主干呈螺旋狀,延伸至頂端(如圖1i)。從以上光鏡照片和電鏡照片可初步推斷此藻株為角毛藻屬的藻類。根據形態(tài)特征初步將這株藻命名為Chaetoceros.sp.qd。3.21c.sp.qd的檢測對角毛藻的基因組DNA使用自行設計的硅藻門的18SrDNA特異性引物,經過PCR擴增得到的目的片段,經過1%瓊脂糖電泳分析,DNA片段為1700bp左右。由測序結果得知C.sp.qd的18S序列部分長度為1623bp。GC含量為46.58%,使用NucleotideBlast將所測序列與NCBI數據庫中的序列進行比對分析,得到C.sp.qd與ChaetocerosgracilisstrainUTEXLB2375的18SrDNA相似值最高,達到99%。3.3c.sp.qd的5.8srdna-同源性比對對角毛藻的基因組DNA使用角毛藻屬的5.8SrDNA-ITS區(qū)的特異引物,經過PCR擴增得到的目的片段,經過1%瓊脂糖電泳分析,DNA片段為1100bp左右。5.8SrDNA-ITS測序后,C.sp.qd的ITS的序列長度為1083bp。去掉部分18SrDNA和28SrDNA序列,5.8SrDNA-ITS的序列總長度為837bp。將C.sp.qd的5.8SrDNA-ITS序列與從Genbank獲取的所有相關角毛藻的5.8SrDNA-ITS序列進行比較(表2)。可以發(fā)現角毛藻屬的不同種在5.8SrDNA-ITS的總長度、5.8S長度、ITS1,ITS2長度等在基本性狀上都有差異。5.8SrDNA-ITS的總長度變化是698~810bp,而本藻種5.8SrDNA-ITS區(qū)比已知角毛藻屬的種類更長,達到837bp。5.8S區(qū)域的長度是157~160bp,ITS1區(qū)域的長度是281~331bp,ITS2區(qū)域的長度是260~324bp,其中本種與已知角毛藻屬物種在ITS2區(qū)的長度差別最大,比角毛藻屬的其他種類最長的ITS2區(qū)還長36bp,這顯示此種與已知角毛屬其他種類有較大差異。2.4種方法所建的進化樹的親緣關系利用表2所列出的13株角毛藻5.8SrDNA-ITS序列,以CetrariaodontellacountryFinland(AF228304)5.8SrDNA-ITS序列為外群,用MEGA3.1軟件按照三種方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,分別為NJ法(見圖2),ME法和UPGMA法,用三種方法所建的進化樹樹形幾乎完全相同,而且在每個主要節(jié)點都有很高的支持率。用三種方法所建的進化樹中C.sp.qd都不與所有已知的角毛藻屬的種類聚群,并且在較早的進化階段就獨立分支,節(jié)點支持率分別為86(NJ樹)、79(ME樹)、99(UPGMA樹),支持率都很高。為進一步分析此種與其他屬內角毛藻種的親緣關系,將所有角毛藻序列和外群藻種使用MEGA3.1計算它們之間的遺傳距離值。從表3可以看出C.sp.qd與已知序列的12種角毛藻的遺傳距離為0.315~0.483,與已知角毛藻屬的種類遺傳距離較大,而所有已知序列的12種角毛藻屬內不同種間的遺傳距離為0.007~0.476。角毛藻屬和同是盒形藻科不同屬的齒狀藻屬之間的遺傳距離值為0.703~0.783。4討論4.1細胞培養(yǎng)藻breatocarlo從形態(tài)學上觀察,此藻種為單細胞生長,并不像一般的角毛藻那樣連成長鏈,如扭鏈角毛藻(Chaetocerostortissimus)、遠距角毛藻(Chaetocerosdistans)、短孢角毛藻(Chaetocerosbrevis)等。細胞較小,只有5~7μm,根據Rogerson等對纖細角毛藻(Chaetocerosgracilis)的研究,此藻種與纖細角毛藻外形相近,光鏡下無法區(qū)分。Rogerson等對纖細角毛藻的角毛結構進行了分析,其中螺旋狀的硅質骨架和互生的小刺與C.sp.qd相似,但螺旋和小刺的形狀與本種也有差別,從照片可清楚地看到本種螺旋狀的骨架,骨架之間有橫隔相連,形成小孔結構(見圖1),從纖細角毛藻的照片可看到小孔結構呈螺旋狀排列,并沒有觀察到骨架結構(見圖1h),本種的小刺形狀短而鈍,而纖細角毛藻的尖而長,呈三角形(見圖1g,h)。此外由于文中沒有對細胞表面結構進行描述,無法進行比較,因此無法確定C.sp.qd是否是纖細角毛藻。4.2sahs-sarst將C.sp.qd的5.8SrDNA-ITS序列與從Genbank獲取的所有相關角毛藻的5.8SrDNA-ITS序列進行比較(見表2),可以發(fā)現角毛藻屬的不同種在5.8SrDNA-ITS的總長度、5.8S的長度、ITS1,ITS2的長度等基本性狀上都存在差異。5.8SrDNA-ITS的總長度是698~810bp,而本藻種5.8SrDNA-ITS區(qū)比已知角毛藻屬的種類更長,達837bp。5.8S區(qū)域的長度是157~160bp,ITS1區(qū)域的長度是281~331bp,ITS2區(qū)域的長度是260~324bp,其中C.sp.qd與已知角毛藻種在ITS2區(qū)差別最大,比所有角毛藻屬內其他種類最長的ITS2區(qū)還長36bp。這顯示此種與角毛藻屬內其他種類有較大差異,并且本種與纖細角毛藻在ITS區(qū)的差別也比較大(見表2),總長度比Chaetocerosgracilis長46bp,比ChaetocerosgracilisstrainUTEXLB2375和ChaetocerosgracilisstrainUTEXLB2658長27bp,特別在ITS2區(qū),比Chaetocerosgracilis長36bp,比ChaetocerosgracilisstrainUTEXLB2375和ChaetocerosgracilisstrainUTEXLB2658長41bp。通過BLAST比對可知,與本種最接近的是Chaetocerosgracilis,相似度達到99%,但覆蓋度僅為59%,主要位于5.8S區(qū),在ITS區(qū)相似度不高,證明與纖細角毛藻差別較大。ITS區(qū)長度和比對結果表明此種可能是一新的角毛藻屬物種。通過三種方法進行系統(tǒng)進化樹的構建,分析得出的結果一致,均顯示C.sp.qd比較特殊,不與已知的角毛藻聚群,在進化的早期就已經獨立分支,并且分支節(jié)點的支持率都很高,此結果也支持此藻種為角毛藻屬內一新種。進一步分析遺傳距離分析可知角毛藻屬內種間的遺傳距離為0.007~0.476,角毛藻屬與同屬盒形