第十章 DNA的生物合成 Chapter 10 Biosynthesis of DNA61課件

第十章DNA的生物合成

Chapter10

BiosynthesisofDNADNA復(fù)制的特點(diǎn)DNA復(fù)制的條件DNA生物合成過程DNA的損傷與修復(fù)第十章DNA的生物合成

Chapter10B1教學(xué)目的:1.掌握DNA復(fù)制的特點(diǎn)2.了解DNA復(fù)制的條件3.掌握DNA的生物合成過程4.了解DNA的損傷與修復(fù)教學(xué)重點(diǎn)難點(diǎn):DNA復(fù)制的特點(diǎn)DNA的生物合成過程教學(xué)課時(shí)：2教學(xué)目的:2DNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的長鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。生物體的遺傳信息就貯存在DNA的四種脫氧核糖核酸的排列順序中。

DNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的長鏈大分子，是遺傳信息的攜3DNA通過復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子，從而決定生物的表現(xiàn)型。DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程就構(gòu)成了遺傳學(xué)的中心法則。

在RNA病毒中，其遺傳信息貯存在RNA分子中。因此，在這些生物體中，遺傳信息的流向是RNA通過復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，通過反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給DNA，再由DNA通過轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的流向就稱為反中心法則。

DNA通過復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，將4DNAdependentDNApolymerase——DDDPDNAdependentRNApolymerase——DDRPRNAdependentRNApolymerase——RDRPRNAdependentDNApolymerase——RDDPDNAdependentDNApolymerase——5第一節(jié)DNA復(fù)制的特點(diǎn)

一、半保留復(fù)制

DNA在復(fù)制時(shí)，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNA，每個(gè)子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)。

第一節(jié)DNA復(fù)制的特點(diǎn)一、半保留復(fù)制6DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的實(shí)驗(yàn)所證明。該實(shí)驗(yàn)首先將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作密度梯度離心，可得到下列結(jié)果：

DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M.Mesel7二、有一定的復(fù)制起始點(diǎn)DNA在復(fù)制時(shí)，需在特定的位點(diǎn)起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點(diǎn)（復(fù)制子）。在原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)通常為一個(gè)，而在真核生物中則為多個(gè)。

二、有一定的復(fù)制起始點(diǎn)8三、需要引物

參與DNA復(fù)制的DNA聚合酶，必須以一段具有3’端自由羥基（3’-OH）的RNA作為引物(primer)，才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為10個(gè)核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。

三、需要引物9四、雙向復(fù)制DNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。

四、雙向復(fù)制10五、半不連續(xù)復(fù)制由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈的方向必須為3'→5'。因此，分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時(shí)的方式是不同的。五、半不連續(xù)復(fù)制11以3'→5'方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方向?yàn)?'→3'，這一條鏈被稱為領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)。而以5'→3'方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是5'→3'，這條鏈被稱為隨從鏈(laggingstrand)。以3'→5'方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是12由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開的，因此，隨從鏈的合成也是一段一段的。DNA在復(fù)制時(shí)，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazakifragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。

由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開的，因此，隨從鏈的合成也13第二節(jié)DNA復(fù)制的條件

一、底物以四種脫氧核糖核酸(deoxynucleotidetriphosphate)為底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。

(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi

第二節(jié)DNA復(fù)制的條件一、底物14二、模板(template)DNA復(fù)制是模板依賴性的，必須要以親代DNA鏈作為模板。親代DNA的兩股鏈解開后，可分別作為模板進(jìn)行復(fù)制。

二、模板(template)15三、引發(fā)體和RNA引物引發(fā)體(primosome)由引發(fā)前體與引物酶（primase）組裝而成。引發(fā)前體是由若干蛋白因子聚合而成的復(fù)合體。在原核生物中，引發(fā)前體至少由六種蛋白因子構(gòu)成。蛋白i、蛋白n、蛋白n”、蛋白dnaC與引物預(yù)合成有關(guān)，蛋白n’與蛋白dnaB與識(shí)別復(fù)制起始點(diǎn)有關(guān)，并具有ATPase活性。引物酶本質(zhì)上是一種依賴DNA的RNA聚合酶（DDRP），該酶以DNA為模板，聚合一段RNA短鏈引物(primer)，以提供自由的3'-OH，使子代DNA鏈能夠開始聚合。

三、引發(fā)體和RNA引物16四、DNA聚合酶(DDDP)（一）種類和生理功能：在原核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有三種，分別命名為DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ），DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ），DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ），這三種酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。參與DNA復(fù)制的主要是polⅢ和polⅠ。

四、DNA聚合酶(DDDP)（一）種類和生理功能：17polⅠ為單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì),可被特異的蛋白酶水解為兩個(gè)片段，其中的大片段稱為Klenowfragment，具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶的活性。

polⅠ為單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì),可被特異的蛋白酶水解為兩18polⅢ由十種亞基組成，其中α亞基具有5'→3'聚合DNA的酶活性，因而具有復(fù)制DNA的功能；而ε亞基具有3'→5'外切酶的活性，因而與DNA復(fù)制的校正功能有關(guān)。

polⅢ由十種亞基組成，其中α亞基具有5'→3'聚合DNA19

原核生物中的三種DNA聚合酶

原核生物中的三種DNA聚合酶

20在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有五種，分別命名為DNA聚合酶α（polα），DNA聚合酶β（polβ），DNA聚合酶γ（polγ），DNA聚合酶δ（polδ），DNA聚合酶ε（polε）。其中，參與染色體DNA復(fù)制的是polα（延長隨從鏈）和polδ（延長領(lǐng)頭鏈），參與線粒體DNA復(fù)制的是polγ，polε與DNA損傷修復(fù)、校讀和填補(bǔ)缺口有關(guān)，polβ只在其他聚合酶無活性時(shí)才發(fā)揮作用。

在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有五種，分別命名為DNA21（二）DNA復(fù)制的保真性：為了保證遺傳的穩(wěn)定，DNA的復(fù)制必須具有高保真性。DNA復(fù)制時(shí)的保真性主要與下列因素有關(guān)：1．遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；2．DNA聚合酶在復(fù)制時(shí)對堿基的正確選擇；3．對復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤及時(shí)進(jìn)行校正。

（二）DNA復(fù)制的保真性：22五、DNA連接酶DNA連接酶(DNAligase)可催化兩段DNA片段之間磷酸二酯鍵的形成，而使兩段DNA連接起來。五、DNA連接酶23DNA連接酶催化的條件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈?zhǔn)峭暾?；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。DNA連接酶催化的條件是：①需一段DNA片段具有3'-OH24六、單鏈DNA結(jié)合蛋白單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDP）。這是一些能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。其作用為：①使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復(fù)制子代DNA；②保護(hù)單鏈DNA，避免核酸酶的降解。

六、單鏈DNA結(jié)合蛋白25七、解螺旋酶解螺旋酶（unwindingenzyme），又稱解鏈酶或rep蛋白，是用于解開DNA雙鏈的酶蛋白，每解開一對堿基，需消耗兩分子ATP。目前發(fā)現(xiàn)存在至少存在兩種解螺旋酶。

七、解螺旋酶26八、拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ可使DNA雙鏈中的一條鏈切斷，松開雙螺旋后再將DNA鏈連接起來，從而避免出現(xiàn)鏈的纏繞。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ可切斷DNA雙鏈，使DNA的超螺旋松解后，再將其連接起來。大腸桿菌拓樸異構(gòu)酶Ⅰ的結(jié)構(gòu)八、拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)大腸桿菌拓樸異構(gòu)27第三節(jié)DNA生物合成過程

一、復(fù)制的起始DNA復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。

（一）預(yù)引發(fā)：1．解旋解鏈，形成復(fù)制叉：由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。DNA復(fù)制時(shí)，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。

第三節(jié)DNA生物合成過程一、復(fù)制的起始282．引發(fā)體組裝：由蛋白因子（如dnaB等）識(shí)別復(fù)制起始點(diǎn)，并與其他蛋白因子以及引物酶一起組裝形成引發(fā)體。

2．引發(fā)體組裝：29（二）引發(fā)：在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3'端自由羥基（3'-OH）。

（二）引發(fā)：30二、復(fù)制的延長

（一）聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以3'→5'方向的親代DNA鏈為模板，從5'→3'方向聚合子代DNA鏈。在原核生物中，參與DNA復(fù)制延長的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延長隨從鏈)和δ（延長領(lǐng)頭鏈）。

二、復(fù)制的延長（一）聚合子代DNA：31（二）引發(fā)體移動(dòng)：引發(fā)體向前移動(dòng)，解開新的局部雙螺旋，形成新的復(fù)制叉，隨從鏈重新合成RNA引物，繼續(xù)進(jìn)行鏈的延長。

（二）引發(fā)體移動(dòng)：32第十章DNA的生物合成Chapter10BiosynthesisofDNA61課件33三、復(fù)制的終止

（一）去除引物，填補(bǔ)缺口：在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ來水解去除RNA引物，并由該酶催化延長引物缺口處的DNA，直到剩下最后一個(gè)磷酸酯鍵的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一種特殊的核酸酶來水解，而岡崎片段仍由DNA聚合酶來延長。

三、復(fù)制的終止（一）去除引物，填補(bǔ)缺口：34（二）連接岡崎片段：在DNA連接酶的催化下，形成最后一個(gè)磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的DNA長鏈。

（二）連接岡崎片段：35（三）真核生物端粒的形成：端粒（telomere）是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。其共同的結(jié)構(gòu)特征是由一些富含G、C的短重復(fù)序列構(gòu)成，可重復(fù)數(shù)十次至數(shù)百次。

（三）真核生物端粒的形成：36線性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進(jìn)行延長反應(yīng)。端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它可以其RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄過程對末端DNA鏈進(jìn)行延長。

線性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)37端粒酶(telomerase)的作用機(jī)制端粒酶(telomerase)的作用機(jī)制38第四節(jié)DNA的損傷與修復(fù)

一、DNA的損傷（突變）

由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的任何異常的改變稱為DNA的損傷，也稱為突變（mutation）。常見的DNA的損傷包括堿基脫落、堿基修飾、交聯(lián)，鏈的斷裂，重組等。

第四節(jié)DNA的損傷與修復(fù)一、DNA的損傷（突變）39（一）引起突變的因素：1．自發(fā)因素：(1)自發(fā)脫堿基：由于N-糖苷鍵的自發(fā)斷裂，引起嘌呤或嘧啶堿基的脫落。每日可達(dá)近萬個(gè)核苷酸殘基。(2)自發(fā)脫氨基：胞嘧啶自發(fā)脫氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自發(fā)脫氨基可生成次黃嘌呤。每日可達(dá)幾十到幾百個(gè)核苷酸殘基。(3)復(fù)制錯(cuò)配：由于復(fù)制時(shí)堿基配對錯(cuò)誤引起的損傷，發(fā)生頻率較低。

（一）引起突變的因素：402．物理因素：由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA損傷。其中，X射線和電離輻射常常引起DNA鏈的斷裂，而紫外線常常引起嘧啶二聚體的形成，如TT，TC，CC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價(jià)鍵連接的環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而會(huì)引起復(fù)制障礙。

2．物理因素：413．化學(xué)因素：

(1)脫氨劑：如亞硝酸與亞硝酸鹽，可加速C脫氨基生成U，A脫氨基生成I。

3．化學(xué)因素：42

(2)烷基化劑：這是一類帶有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起堿基或磷酸基的烷基化，甚至可引起鄰近堿基的交聯(lián)。

(3)DNA加合劑：如苯并芘，在體內(nèi)代謝后生成四羥苯并芘，與嘌呤共價(jià)結(jié)合引起損傷。

(4)堿基類似物：如5-FU，6-MP等，可摻入到DNA分子中引起損傷或突變。

(5)斷鏈劑：如過氧化物，含巰基化合物等，可引起DNA鏈的斷裂。

(2)烷基化劑：這是一類帶有活性烷基的化合物，可提供43（二）DNA突變的類型：

（二）DNA突變的類型：44堿基的轉(zhuǎn)換堿基的轉(zhuǎn)換45（三）DNA突變的效應(yīng)：

1．同義突變：基因突變導(dǎo)致mRNA暗碼子第三位堿基的改變但不引起暗碼子意義的改變，其翻譯產(chǎn)物中的氨基酸殘基順序不變，但有時(shí)可引起翻譯效率降低。

2．誤義突變：基因突變導(dǎo)致mRNA暗碼子堿基被置換，其意義發(fā)生改變，翻譯產(chǎn)物中的氨基酸殘基順序發(fā)生改變。

3．無義突變：基因突變導(dǎo)致mRNA暗碼子堿基被置換而改變成終止暗碼子，引起多肽鏈合成的終止。

4．移碼突變：基因突變導(dǎo)致mRNA暗碼子堿基被置換，引起突變點(diǎn)之后的氨基酸殘基順序全部發(fā)生改變。

（三）DNA突變的效應(yīng)：46二、DNA損傷的修復(fù)

DNA損傷的修復(fù)方式可分為直接修復(fù)和取代修復(fù)兩大類。

二、DNA損傷的修復(fù)DNA損傷的修復(fù)方式可分為直接修復(fù)和取47（一）直接修復(fù)：

1．光復(fù)活：（lightrepairing）：這是一種廣泛存在的修復(fù)作用。光復(fù)活能夠修復(fù)任何嘧啶二聚體的損傷。其修復(fù)過程為：光復(fù)活酶（photo-lyase)識(shí)別嘧啶二聚體并與之結(jié)合形成復(fù)合物→在300～600nm可見光照射下，酶獲得能量，將嘧啶二聚體的丁酰環(huán)打開，使之完全修復(fù)→光復(fù)活酶從DNA上解離。

（一）直接修復(fù)：48

2．轉(zhuǎn)甲基作用：在轉(zhuǎn)甲基酶的催化下，將DNA上的被修飾的甲基去除。此時(shí)，轉(zhuǎn)甲基酶自身被甲基化而失活。

3．直接連接：DNA斷裂形成的缺口，可以在DNA連接酶的催化下，直接進(jìn)行連接而封閉缺口。

2．轉(zhuǎn)甲基作用：49（二）取代修復(fù)：1．切除修復(fù)(excisionrepairing)：這也是一種廣泛存在的修復(fù)機(jī)制，可適用于多種DNA損傷的修復(fù)。該修復(fù)機(jī)制可以分別由兩種不同的酶來發(fā)動(dòng)，一種是核酸內(nèi)切酶，另一種是DNA糖苷酶。

（二）取代修復(fù)：50第十章DNA的生物合成Chapter10BiosynthesisofDNA61課件51

2．重組修復(fù)(recombinationrepairing)：這是DNA的復(fù)制過程中所采用的一種有差錯(cuò)的修復(fù)方式。

2．重組修復(fù)(recombinationrepairi52

3．SOS修復(fù)：這是一種在DNA分子受到較大范圍損傷并且使復(fù)制受到抑制時(shí)出現(xiàn)的修復(fù)機(jī)制，以SOS借喻細(xì)胞處于危急狀態(tài)。DNA分子受到長片段高密度損傷，使DNA復(fù)制過程在損傷部位受到抑制。

損傷誘導(dǎo)一種特異性較低的新的DNA聚合酶，以及重組酶等的產(chǎn)生。

由這些特異性較低的酶繼續(xù)催化損傷部位DNA的復(fù)制，復(fù)制完成后，保留許多錯(cuò)誤的堿基，從而造成突變。

3．SOS修復(fù)：53第十章DNA的生物合成Chapter10BiosynthesisofDNA61課件54JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y07JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+BI9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7