基于藥用植物杜鵑菌根研究的思考

基于藥用植物杜鵑菌根研究的思考

杜鵑花是杜鵑科的一種植物。杜鵑花枝葉繁茂，美麗多變。自古以來，有一個(gè)“荷花即西方，芙蓉和母親”的美麗風(fēng)景，具有很高的裝飾和園林應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)又是我國傳統(tǒng)花卉,具有廣闊的應(yīng)用前景。植物內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物能產(chǎn)生抗癌物質(zhì),促進(jìn)植物生長,增強(qiáng)宿主植物的競(jìng)爭(zhēng)力和抗逆性,在醫(yī)藥、植物生長促進(jìn)劑、生物農(nóng)藥等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊,近年來其應(yīng)用研究已成為一大熱點(diǎn)。杜鵑花科大多數(shù)植物根系與一些真菌在自然生境下形成內(nèi)生菌根結(jié)構(gòu),即杜鵑花類菌根(ericoidmycorrhiza,ERM),亦稱為歐石楠類菌根,簡(jiǎn)稱杜鵑菌根,是指杜鵑花科幾個(gè)屬植物根系上形成的菌根,是內(nèi)生菌根中的一個(gè)特殊類型,在杜鵑花類植物的生長發(fā)育中扮演著重要角色。杜鵑花屬植物多自然分布于高山大嶺、深壑幽谷之中,對(duì)生態(tài)環(huán)境要求較嚴(yán),尤其高溫是制約其園林應(yīng)用的重要限制因子,致使許多優(yōu)良的杜鵑花品種還沒有得到廣泛的園林綠化應(yīng)用。同時(shí),隨著全球生態(tài)環(huán)境的日趨惡化和溫室效應(yīng)的加劇,更是對(duì)杜鵑花的生存提出了前所未有的挑戰(zhàn)。遷地保育已成為21世紀(jì)生物多樣性的重要議題。但是近來許多研究報(bào)道菌根真菌對(duì)促進(jìn)杜鵑生長發(fā)育,增強(qiáng)杜鵑抗逆性起很大作用。故此,開展杜鵑菌根研究不僅對(duì)杜鵑花的園林應(yīng)用具有重要價(jià)值,同時(shí)對(duì)其物種的多樣性保育也具有重要意義。1erm真菌的多樣性目前國內(nèi)外報(bào)道的杜鵑花類菌根主要包括5個(gè)屬共7種菌,并且杜鵑菌根真菌的研究都大部分集中在子囊菌(Hymenoscyphusericae)及其與寄主的相互作用上。許多杜鵑內(nèi)生真菌的鑒定研究表明杜鵑真菌具有豐富的生物多樣性;為杜鵑菌根真菌的研究提供了最基本的保證。之前認(rèn)為杜鵑根部只有范圍相對(duì)狹窄的子囊菌類真菌或近緣類菌,如Rhizoscyphusericae。但是,最近發(fā)現(xiàn)杜鵑根部和更多的子囊菌類真菌和一些擔(dān)子菌類真菌都有共生關(guān)系。彩萼石楠(Callunavulgaris)的菌根真菌來自石楠灌叢/本地赤松林灌木層,并且森林下層杜鵑灌木叢與多種子囊菌類和擔(dān)子菌類包括典型的外生擔(dān)子菌真菌都有共生關(guān)系。最近研究還觀察到多種真菌類群生長在Abernethy地區(qū)的Callunavulgaris和Vacciniummyrtillus的毛根中,都說明了ERM真菌的生物多樣性。劉振華利用形態(tài)學(xué)方法結(jié)合rDNAITS序列分析鑒定得到4種杜鵑花類菌根真菌Phialocephalafortinii、Oidiodendronmaius、MeliniomycesVariabilis、Cryptosporiopsisericae和兩種Epacridrootendophyte或其近緣種Callunavulgarisrootassociatedfungus、Epacrispulchellarootassociatedfungus。用形態(tài)學(xué)方法和分子技術(shù)分析從Callunavulgaris分離的ERM真菌發(fā)現(xiàn)有很高的遺傳多樣性。并且運(yùn)用DGGE技術(shù)研究灰背杜鵑菌根真菌,分離得到Hymenoscyphusericae。其中MeliniomycesVariabilis和Hymenoscyphusericae在我國杜鵑花菌根真菌研究中均為首次發(fā)現(xiàn)。張春英從4個(gè)云錦杜鵑自然群落的根樣中共分離280個(gè)菌株,分為17個(gè)類型,幼苗接種實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中9個(gè)類型檢測(cè)到幼根毛根表皮細(xì)胞內(nèi)形成了典型的ERM菌絲團(tuán)結(jié)構(gòu),確認(rèn)為ERM真菌;5個(gè)類型(OidiodendronmaiusBarron及4個(gè)不同的Epacrisrootassociatedfungus類菌株)為其他ERM植物的菌根真菌同源或近緣類型;2個(gè)(Cladosporiumcladosporioides和fungalsp.R27)菌株類型為ERM真菌新類型;2個(gè)(CryptosporiopsisericaeSiglersp.novl和PhialocephalafluminisShearer,JLCrane&MAMill.)類型的菌株首次合成了ERM菌根。研究表明澳州杜鵑(Rhododendronlochiae)不僅是在熱帶雨林分布廣泛,而且寄生在這一物種的菌根真菌有杜鵑花類菌根形成的隔離群。通過序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)子囊菌綱柔膜菌目的真菌種類在銀葉杜鵑和繁花杜鵑花根部中出現(xiàn)的相對(duì)頻率很高。其中R.Ericaeaggregate和樹粉孢屬的Oidiodendronmaius分布最廣泛,研究的也最多。蠟殼耳目真菌也是存在于銀葉杜鵑和繁花杜鵑根部的真菌。生境或寄主植物不同,其共生真菌存在較大差異,同時(shí)也說明了杜鵑根系內(nèi)生菌的多樣性是比較豐富的,且具有各自不同的內(nèi)生真菌群落特征。2脅迫對(duì)帶著及其穩(wěn)定性的影響杜鵑內(nèi)生菌根真菌可以經(jīng)受和適應(yīng)環(huán)境脅迫并通過減少這些脅迫對(duì)寄主植物的影響來增強(qiáng)寄主的適應(yīng)性,促進(jìn)杜鵑的生長發(fā)育,使杜鵑能在惡劣環(huán)境中存活。2.1云錦松茸苗和接種苗生長狀況于芳等在云錦杜鵑菌根真菌接種技術(shù)及其效應(yīng)研究中從野生云錦杜鵑根系中分離得到4種菌株,對(duì)杜鵑苗進(jìn)行接種后,發(fā)現(xiàn)無菌條件下4種菌株對(duì)云錦杜鵑幼苗的苗高、葉片數(shù)、主根數(shù)、根長、葉綠素、干重及總生物量均有顯著的促進(jìn)效應(yīng)。Jansa等從幾種宿主植物Ericales(Vaccinium,Calluna,Rhododendron,Empetrum,etc.)中分離ERM真菌并用于接種,發(fā)現(xiàn)所有的接種苗沒有表現(xiàn)出任何負(fù)效應(yīng),約10%的真菌對(duì)基質(zhì)栽培的杜鵑扦插苗表現(xiàn)為正效應(yīng)。尹麗娟從不同自然生境的云錦杜鵑根系里分離出來的5株菌根真菌都能促進(jìn)云錦杜鵑幼苗的生長,即使在無N源培養(yǎng)基中,接種苗生長狀況都較其他菌株接種苗和非接種苗好。張春英等從云錦杜鵑中分離出15個(gè)ERM菌株并接種到云錦杜鵑幼苗中,發(fā)現(xiàn)這15個(gè)供試菌株均對(duì)云錦杜鵑接種幼苗的生長表現(xiàn)為積極的正效應(yīng)。但不同的菌株對(duì)云錦杜鵑幼苗的生長促進(jìn)效應(yīng)差異明顯。在土壤營養(yǎng)貧瘠的石楠灌叢生態(tài)系統(tǒng)中,ERM菌根會(huì)促進(jìn)頑固有機(jī)氮和磷的吸收。各氮源培養(yǎng)基上,ERM菌株接種幼苗生長均優(yōu)于非接種苗,ERM能增加云錦杜鵑對(duì)氮源的吸收,尤其是硝態(tài)氮和有機(jī)氮的吸收。大田實(shí)驗(yàn)表明,給Calluna接種的杜鵑菌根在施了2年氨態(tài)氮后的侵染率并沒有改變多少,表明杜鵑菌根可能可以利用多種氮源。還有研究表明接種RhizoscyphusEricae增加了蔓越橘吸收硝態(tài)氮的能力,接種真菌的蔓越橘對(duì)NO-3吸收動(dòng)力是沒有接種的8倍之多。并且,通過同位素標(biāo)記法,真菌中的15N過10min后便在枝梢被檢測(cè)到說明真菌很迅速把某種物質(zhì)分泌到植物中。杜鵑花類菌根真菌能夠促進(jìn)杜鵑花科植物營養(yǎng)吸收有3個(gè)原因:①菌根擴(kuò)大了杜鵑根部與土壤的接觸面積;②推測(cè)云錦杜鵑根內(nèi)真菌有類似固氮菌的作用,能把不能利用的硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為容易吸收的其他N源形式;③ERM真菌能產(chǎn)生許多水解和氧化的酶類,如蛋白酶、纖維素酶、半纖維素降解酶、幾丁質(zhì)酶和磷酸酶等。這些酶類可以幫助真菌分解植物細(xì)胞壁以吸收植物殘?bào)w細(xì)胞中的營養(yǎng)物質(zhì),最終使寄主更好地吸收土壤中的有機(jī)氮源和磷源等營養(yǎng)物質(zhì)。2.2erm真菌對(duì)重金屬的抗性能力和對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)汽車尾氣和工業(yè)廢氣都導(dǎo)致大氣中CO2含量和全球溫度的升高。而升高的CO2含量和溫度會(huì)導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)光合作用的增強(qiáng),并且毛根中麥角固醇含量與生態(tài)系統(tǒng)光合作用成正相關(guān),麥角固醇是可判斷真菌生物量的指示物質(zhì),所以升高的CO2含量和溫度使得杜鵑菌根侵染率更高。高侵染率對(duì)于幫助植物抵抗環(huán)境脅迫具有重要意義。玉米中叢枝菌根(AM)共生體顯著提高了作物葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率,與無菌根植物對(duì)比,菌根植物在高溫下細(xì)胞間的CO2濃度更低,PSⅡ光化學(xué)的最大熒光量子效率更高和更高的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。并且,菌根植物擁有更高的水使用效率、持水能力和相對(duì)水含量。適宜溫度下非AM植物葉片的磷含量高于AM植物,但是高溫脅迫下AM植物葉片磷含量更高,長勢(shì)也更好。杜鵑內(nèi)生真菌本身具有很強(qiáng)的抵抗水分脅迫的能力,并且可能在寄主抵抗水分脅迫時(shí)起作用,但還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。內(nèi)生真菌對(duì)重金屬的抵抗使得杜鵑菌根植物,能夠?qū)χ亟饘佼a(chǎn)生抵抗力。杜鵑花科植物常成為在重金屬污染嚴(yán)重的地區(qū)的主要植被,這一現(xiàn)象引起了人們對(duì)杜鵑及其內(nèi)生真菌對(duì)重金屬耐受能力的研究興趣。研究表明無論金屬銅的來源地的狀態(tài)是什么,杜鵑菌根植物能抗金屬銅。這說明這些杜鵑菌根植物本質(zhì)上就能抗銅。但無法辨明是杜鵑自身具有抗金屬的作用還是杜鵑真菌能幫助寄主植物抗銅使得寄主可以移植在銅污染地區(qū)或是兩者的相互作用。而且獲得存活在重金屬污染環(huán)境的生理適應(yīng)能力的途徑還不清楚,可能是因?yàn)楹薪Y(jié)合金屬使其失活的酶或細(xì)胞膜能耐受氧自由基的氧化或也許能產(chǎn)生有毒金屬的解毒蛋白。隨著分子技術(shù)如表達(dá)差異技術(shù)的發(fā)展,能發(fā)現(xiàn)脅迫和非脅迫條件下誘導(dǎo)的基本表達(dá)差異,然后對(duì)比敏感和遲鈍生態(tài)型的基因表達(dá)差異。研究表明高濃度重金屬基質(zhì)會(huì)影響其中生長的ERM真菌的基因表達(dá)。許多只帶有菌根結(jié)構(gòu)的杜鵑植物能夠在有毒金屬如鋁和具氧化還原活性金屬如鐵和錳含量很高的酸性土壤中生長,說明菌根真菌自身能夠并且可幫助寄主杜鵑植物生長在重污染土壤中。環(huán)境脅迫可能影響ERM真菌基因的表達(dá),研究表明所有檢測(cè)的ERM真菌功能基因的核苷酸序列多型性都很高。然而,從多礦石地區(qū)和工業(yè)污染地區(qū)分離的ERM真菌在Cu和ZnSOD(superoxidedismutase)啟動(dòng)子區(qū)域有更高的多型性,意味著環(huán)境脅迫可能影響Sod1位點(diǎn)特殊區(qū)域的突變率。并且在ERM真菌培養(yǎng)基中也檢測(cè)到Cu和ZnSOD酶的存在。分離自鋅、鈣和鋁污染地區(qū)的Oidondendronmaius真菌用不同濃度的鋅液體培養(yǎng)基處理,分析分泌到培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)有核酸酶、蛋白酶和SOD,并且一定范圍內(nèi)培養(yǎng)基中Zn2+濃度越高,ERM真菌細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外基質(zhì)中的SOD酶的活性也越高。雖然某些ERM真菌在無菌培養(yǎng)的生長過程中能明顯檢測(cè)到SOD酶、蛋白酶、核酸酶的存在,但是并不能夠說明ERM真菌是如何分泌的和如何幫助寄主抵抗金屬毒性的。但還沒有足夠有力的證據(jù)能夠說明ERM的作用機(jī)制。關(guān)于過氧化物酶是否是ERM真菌產(chǎn)生的或是由自由基產(chǎn)生的假陽性結(jié)果還需要進(jìn)一步論證。一些真菌物種能產(chǎn)生有機(jī)酸,部分解釋了杜鵑真菌共生體促進(jìn)金屬磷酸鹽溶解的原因。研究表明,杜鵑共生菌對(duì)杜鵑植物在高磷酸鹽如磷酸鋅、磷酸鈣和磷酸鐵的環(huán)境中生長很關(guān)鍵。但是杜鵑內(nèi)生真菌對(duì)磷酸鹽的吸收也不是絕對(duì)的,如杜鵑共生菌對(duì)磷酸鋅的吸收就與生長基質(zhì)的營養(yǎng)狀況有關(guān),特別是與N源和C源的濃度有關(guān)系。許多ERM真菌基本上能使含不同有毒金屬(Cd、Cu、Al、Fe、Pb和Zn)的礦物質(zhì)溶解。不同的真菌物種對(duì)不同的礦物質(zhì)的抗金屬能力和溶解金屬能力不同。即使是相同的物種,例如,外生菌根真菌Suillusluteus的鋅和鈣的耐受力不同。實(shí)驗(yàn)中有很多干擾因素,如pH、金屬的脅迫濃度和植物菌株的來源地等。不同來源地的植物和真菌對(duì)脅迫的響應(yīng)也有所不同,來自污染地區(qū)的真菌具有更強(qiáng)的分泌草酸的能力和促進(jìn)難溶金屬物溶解的能力。這些都與菌根對(duì)金屬的適應(yīng)能力有很大關(guān)系,使得很難判定一個(gè)菌種抗重金屬能力的強(qiáng)弱,對(duì)于其抗性機(jī)理的研究更是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。對(duì)于ERM真菌對(duì)有毒金屬的抗性機(jī)理還沒有確切的研究證明。目前推測(cè)有幾種可能性:①ERM真菌能固定和結(jié)合有毒金屬,使有毒金屬失去活性;②ERM真菌能分泌有毒金屬的解毒蛋白;③有毒金屬物質(zhì)被分隔到特殊組織中,不參與杜鵑的生長代謝過程;④ERM真菌能分泌多種酶類,這些酶類可以促進(jìn)對(duì)重金屬的吸收和轉(zhuǎn)化。3erm真菌增加鋼絞線對(duì)土壤的影響由于人類對(duì)大自然的干涉,很多地區(qū)的環(huán)境迅速惡化,有的地區(qū)甚至寸草不生。礦業(yè)、礦物氣味、石油提煉、優(yōu)質(zhì)化工廠、工程業(yè)、能源產(chǎn)業(yè)、排污排泥、汽車業(yè)等都導(dǎo)致大范圍的金屬污染。在污染地區(qū)混雜的混合物里經(jīng)常發(fā)現(xiàn)金屬和有機(jī)復(fù)合物。污染氣體如NOx、SOx和NH4對(duì)菌根的影響沒有土壤污染那么直接(除植物損壞外),但是它們導(dǎo)致土壤酸化,因此固定金屬(鋁、鐵和錳)和阻礙有機(jī)物質(zhì)的降解導(dǎo)致酚類物的堆積。杜鵑優(yōu)于其他物種能夠在重金屬污染的惡劣環(huán)境下存活,這很大一部分原因是因?yàn)槎霹N內(nèi)生真菌有促進(jìn)杜鵑生長發(fā)育,提高杜鵑抗性的作用。但是目前為止,關(guān)于ERM真菌增加寄主抗性的作用機(jī)制還不清楚,且不同ERM真菌對(duì)寄主的侵染率有很大差異,對(duì)增加寄主抗性的能力也有很大區(qū)別,同一菌種但來源地不同的研究結(jié)果也不同。這可能也是導(dǎo)致ERM