一種抗豬半乳糖

一種抗豬半乳糖

解決人類(lèi)器官缺陷的有效方法是找到異質(zhì)器官的替代品。豬的器官與人類(lèi)器官的解剖和生理結(jié)構(gòu)相似，因此成為異質(zhì)器官的首選。然而，豬心血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的異質(zhì)異體——gal-1和3-gal-3-gal可與人體預(yù)存的自然抗體結(jié)合，導(dǎo)致過(guò)急性排泄反應(yīng)（hyperative，har）。阻止自然抗體與豬表面成形物之間的異質(zhì)異體——gal-1的結(jié)合是避免har發(fā)生的有效方法。采用xcx15的特定菌場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)，選擇具有特定菌場(chǎng)b-b的抗b單胞菌（mab抗b），因?yàn)楝F(xiàn)在無(wú)法獲得和提取人類(lèi)的自然抗體，所以mab-b可以與gal-1或3-gal中的異質(zhì)異體結(jié)合。因此，理論上可認(rèn)為它們具有類(lèi)似的功能。然后，我們進(jìn)行了陽(yáng)性反射性食菌體酶聯(lián)誘導(dǎo)反應(yīng)（elisa）、陽(yáng)性食菌體和洗脫劑蜜二糖的競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)。陽(yáng)性食菌體克隆抑制了豬紅細(xì)胞的凝集活性，并在插入唾液中測(cè)定了捐贈(zèng)者序列的南宋菌。1材料和方法1.1抗菌活性抗體噬菌體M13隨機(jī)17肽庫(kù)(XCX15,庫(kù)容量為1×109,具有抗四環(huán)素活性)、E.colikank91宿主菌(具有抗卡那霉素的活性)以及HRP-兔抗M13抗體由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所王克夷研究員及李家大博士惠贈(zèng).抗B型血單克隆抗體(mABanti-B滴度1∶128)由長(zhǎng)春生物制品研究所博德公司購(gòu)入.蜜二糖(melibiose)、西非單葉豆凝集素(GS-I-B4)為Sigma公司產(chǎn)品.聚乙二醇(PEG8000)為上海生工生物工程有限公司的產(chǎn)品.1.2方法1.2.1噬菌體的篩選、分離、篩選和tp-lb平板以mABanti-B包被96孔酶標(biāo)板,4℃過(guò)夜.BSA封閉后,用TBST洗板3次,加入適當(dāng)稀釋的肽庫(kù)擴(kuò)增液與mABanti-B結(jié)合1h.用TBST洗板數(shù)次.每孔加入100μl的100g/L蜜二糖洗脫液,室溫洗脫1h.收集這100μl洗脫液,從中取出10μl,用LB培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后轉(zhuǎn)染感受態(tài)kank91,涂LB平板.培養(yǎng)后計(jì)算菌落數(shù)來(lái)測(cè)定洗脫液中噬菌體的滴度(output).其余90μl洗脫液轉(zhuǎn)染感受態(tài)kank91后投入LB培養(yǎng)液中,振搖擴(kuò)增過(guò)夜,經(jīng)離心,沉淀,純化后用于下一輪的篩選.同時(shí),投入進(jìn)行篩選的原始噬菌體肽庫(kù)也通過(guò)稀釋、轉(zhuǎn)染,涂板法測(cè)定出滴度(input).用output/input就可以計(jì)算出特異性結(jié)合噬菌體的產(chǎn)出.按上述步驟篩選4個(gè)循環(huán).從第4次篩出的噬菌體LB平板中隨機(jī)挑取分隔清晰的噬菌斑,制備噬菌體原液,用于ELISA的檢測(cè).1.2.2tmb顯色劑實(shí)驗(yàn)用100μl/孔的mABanti-B(滴度1∶128)包被96孔酶標(biāo)板,4℃過(guò)夜.50g/LBSA室溫封閉2h,用5mmol/L的TBS緩沖液洗板3次后,加入50μl噬菌體原液和50μlTBS緩沖液的混合液(同時(shí)以?xún)H加入100μlTBS緩沖液作為空白對(duì)照),室溫下,脫色搖床50r/min結(jié)合1h.用0.1%TBST洗板3次后,加入100μl/孔的HRP-兔抗M13抗體,室溫下,脫色搖床50r/min結(jié)合1h.用TBST洗板10次,TBS洗板2次后,立即加入TMB顯色劑顯色,于450nm讀取吸光度值(A450).1.2.3bsa抑制率測(cè)定用100μl/孔的mABanti-B(滴度1∶128)包被96孔酶標(biāo)板,4℃過(guò)夜.50g/LBSA室溫封閉2h,用5mmol/L的TBS緩沖液洗板3次后,加入的ELISA液為不同濃度蜜二糖與噬菌體原液的混合液100μl.以下步驟同前.計(jì)算出抑制率=(A450-A′450)/A450×100%.A450為未加蜜二糖的吸光度,A′450為加入蜜二糖的吸光度.1.2.4紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)先把制備好的2%新鮮(壓積比)紅細(xì)胞懸浮在pH=7.4的磷酸緩沖液中備用.在血凝板上,40μl陽(yáng)性克隆用磷酸緩沖液依次逐孔倍比稀釋后,每孔分別加入40μl適當(dāng)稀釋的A型血人血清和40μl2%的豬紅細(xì)胞.然后將此120μl混合液在室溫下先用震蕩器震蕩1min,再靜置1h后觀察凝集結(jié)果.如果紅細(xì)胞沉淀到孔的底部,呈一邊緣光滑的圓點(diǎn),則為沒(méi)有凝集.如果紅細(xì)胞形成一網(wǎng)絡(luò),并不下沉到孔底呈一邊緣光滑的圓點(diǎn),則為出現(xiàn)凝集.試驗(yàn)需設(shè)空白、陽(yáng)性及陰性對(duì)照.1.2.5積極克隆抑制gs-i-b4和豬紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)操作上同試驗(yàn)1.2.4,唯一不同處是由人血清替換為2mg/L的GS-I-B4.1.2.6全自動(dòng)測(cè)序檢測(cè)挑選ELISA結(jié)果最好的4個(gè)陽(yáng)性克隆,感染宿主菌.37℃振蕩培養(yǎng)后,按《分子克隆》的方法用酚抽提出M13噬菌體的單鏈DNA,進(jìn)行全自動(dòng)測(cè)序.2結(jié)果2.1tmt洗板的篩選總共篩選了4輪,其中1,2兩輪用0.1%(吐溫與TBS溶液的體積比)TBST洗板,3,4兩輪分別用0.2%和0.5%TBST洗板.篩選結(jié)果顯示,雖然洗板的強(qiáng)度在逐漸加大,但淘洗后的噬菌體產(chǎn)率反有逐漸上升的趨勢(shì).可見(jiàn)與mABanti-B結(jié)合的噬菌體已被從原始肽庫(kù)中篩選出來(lái)了.2.2elisa法測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果從第4輪洗脫下來(lái)的噬菌體轉(zhuǎn)染E.colikank91宿主菌后,稀釋后涂LB平板,從平板中隨機(jī)挑選了50個(gè)分隔良好的噬菌斑,制備噬菌體原液,用ELISA法測(cè)定.由于儀器限制,50個(gè)克隆只能分批完成.為了排除各批次ELISA實(shí)驗(yàn)的偶然誤差,使結(jié)果有可比性,挑出ELISA結(jié)果最好的5個(gè)克隆又重新轉(zhuǎn)染E.colikank91,擴(kuò)增后制備成新鮮原液進(jìn)行ELISA.結(jié)果見(jiàn)圖1(空白對(duì)照A450為0).從以上的結(jié)果可知,篩選出的陽(yáng)性克隆A450均大于0.4,特別是35號(hào)噬菌體的A450約為1.5,明確提示能與mABanti-B特異性地結(jié)合.2.3蜜二糖的陽(yáng)性克隆為了進(jìn)一步鑒定陽(yáng)性克隆是否特異性地結(jié)合在蜜二糖和mABanti-B結(jié)合的位點(diǎn),挑取出結(jié)果最好的35號(hào)陽(yáng)性克隆(以下血凝試驗(yàn)均用此陽(yáng)性克隆)做了6個(gè)蜜二糖濃度競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn).為了減少隨機(jī)誤差,每個(gè)蜜二糖濃度做了5個(gè)對(duì)照,平均抑制率與濃度關(guān)系見(jiàn)圖2.從圖2可見(jiàn),蜜二糖能非常好地抑制mABanti-B與陽(yáng)性克隆的結(jié)合,低達(dá)0.003mmol/L的濃度就可以看出作用,這說(shuō)明了陽(yáng)性克隆很可能就結(jié)合在蜜二糖與mABanti-B結(jié)合的位點(diǎn).而蜜二糖已被確認(rèn)能與人預(yù)存的天然抗體結(jié)合(圖3B,C),故此陽(yáng)性克隆活性區(qū)域的空間構(gòu)象亦可能具有與蜜二糖結(jié)構(gòu)相似的功能.2.4蜜二糖抑制豬紅細(xì)胞凝集的試驗(yàn)為了進(jìn)一步驗(yàn)證此陽(yáng)性克隆是否真正具有生物學(xué)活性,我們作了陽(yáng)性克隆抑制A型人血清與豬紅細(xì)胞的凝集反應(yīng).在圖3中,A1～A3為空白對(duì)照,用40μl豬紅細(xì)胞和磷酸緩沖液混勻后靜置1h,紅細(xì)胞沉于底部,聚集于一點(diǎn),此結(jié)果為未出現(xiàn)凝集.A4～A6為陽(yáng)性對(duì)照,用40μl磷酸緩沖液稀釋60倍的A型人血清和40μl豬紅細(xì)胞混勻后靜置1h,紅細(xì)胞形成一網(wǎng)絡(luò),沒(méi)有下沉到孔底呈一邊緣光滑的圓點(diǎn),此結(jié)果為出現(xiàn)凝集.B,C兩條均為蜜二糖抑制豬紅細(xì)胞凝集的試驗(yàn)結(jié)果,即1～6孔分別用磷酸緩沖液倍比稀釋蜜二糖,使蜜二糖的濃度形成600mmol/L,300mmol/L,150mmol/L,75.5mmol/L,37.75mmol/L,18.875mmol/L的梯度,然后每孔分別各加入40μl磷酸緩沖液稀釋60倍的A型人血清和40μl豬紅細(xì)胞混勻后靜置1h.從中可見(jiàn)低達(dá)18.875mmol/L濃度的蜜二糖就能夠抑制豬紅細(xì)胞凝集.D,E兩條均為陽(yáng)性克隆抑制豬紅細(xì)胞凝集的試驗(yàn)結(jié)果,即1～6孔分別用磷酸緩沖液倍比稀釋一定濃度的陽(yáng)性克隆,然后每孔分別各加入40μl磷酸緩沖液稀釋60倍的A型人血清和40μl2%豬紅細(xì)胞混勻后靜置1h,前三孔能抑制紅細(xì)胞的凝集,后三孔由于濃度稀釋對(duì)紅細(xì)胞的凝集抑制作用不完全.F,G兩條均為陰性克隆不能抑制豬紅細(xì)胞凝集的試驗(yàn)結(jié)果,1～6孔分別用磷酸緩沖液倍比稀釋一定濃度的此陰性克隆,然后每孔分別各加入40μl磷酸緩沖液稀釋60倍的A型人血清和40μl2%豬紅細(xì)胞混勻后靜置1h,陰性克隆不能抑制A型血人血清對(duì)豬紅細(xì)胞的凝集.綜合以上的結(jié)果認(rèn)為:此陽(yáng)性克隆預(yù)先能與A型人血清中的抗Gal-α-1,3-Gal抗體結(jié)合,并使之失活.這樣抗體就不能再與豬紅細(xì)胞上的Gal-α-1,3-Gal抗原結(jié)合,從而使豬紅細(xì)胞凝集起來(lái).這表明,此陽(yáng)性克隆可作為人天然抗體的阻斷劑,預(yù)防異種器官移植時(shí)的超急性排斥反應(yīng).2.5陽(yáng)性克隆對(duì)gs-i-b4凝集反應(yīng)的影響GS-I-B4亦能與Gal-α-1,3-Gal特異性地結(jié)合,為進(jìn)一步驗(yàn)證陽(yáng)性克隆是特異性結(jié)合在天然抗體與豬抗原結(jié)合的部位,而不是由于結(jié)合在天然抗體的其余部位產(chǎn)生變構(gòu)效應(yīng)得到的結(jié)果,同時(shí)也為了排除試驗(yàn)2.4結(jié)果的偶然性,我們又加做了陽(yáng)性克隆抑制GS-I-B4與豬紅細(xì)胞的凝集反應(yīng).在圖4中,A1,A2兩孔為空白對(duì)照,A3,A4兩孔為陽(yáng)性對(duì)照,操作分別同圖3的A1～A3和A4～A6.圖4的B～G各條在操作上與圖3的B～G各條相對(duì)應(yīng),唯一不同處是由人血清替換為2mg/L的GS-I-B4.分析結(jié)果可見(jiàn),此陽(yáng)性克隆不僅可抑制豬抗原Gal-α-1,3-Gal與天然抗體的結(jié)合,也可抑制豬抗原表位Gal-α-1,3-Gal與凝集素GS-I-B4的結(jié)合.說(shuō)明陽(yáng)性克隆能特異性結(jié)合在天然抗體與豬抗原表位結(jié)合的部位,而起到競(jìng)爭(zhēng)性抑制豬紅細(xì)胞凝集的作用.2.6關(guān)于screnshh34個(gè)克隆的結(jié)果上述35號(hào)陽(yáng)性克隆測(cè)序后,得到插入小肽序列為CCWLLRQPVRFVRSIRS,即為半胱氨酸-半胱氨酸-色氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-谷氨酸-脯氨酸-纈氨酸-精氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-精氨酸-絲氨酸.同時(shí)我們又測(cè)了圖1中A450結(jié)果較好的另外3個(gè)克隆,序列分別為SCVINSSTNZRLCNQLT,DCPWALAWSRASCWNKP,KCRSLGPKRQLTARARD.此4個(gè)克隆中,有3個(gè)具有二硫鍵結(jié)構(gòu).我們考慮這是由于二硫鍵能極大地加強(qiáng)此小肽空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)固性.由于測(cè)序個(gè)數(shù)有限,所以序列之間的同源性相對(duì)不明顯.3噬菌體的再發(fā)現(xiàn)和重組噬菌體展示技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)用絲狀噬菌體展示外源肽的一項(xiàng)新技術(shù).具體是利用基因工程手段,將合成的一組一定長(zhǎng)度的隨機(jī)序列寡核苷酸片段克隆到特定表達(dá)載體中,使其表達(dá)產(chǎn)物以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在絲狀噬菌體表面.由于肽庫(kù)中包含了該長(zhǎng)度多肽的所有可能的氨基酸序列或其中的絕大部分,每一個(gè)噬菌體呈現(xiàn)其中的一種肽段,因而庫(kù)容量極大,易于篩選和擴(kuò)增.用此噬菌體肽庫(kù)(噬菌體的個(gè)數(shù)必須大于109,才有篩選意義)與靶蛋白混合后,洗板.如果噬菌體上的外殼蛋白能與靶蛋白結(jié)合,就不會(huì)被洗掉.最后用酸或親和洗脫液把噬菌體洗脫下來(lái).連續(xù)這樣篩3～4輪,就能篩出與靶蛋白結(jié)合力較強(qiáng)的噬菌體,測(cè)此噬菌體的DNA序列可得到重組寡核苷酸的序列,亦知道了相應(yīng)多肽的序列.以后用基因工程或組合化學(xué)就可大量擴(kuò)增.此方法可探索受體與配體之間相互作用的結(jié)合位點(diǎn),尋求高親和力生物學(xué)活性的配體分子,以及探索未知蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)表位,因而在蛋白質(zhì)分子相互作用的研究,新型疫苗的研制,以及藥物的開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景.目前已經(jīng)廣泛用于癌癥、解毒、抗過(guò)敏、愛(ài)滋病、心血管病、移植等領(lǐng)域的藥物篩選和開(kāi)發(fā),并已篩選出大量的受體拮抗劑、酶抑制劑.一些很有希望的藥物先導(dǎo)化合物已經(jīng)進(jìn)入臨床前期研究,不久將進(jìn)入臨床試驗(yàn).本研究中,應(yīng)用ELISA和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)四輪親和篩選所獲的噬菌體能特異性地與mABanti-B結(jié)合,并且這種結(jié)合可被蜜二糖所競(jìng)爭(zhēng)抑制,抑制率高達(dá)86.9%.由此推測(cè),篩選到的噬菌體很可能就結(jié)合在蜜二糖與mABanti-B結(jié)合的位點(diǎn).同時(shí),我們進(jìn)行了陽(yáng)性噬菌體克隆的抑制豬