一種抗豬半乳糖

一種抗豬半乳糖

解決人類器官缺陷的有效方法是找到異質(zhì)器官的替代品。豬的器官與人類器官的解剖和生理結(jié)構(gòu)相似，因此成為異質(zhì)器官的首選。然而，豬心血管內(nèi)皮細胞表面的異質(zhì)異體——gal-1和3-gal-3-gal可與人體預(yù)存的自然抗體結(jié)合，導(dǎo)致過急性排泄反應(yīng)（hyperative，har）。阻止自然抗體與豬表面成形物之間的異質(zhì)異體——gal-1的結(jié)合是避免har發(fā)生的有效方法。采用xcx15的特定菌場檢測技術(shù)，選擇具有特定菌場b-b的抗b單胞菌（mab抗b），因為現(xiàn)在無法獲得和提取人類的自然抗體，所以mab-b可以與gal-1或3-gal中的異質(zhì)異體結(jié)合。因此，理論上可認為它們具有類似的功能。然后，我們進行了陽性反射性食菌體酶聯(lián)誘導(dǎo)反應(yīng)（elisa）、陽性食菌體和洗脫劑蜜二糖的競爭試驗。陽性食菌體克隆抑制了豬紅細胞的凝集活性，并在插入唾液中測定了捐贈者序列的南宋菌。1材料和方法1.1抗菌活性抗體噬菌體M13隨機17肽庫(XCX15,庫容量為1×109,具有抗四環(huán)素活性)、E.colikank91宿主菌(具有抗卡那霉素的活性)以及HRP-兔抗M13抗體由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所王克夷研究員及李家大博士惠贈.抗B型血單克隆抗體(mABanti-B滴度1∶128)由長春生物制品研究所博德公司購入.蜜二糖(melibiose)、西非單葉豆凝集素(GS-I-B4)為Sigma公司產(chǎn)品.聚乙二醇(PEG8000)為上海生工生物工程有限公司的產(chǎn)品.1.2方法1.2.1噬菌體的篩選、分離、篩選和tp-lb平板以mABanti-B包被96孔酶標板,4℃過夜.BSA封閉后,用TBST洗板3次,加入適當(dāng)稀釋的肽庫擴增液與mABanti-B結(jié)合1h.用TBST洗板數(shù)次.每孔加入100μl的100g/L蜜二糖洗脫液,室溫洗脫1h.收集這100μl洗脫液,從中取出10μl,用LB培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后轉(zhuǎn)染感受態(tài)kank91,涂LB平板.培養(yǎng)后計算菌落數(shù)來測定洗脫液中噬菌體的滴度(output).其余90μl洗脫液轉(zhuǎn)染感受態(tài)kank91后投入LB培養(yǎng)液中,振搖擴增過夜,經(jīng)離心,沉淀,純化后用于下一輪的篩選.同時,投入進行篩選的原始噬菌體肽庫也通過稀釋、轉(zhuǎn)染,涂板法測定出滴度(input).用output/input就可以計算出特異性結(jié)合噬菌體的產(chǎn)出.按上述步驟篩選4個循環(huán).從第4次篩出的噬菌體LB平板中隨機挑取分隔清晰的噬菌斑,制備噬菌體原液,用于ELISA的檢測.1.2.2tmb顯色劑實驗用100μl/孔的mABanti-B(滴度1∶128)包被96孔酶標板,4℃過夜.50g/LBSA室溫封閉2h,用5mmol/L的TBS緩沖液洗板3次后,加入50μl噬菌體原液和50μlTBS緩沖液的混合液(同時以僅加入100μlTBS緩沖液作為空白對照),室溫下,脫色搖床50r/min結(jié)合1h.用0.1%TBST洗板3次后,加入100μl/孔的HRP-兔抗M13抗體,室溫下,脫色搖床50r/min結(jié)合1h.用TBST洗板10次,TBS洗板2次后,立即加入TMB顯色劑顯色,于450nm讀取吸光度值(A450).1.2.3bsa抑制率測定用100μl/孔的mABanti-B(滴度1∶128)包被96孔酶標板,4℃過夜.50g/LBSA室溫封閉2h,用5mmol/L的TBS緩沖液洗板3次后,加入的ELISA液為不同濃度蜜二糖與噬菌體原液的混合液100μl.以下步驟同前.計算出抑制率=(A450-A′450)/A450×100%.A450為未加蜜二糖的吸光度,A′450為加入蜜二糖的吸光度.1.2.4紅細胞凝集試驗先把制備好的2%新鮮(壓積比)紅細胞懸浮在pH=7.4的磷酸緩沖液中備用.在血凝板上,40μl陽性克隆用磷酸緩沖液依次逐孔倍比稀釋后,每孔分別加入40μl適當(dāng)稀釋的A型血人血清和40μl2%的豬紅細胞.然后將此120μl混合液在室溫下先用震蕩器震蕩1min,再靜置1h后觀察凝集結(jié)果.如果紅細胞沉淀到孔的底部,呈一邊緣光滑的圓點,則為沒有凝集.如果紅細胞形成一網(wǎng)絡(luò),并不下沉到孔底呈一邊緣光滑的圓點,則為出現(xiàn)凝集.試驗需設(shè)空白、陽性及陰性對照.1.2.5積極克隆抑制gs-i-b4和豬紅細胞的凝集反應(yīng)操作上同試驗1.2.4,唯一不同處是由人血清替換為2mg/L的GS-I-B4.1.2.6全自動測序檢測挑選ELISA結(jié)果最好的4個陽性克隆,感染宿主菌.37℃振蕩培養(yǎng)后,按《分子克隆》的方法用酚抽提出M13噬菌體的單鏈DNA,進行全自動測序.2結(jié)果2.1tmt洗板的篩選總共篩選了4輪,其中1,2兩輪用0.1%(吐溫與TBS溶液的體積比)TBST洗板,3,4兩輪分別用0.2%和0.5%TBST洗板.篩選結(jié)果顯示,雖然洗板的強度在逐漸加大,但淘洗后的噬菌體產(chǎn)率反有逐漸上升的趨勢.可見與mABanti-B結(jié)合的噬菌體已被從原始肽庫中篩選出來了.2.2elisa法測實驗結(jié)果從第4輪洗脫下來的噬菌體轉(zhuǎn)染E.colikank91宿主菌后,稀釋后涂LB平板,從平板中隨機挑選了50個分隔良好的噬菌斑,制備噬菌體原液,用ELISA法測定.由于儀器限制,50個克隆只能分批完成.為了排除各批次ELISA實驗的偶然誤差,使結(jié)果有可比性,挑出ELISA結(jié)果最好的5個克隆又重新轉(zhuǎn)染E.colikank91,擴增后制備成新鮮原液進行ELISA.結(jié)果見圖1(空白對照A450為0).從以上的結(jié)果可知,篩選出的陽性克隆A450均大于0.4,特別是35號噬菌體的A450約為1.5,明確提示能與mABanti-B特異性地結(jié)合.2.3蜜二糖的陽性克隆為了進一步鑒定陽性克隆是否特異性地結(jié)合在蜜二糖和mABanti-B結(jié)合的位點,挑取出結(jié)果最好的35號陽性克隆(以下血凝試驗均用此陽性克隆)做了6個蜜二糖濃度競爭抑制實驗.為了減少隨機誤差,每個蜜二糖濃度做了5個對照,平均抑制率與濃度關(guān)系見圖2.從圖2可見,蜜二糖能非常好地抑制mABanti-B與陽性克隆的結(jié)合,低達0.003mmol/L的濃度就可以看出作用,這說明了陽性克隆很可能就結(jié)合在蜜二糖與mABanti-B結(jié)合的位點.而蜜二糖已被確認能與人預(yù)存的天然抗體結(jié)合(圖3B,C),故此陽性克隆活性區(qū)域的空間構(gòu)象亦可能具有與蜜二糖結(jié)構(gòu)相似的功能.2.4蜜二糖抑制豬紅細胞凝集的試驗為了進一步驗證此陽性克隆是否真正具有生物學(xué)活性,我們作了陽性克隆抑制A型人血清與豬紅細胞的凝集反應(yīng).在圖3中,A1～A3為空白對照,用40μl豬紅細胞和磷酸緩沖液混勻后靜置1h,紅細胞沉于底部,聚集于一點,此結(jié)果為未出現(xiàn)凝集.A4～A6為陽性對照,用40μl磷酸緩沖液稀釋60倍的A型人血清和40μl豬紅細胞混勻后靜置1h,紅細胞形成一網(wǎng)絡(luò),沒有下沉到孔底呈一邊緣光滑的圓點,此結(jié)果為出現(xiàn)凝集.B,C兩條均為蜜二糖抑制豬紅細胞凝集的試驗結(jié)果,即1～6孔分別用磷酸緩沖液倍比稀釋蜜二糖,使蜜二糖的濃度形成600mmol/L,300mmol/L,150mmol/L,75.5mmol/L,37.75mmol/L,18.875mmol/L的梯度,然后每孔分別各加入40μl磷酸緩沖液稀釋60倍的A型人血清和40μl豬紅細胞混勻后靜置1h.從中可見低達18.875mmol/L濃度的蜜二糖就能夠抑制豬紅細胞凝集.D,E兩條均為陽性克隆抑制豬紅細胞凝集的試驗結(jié)果,即1～6孔分別用磷酸緩沖液倍比稀釋一定濃度的陽性克隆,然后每孔分別各加入40μl磷酸緩沖液稀釋60倍的A型人血清和40μl2%豬紅細胞混勻后靜置1h,前三孔能抑制紅細胞的凝集,后三孔由于濃度稀釋對紅細胞的凝集抑制作用不完全.F,G兩條均為陰性克隆不能抑制豬紅細胞凝集的試驗結(jié)果,1～6孔分別用磷酸緩沖液倍比稀釋一定濃度的此陰性克隆,然后每孔分別各加入40μl磷酸緩沖液稀釋60倍的A型人血清和40μl2%豬紅細胞混勻后靜置1h,陰性克隆不能抑制A型血人血清對豬紅細胞的凝集.綜合以上的結(jié)果認為:此陽性克隆預(yù)先能與A型人血清中的抗Gal-α-1,3-Gal抗體結(jié)合,并使之失活.這樣抗體就不能再與豬紅細胞上的Gal-α-1,3-Gal抗原結(jié)合,從而使豬紅細胞凝集起來.這表明,此陽性克隆可作為人天然抗體的阻斷劑,預(yù)防異種器官移植時的超急性排斥反應(yīng).2.5陽性克隆對gs-i-b4凝集反應(yīng)的影響GS-I-B4亦能與Gal-α-1,3-Gal特異性地結(jié)合,為進一步驗證陽性克隆是特異性結(jié)合在天然抗體與豬抗原結(jié)合的部位,而不是由于結(jié)合在天然抗體的其余部位產(chǎn)生變構(gòu)效應(yīng)得到的結(jié)果,同時也為了排除試驗2.4結(jié)果的偶然性,我們又加做了陽性克隆抑制GS-I-B4與豬紅細胞的凝集反應(yīng).在圖4中,A1,A2兩孔為空白對照,A3,A4兩孔為陽性對照,操作分別同圖3的A1～A3和A4～A6.圖4的B～G各條在操作上與圖3的B～G各條相對應(yīng),唯一不同處是由人血清替換為2mg/L的GS-I-B4.分析結(jié)果可見,此陽性克隆不僅可抑制豬抗原Gal-α-1,3-Gal與天然抗體的結(jié)合,也可抑制豬抗原表位Gal-α-1,3-Gal與凝集素GS-I-B4的結(jié)合.說明陽性克隆能特異性結(jié)合在天然抗體與豬抗原表位結(jié)合的部位,而起到競爭性抑制豬紅細胞凝集的作用.2.6關(guān)于screnshh34個克隆的結(jié)果上述35號陽性克隆測序后,得到插入小肽序列為CCWLLRQPVRFVRSIRS,即為半胱氨酸-半胱氨酸-色氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-谷氨酸-脯氨酸-纈氨酸-精氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-精氨酸-絲氨酸.同時我們又測了圖1中A450結(jié)果較好的另外3個克隆,序列分別為SCVINSSTNZRLCNQLT,DCPWALAWSRASCWNKP,KCRSLGPKRQLTARARD.此4個克隆中,有3個具有二硫鍵結(jié)構(gòu).我們考慮這是由于二硫鍵能極大地加強此小肽空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)固性.由于測序個數(shù)有限,所以序列之間的同源性相對不明顯.3噬菌體的再發(fā)現(xiàn)和重組噬菌體展示技術(shù)是近幾年發(fā)展起來用絲狀噬菌體展示外源肽的一項新技術(shù).具體是利用基因工程手段,將合成的一組一定長度的隨機序列寡核苷酸片段克隆到特定表達載體中,使其表達產(chǎn)物以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在絲狀噬菌體表面.由于肽庫中包含了該長度多肽的所有可能的氨基酸序列或其中的絕大部分,每一個噬菌體呈現(xiàn)其中的一種肽段,因而庫容量極大,易于篩選和擴增.用此噬菌體肽庫(噬菌體的個數(shù)必須大于109,才有篩選意義)與靶蛋白混合后,洗板.如果噬菌體上的外殼蛋白能與靶蛋白結(jié)合,就不會被洗掉.最后用酸或親和洗脫液把噬菌體洗脫下來.連續(xù)這樣篩3～4輪,就能篩出與靶蛋白結(jié)合力較強的噬菌體,測此噬菌體的DNA序列可得到重組寡核苷酸的序列,亦知道了相應(yīng)多肽的序列.以后用基因工程或組合化學(xué)就可大量擴增.此方法可探索受體與配體之間相互作用的結(jié)合位點,尋求高親和力生物學(xué)活性的配體分子,以及探索未知蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)表位,因而在蛋白質(zhì)分子相互作用的研究,新型疫苗的研制,以及藥物的開發(fā)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景.目前已經(jīng)廣泛用于癌癥、解毒、抗過敏、愛滋病、心血管病、移植等領(lǐng)域的藥物篩選和開發(fā),并已篩選出大量的受體拮抗劑、酶抑制劑.一些很有希望的藥物先導(dǎo)化合物已經(jīng)進入臨床前期研究,不久將進入臨床試驗.本研究中,應(yīng)用ELISA和競爭性ELISA檢測結(jié)果顯示,經(jīng)過四輪親和篩選所獲的噬菌體能特異性地與mABanti-B結(jié)合,并且這種結(jié)合可被蜜二糖所競爭抑制,抑制率高達86.9%.由此推測,篩選到的噬菌體很可能就結(jié)合在蜜二糖與mABanti-B結(jié)合的位點.同時,我們進行了陽性噬菌體克隆的抑制豬