應用雙向電泳技術分析的杜鵑葉片蛋白提取方法

應用雙向電泳技術分析的杜鵑葉片蛋白提取方法

杜鵑花是一種美麗的花，花期多變，花期長，觀賞價值很高。中國豐富的野生杜鵑資源。但這些野生品種大多分布在高海拔地區(qū),對生態(tài)環(huán)境要求較嚴,性喜冷涼濕潤氣候,對高溫的忍耐力不強。高溫脅迫是制約其引種馴化和園林利用的主要限制因子。研究杜鵑花屬植物對高溫的適應性及其耐熱機理,對于杜鵑花屬植物的引種和園林應用有著重要的意義。植物受到高溫脅迫會通過產生一系列熱激蛋白來適應這種逆境,利用蛋白質雙向電泳技術可以尋找與杜鵑耐熱性相關的熱激蛋白,將有利于杜鵑花屬植物耐熱性機理的研究。蛋白質提取是雙向電泳的第一步,提取效果的好壞直接影響蛋白質的分離及最后結果的可靠性。提高樣品蛋白質的溶解性并降低蛋白質的損耗和降解,才能獲得更多的蛋白質信息。由于植物葉片本身蛋白含量低,且常含有大量色素、酚類、有機酸、脂類及其他次生代謝產物,這些成分都會干擾葉片蛋白質的提取分離及電泳,而且不同植物材料中的干擾物質也不盡相同。故針對不同的植物常需重新建立有效的蛋白質提取方法和標準化雙向電泳技術體系。Gary等采用酚法成功地進行了山柳葉杜鵑(R.catawbiense)葉片蛋白的提取和雙向電泳分析,本研究預備實驗中,參照Gary等的方法進行映山紅葉片蛋白的提取,但未成功。目前常用的蛋白提取方法主要有TCA-丙酮沉淀法、飽和酚提取法、Tris-HCl法、TCA-丙酮-酚法等,這些制樣方法各有利弊。本實驗在前期預備實驗中參照曾廣娟等的Tris-HCl法對4種杜鵑葉片蛋白進行提取,由于映山紅、滿山紅、馬銀花3種杜鵑在加入蛋白提取緩沖液后均很粘稠,未能成功提取蛋白,故最終選取了TCA-丙酮法、酚法和TCA-丙酮-酚法3種方法對映山紅、馬銀花、滿山紅、云錦杜鵑4種杜鵑花屬植物的蛋白提取方法及雙向電泳結果進行了系統(tǒng)的比較,以建立適合杜鵑花屬植物的雙向電泳蛋白提取方法。1材料和方法1.1材料和試驗材料以常綠杜鵑亞屬的云錦杜鵑(R.fortunei)、馬銀花亞屬的馬銀花(R.ovatum)、映山紅亞屬的映山紅(R.simsii)和滿山紅(R.mariesii)4種杜鵑3年生實生苗為試驗材料。于2013年7月采集4種杜鵑的功能葉,洗凈擦干,液氮速凍,置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2方法1.2.1蛋白及其產物的提取TCA-丙酮法:參照魯?shù)さ鹊姆椒?取凍存的樣品0.5g,加入0.05gPVPP,液氮研磨至細粉后轉入10mL離心管,加10倍體積-20℃預冷的丙酮溶液(含10%TCA和0.1%DTT),-20℃靜置30min,接著冰水超聲5min,-20℃靜置1h后離心(4℃,10000×g,20min),棄上清液,加10倍體積預冷的丙酮溶液(含0.1%DTT),-20℃靜置1h,離心,重復4~5次,至上清無色為止。沉淀經真空干燥后得蛋白干粉,稱重后置于-80℃冰箱保存。酚法:參照Gary等的方法,取凍存的樣品1g,加入0.1gPVPP,液氮研磨成粉狀后,向研缽中加入4mLTris提取液(0.7mol·L-1蔗糖,0.5mol·L-1Tris,50mmol·L-1EDTA,100mmol·L-1KCl,50mmol·L-1DTT,1mmol·L-1PMSF;調pH至8.0),融化后,繼續(xù)研磨數(shù)分鐘,轉至離心管,加入等體積pH8.0Tris-飽和酚,渦漩,離心(10000×g,4℃)20min。取酚層,往酚層中加入5倍體積0.1mol·L-1乙酸銨甲醇溶液,-20℃沉淀過夜。離心(10000×g,4℃)20min,棄上清液,沉淀用-20℃預冷甲醇洗滌1次,再以丙酮(含0.1%DTT,-20℃預冷)洗滌2次,室溫干燥,所得干粉置-80℃保存待用。TCA-丙酮-酚法:參照Wang和楊妮娜的方法。取1g葉片,用TCA-丙酮法提取的干粉,再加入酚法提取緩沖液。接著按照酚法的程序提取蛋白。1.2.3民法典g膠條的制作采用Bio-Rad公司的ProteinIEFcell等電聚焦系統(tǒng)和ProteinIIxicell垂直電泳系統(tǒng)。選用17cm的pH4-7IPG膠條,具體操作步驟參照魯?shù)さ姆椒?。電泳結束后考馬斯亮藍R-250染色。2結果與分析2.1酚法提取葉片蛋白由表1可以看出TCA-丙酮法提得蛋白干粉最多,但是加了蛋白裂解液之后特別粘稠,且蛋白質濃度很低。酚法能提出云錦杜鵑、滿山紅和馬銀花3種杜鵑的葉片蛋白,但沒有提取到映山紅葉片蛋白。4種杜鵑采用TCA-丙酮-酚法均成功得到蛋白質,且提得蛋白質的產量與4種杜鵑葉片研磨后的粘稠度呈負相關,云錦杜鵑、滿山紅、馬銀花3種杜鵑葉片蛋白濃度略低于酚法。2.2酚法和酚法提取蛋白4種杜鵑用TCA-丙酮法提取的葉片蛋白濃度均較低且粘稠,等電聚焦電泳升的極其緩慢,雙向電泳圖譜蛋白質點也比較少,如圖1-A所示,滿山紅的雙向電泳圖譜蛋白質點僅19個,遠遠達不到2-DE分析的要求。其他3種杜鵑的蛋白質提取和雙向電泳結果也存在類似情況。說明杜鵑葉片中的粘稠物質嚴重干擾了蛋白質的有效溶解及離心,導致上樣液中蛋白濃度不足,而不能通過雙向電泳顯示出來。因此,該法完全不適合用于滿山紅等富含粘稠物質的杜鵑葉片蛋白質的提取。酚是一種溫和的變性劑,蛋白質容易進入酚層,這樣可有效去除樣品中的雜質。滿山紅、云錦杜鵑和馬銀花均通過酚法成功提取得到了蛋白,而映山紅在葉片研磨加入蛋白提取液之后非常粘稠,加入酚用醋酸銨甲醇溶液沉淀后未得到蛋白沉淀。滿山紅、云錦杜鵑、馬銀花的2-DE圖譜(圖1-B、E、G)分析得出,滿山紅得到97個點,馬銀花得到159個點,云錦杜鵑得到241個點(表1)。但除了馬銀花,兩外2種杜鵑葉片的2-DE圖譜中均有大量的橫縱條紋?？梢钥闯龇臃ㄝ腿〉鞍啄軌虺ミ@3種杜鵑中的粘稠物質,但對于映山紅這種粘稠物質特多的植物而言并不適合。為改良上述2種方法中的缺陷,故將TCA-丙酮法和酚法結合在一起,先用TCA-丙酮法沉淀蛋白,再接著用酚法萃取,4種杜鵑均成功得到蛋白沉淀。4種杜鵑的雙向電泳圖譜分析得出云錦杜鵑有396個點,顯著高于云錦杜鵑酚法的提取結果;馬銀花得到223個點,滿山紅得到173個點,映山紅得240個點(表1,圖1-C、D、F、H),均高于酚法提取得到的蛋白點。且蛋白點外觀圓潤清晰,明顯減少了橫縱條紋,說明干擾物質明顯減少。故TCA-丙酮-酚法適合上述4種杜鵑蛋白質的提取及雙向電泳。3樣品溶液粘結原因TCA-丙酮法是植物蛋白提取最常用的方法,操作步驟簡單,蛋白粗提物產量大,但TCA-丙酮法提取的蛋白質不易溶解且粘稠,電泳結果中蛋白質數(shù)量相對較少,且容易產生橫紋和縱紋干擾。本實驗中4種杜鵑用該法提得的蛋白溶解度均非常低且粘稠,并且等電聚焦消耗時間長,這可能是上樣液中雜質過多且鹽離子濃度高。過高濃度的鹽離子增加了膠條的導電性,導致電泳的內滲升高,從而導致等電聚焦時電壓不能達到預設值,進而干擾蛋白質的等電聚焦,在雙向電泳圖譜中造成水平方向的紋理。彭存智等認為導致蛋白質樣品溶液粘稠的原因是蛋白質樣品中含有大量的多糖類物質,因為在使用丙酮等有機溶劑沉淀蛋白的同時,多糖類物質也沉淀下來了。多糖類物質可溶于水,從而導致蛋白質樣品溶液粘稠并影響蛋白質的溶解,進而影響了蛋白質樣品的上樣量和電泳的質量。利用多糖類物質不溶于酚相這一特征,可使用飽和酚萃取蛋白,從而除去樣品中的多糖類及其他不溶于酚的物質,但酚法無法有效去除多酚類和鹽類物質。在本實驗中,云錦杜鵑、馬銀花、滿山紅使用酚法成功萃取出蛋白,但得到的蛋白質點均低于TCA-丙酮-酚法,2-DE圖譜橫縱條紋過多。且酚法并不適用于映山紅這種葉片研磨后高度粘稠的植物,可能是由于過于粘稠,導致蛋白無法進入酚相,從而不能成功萃取蛋白。TCA-丙酮-酚法融合了TCA-丙酮沉淀法和酚法優(yōu)點,能夠有效去除干擾物質,在很多植物如竹子、橘子、甘蔗、煙草、松樹、海草、橄欖、蘋果、葡萄等的蛋白提取上都取得了非常好的效果,且2-DE的圖譜背景清晰,蛋白質點多,可廣泛應用于植物的葉片和果實中蛋白質的提取。4種杜鵑使用該法提取蛋白取得了良好的電泳結果,蛋白點清晰且蛋白質點要多于酚法,更重要的是對于映山紅這種研磨液高度粘稠的植物也成功萃取出了蛋白。3種蛋白提取方法的雙向電泳結果分析表明,TCA-丙酮-酚法更適合4種杜鵑的蛋白提取,這與Ana對擬南芥和楊妮娜對銀杏的研究結果是一致的。本實驗選取了4種杜鵑,其中映山紅、滿山紅為紙質葉片且冬季落葉,馬銀花、云錦杜鵑為革質葉片且常綠;馬銀花、滿山紅葉片光滑,映山紅、云錦杜鵑葉片有絨毛;馬銀花、映山紅葉片有部分紅色,云錦杜鵑、滿山紅為綠色,4種杜鵑代表性廣,故可以認為TCA-丙酮-酚法適合于杜鵑屬植物葉片蛋白質的提取。1.2.2上樣液的制備將蛋白質加入裂解液(含7mol·L-1尿素,2mol·L-1硫脲,4%Chaps,1%DT