基因重組與基因工程技術(shù)課件

基因重組與基因工程技術(shù)課件基因重組與基因工程技術(shù)課件

基因工程亦稱(chēng)遺傳工程，即利用DNA重組技術(shù)的方法，把DNA作為組件，在細(xì)胞外將一種外源DNA（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，使外源基因DNA在宿主細(xì)胞中，隨細(xì)胞的繁殖而增殖（cloning，克?。?，或最后得到表達(dá)，最終獲得基因表達(dá)產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀?；蛑亟M技術(shù)作為分子生物學(xué)最重要、最基本的技術(shù)之一，是許多分子生物,生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)施的基礎(chǔ)。基因工程亦稱(chēng)遺傳工程，即利

現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人P·伯格（美國(guó),1926－）在1960年以敏銳的科學(xué)預(yù)見(jiàn)力提出一個(gè)大膽的設(shè)想：是否可以創(chuàng)造出一種人工方法，把外界的遺傳基因引入動(dòng)物體內(nèi)，以達(dá)到改變遺傳性狀和治療某些疾病的需要呢？1972年，伯格把兩種病毒的DNA用同一種限制性?xún)?nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來(lái)，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子，首次實(shí)現(xiàn)兩種不同生物的DNA體外連接，獲得了第一批重組DNA分子，這標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生。伯格因此獲得了1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人P·伯格（美國(guó),1926

1973年，美國(guó)斯坦福大學(xué)教授S·科恩和加州大學(xué)舊金山分校教授H·W·博耶將兩個(gè)不同的質(zhì)粒（一個(gè)是抗四環(huán)素質(zhì)粒，另一個(gè)是抗鏈霉素質(zhì)粒）拼接在一起，組成嵌合質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌，當(dāng)該重組質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌體內(nèi)后，這些大腸桿菌能抵抗兩種藥物，而且這種大腸桿菌的后代都具有雙重抗藥性。這表明“雜合質(zhì)?！痹诖竽c桿菌的細(xì)胞分裂時(shí)也能自我復(fù)制。1973年，美國(guó)斯坦福大學(xué)教授S·科恩和加州大學(xué)舊金科恩隨后以DNA重組技術(shù)發(fā)明人的身份向美國(guó)專(zhuān)利局申報(bào)了世界上第一個(gè)基因工程的技術(shù)專(zhuān)利。這標(biāo)志著自然界不同物種間在億萬(wàn)年中形成的天然屏障被打破了，人類(lèi)可以根據(jù)自己的意愿定向地改造生物的遺傳特性，甚至創(chuàng)造新的生命類(lèi)型。

1977年，吉爾伯特（W·Gilbert）分別將編碼胰島素和干擾素的DNA經(jīng)過(guò)體外重新拼接后，導(dǎo)入大腸桿菌中，分別使大腸桿菌合成了胰島素和干擾素。科恩隨后以DNA重組技術(shù)發(fā)明人的身份向美國(guó)專(zhuān)利局申報(bào)DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞）篩（選陽(yáng)性克?。┍恚ㄟ_(dá)目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線(分)------目的基因及載體的分離需要克隆的DNA片段：化學(xué)合成法

cDNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)目的基因的獲取(分)------目的基因及載體的分離需要克隆的DNA片段：從基因所在生物直接取得--用限制酶剪切供體DNA--用機(jī)械的方法eg超聲波從基因所在生物直接取得化學(xué)合成法人工合成：根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。較短的核酸片段（60-80bp）多肽鏈的氨基酸順序mRNA的堿基排列順序相應(yīng)的基因結(jié)構(gòu)化學(xué)合成目的基因化學(xué)合成法人工合成：多肽鏈的氨基酸順序mRNA的堿基排列順序化學(xué)合成的最大優(yōu)點(diǎn)是可以合成一些分離較困難的基因?；瘜W(xué)合成的不足之處在于：

--要已知基因的核苷酸順序；

--基因不能太大，這一方面是測(cè)定核苷酸（或氨基酸）順序比較困難，另一方面是因?yàn)槊看蝺H能合成幾百ｂｐ的短片段，短片段越多，要連接成正確的基因順序就越困難，得率越低；

--價(jià)格昂貴。用途：PCR引物,測(cè)序引物,定點(diǎn)突變,核酸雜交探針化學(xué)合成的最大優(yōu)點(diǎn)是可以合成一些分離較困難的基因。從基因文庫(kù)中篩選將某一種基因DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因組DNA的種群，稱(chēng)為G文庫(kù)(genomicDNAlibrary)。將某種細(xì)胞的全部mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)合成cDNA，然后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱(chēng)為C-文庫(kù)(cDNAlibrary)。C-文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性。從基因文庫(kù)中篩選將某一種基因DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA構(gòu)建基因文庫(kù)獲取目的基因存在的問(wèn)題——

費(fèi)時(shí)費(fèi)事 內(nèi)含子序列反轉(zhuǎn)錄人工合成互補(bǔ)DNA方法的優(yōu)勢(shì)——獲取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA構(gòu)建基因文庫(kù)獲取目的基因存在的問(wèn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

（polymerasechainreaction,PCR）如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，在體外合成目的基因。但此法可能會(huì)造成克隆的目的基因堿基序列的改變。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

（polymerasechainreac載體DNA的選擇理想載體的基本條件：可轉(zhuǎn)移性,為目的基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。合適的復(fù)制位點(diǎn),為目的基因提供在受體細(xì)胞中的復(fù)制能力或整合能力。多克隆位點(diǎn)：廣泛、特異選擇標(biāo)志，便于篩選和鑒定分子較小，可容納較大的外源DNA載體DNA的選擇理想載體的基本條件：質(zhì)粒噬菌體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體……種類(lèi)：質(zhì)粒種類(lèi)：質(zhì)粒載體的一般結(jié)構(gòu)存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子。具有自我復(fù)制功能。帶有抗性基因及表型識(shí)別等遺傳性標(biāo)記物。經(jīng)改造后具有多克隆位點(diǎn)。質(zhì)粒載體的一般結(jié)構(gòu)存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子?；蛑亟M與基因工程技術(shù)課件DNA重組的基本模式

分（離目的基因）

切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞）篩（選陽(yáng)性克?。┍恚ㄟ_(dá)目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向切------限制性?xún)?nèi)切酶酶切限制性?xún)?nèi)切酶酶切酶切切------限制性?xún)?nèi)切酶酶切限制性?xún)?nèi)切酶酶切酶切載體和目的基因的切斷通常采用限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)，簡(jiǎn)稱(chēng)限制酶，分別對(duì)載體DNA和目的基因進(jìn)行切斷，以便于重組。限制酶目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)400多種，所識(shí)別的順序往往為4-8個(gè)堿基對(duì)，且有回文結(jié)構(gòu)。由限制酶切斷后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三種情況。形成粘性末端(cohesiveend)者較有利于載體DNA和目的基因的重組。載體和目的基因的切斷通常采用限制性核酸內(nèi)切酶(restric酶切--雙酶切：體系：選擇合適的緩沖體系，尤其是雙酶切反應(yīng)中。DNA：經(jīng)過(guò)純化的，盡量不含有蛋白質(zhì)，酒精等雜質(zhì)。時(shí)間：一般為5-7h，載體overnight以保證酶切完全。不能時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以防止內(nèi)切酶的star活性，降低特異性。酶切之后立即回收，小片段用PCR-purificationKit除去，大的片段要用切膠回收去除。酶切T-vectorT-vector兩條鏈的5’端含有一個(gè)游離的TPCR過(guò)程中，普通的Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個(gè)AT-vectorT-vector兩條鏈的5’端含有一個(gè)游離的DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）

接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞）篩（選陽(yáng)性克?。┍恚ㄟ_(dá)目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向接------載體和目的基因的連接（一）粘性末端連接法：當(dāng)載體DNA和目的基因均用同一種限制酶進(jìn)行切斷時(shí)，二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過(guò)粘性末端進(jìn)行互補(bǔ)粘合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。較少的情況下，對(duì)產(chǎn)生的平端也可直接進(jìn)行連接。即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來(lái)，得到重新組合后的DNA分子。接------載體和目的基因的連接（一）粘性末端連接法：即將載體DNA與目的基因的連接載體DNA與目的基因的連接（二）人工接尾法：即同聚物加尾連接法。當(dāng)載體和目的基因無(wú)法采用同一種限制酶進(jìn)行切斷，無(wú)法得到相同得粘性末端時(shí)，可采用此方法。此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的3'-端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通過(guò)堿基互補(bǔ)進(jìn)行粘合，再由DNA連接酶連接。（二）人工接尾法：末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）該酶全稱(chēng)為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它所催化的反應(yīng)與DNApolI相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段為引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。末端轉(zhuǎn)移酶常用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）基因重組與基因工程技術(shù)課件（三）人工接頭連接法：將人工連接器（linker，即一段人工合成的含有多種限制酶切點(diǎn)的小分子DNA片段，約10~20個(gè)核苷酸）連接到平末端DNA分子(載體和目的基因)上，即有可能使用同一種限制酶對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切斷，得到可以互補(bǔ)的粘性末端。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。（三）人工接頭連接法：連接體系的建立：溫度：粘末端連接：12-18℃(16-20hours)

平末端連接：室溫（低于30℃)DNA量：載體分子數(shù)/目的基因分子數(shù)=1：3-5酶量：平端連接時(shí)需加大酶量

連接反應(yīng)體系越小越好，相對(duì)而言，酶切體系稍大較好連接體系的建立：連接失敗后--一步一步向上游檢測(cè)問(wèn)題所在，所以分子克隆部分“留一半”的原則有時(shí)候是很有用的。酶切是否完全，所以要做載體的自連對(duì)照。載體酶切回收是否考慮到切除片段的大小，是否要用切膠回收更保險(xiǎn)。連接失敗后--DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞）篩（選陽(yáng)性克?。┍恚ㄟ_(dá)目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向轉(zhuǎn)------重組體的轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞重組體的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)------重組體的轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞重組體的轉(zhuǎn)化宿主菌或受體細(xì)胞原核系統(tǒng)

--大腸桿菌

--枯草桿菌真核系統(tǒng)

--酵母菌酵母

--昆蟲(chóng)細(xì)胞

--哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主菌或受體細(xì)胞原核系統(tǒng)原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化）

受體細(xì)胞的選擇：限制缺陷型:避免修飾和降解重組缺陷型：避免重組整合轉(zhuǎn)化親和型：較高的可轉(zhuǎn)化性遺傳互補(bǔ)型：利于篩選感染缺陷型：防止感染原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化）受體細(xì)胞的選擇：感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）所謂感受態(tài)，就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（如電擊法，CaCl2等化學(xué)試劑法）的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞（Competentcells）。感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）所謂感受態(tài)，就大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(化學(xué)方法)大腸桿菌細(xì)胞大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞CaCl2處理目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法是CaCl2法,CaCl2

法簡(jiǎn)便易行,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí),可加入占總體積15％的無(wú)菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(化學(xué)方法)大腸桿菌細(xì)胞大腸桿菌感一、受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α單菌落,接種于3-5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右,直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD600＝0.5左右。二、感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10分鐘，然后于4℃下3000g離心10分鐘。棄去上清,用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl2

溶液10ml輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置15-30分鐘后，4℃下3000g離心10分鐘。棄去上清,加入4ml預(yù)冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。感受態(tài)細(xì)胞分裝成200μl的小份,貯存于-70℃可保存半年。感受態(tài)細(xì)胞的制備的操作步驟一、受體菌的培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞的制備的操作步驟

為了提高轉(zhuǎn)化效率,實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度:不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600來(lái)控制。DH5α菌株的OD600為0.5時(shí),細(xì)胞密度在5×107個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。試劑的質(zhì)量:所用的試劑,如CaCl2

等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行,所用器皿,如離心管,tip頭等經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入,為以后的篩選、鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。為了提高轉(zhuǎn)化效率,實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：大腸桿菌細(xì)胞大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞得到噬菌斑或單菌落與重組DNA共同冰浴而后42℃短暫熱刺激CaCl2處理受體細(xì)菌50-100mmol/LCaCl2

感受態(tài)細(xì)菌重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞得到噬菌斑或單菌落與重組DNA從-70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液,室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。加入pBS質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過(guò)50ng,體積不超過(guò)10μl)，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后。42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。向管中加入1mlLB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr)。將上述菌液搖勻后取100μl涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)。計(jì)算轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化的操作步驟從-70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液,室溫下使其解凍，

為了提高轉(zhuǎn)化效率,實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：

用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。當(dāng)所轉(zhuǎn)化的ＤＮＡ很難得時(shí)（如用從相對(duì)難得的樣品中提取mRNA而合成的cDNA),這就顯得格外重要。

一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。對(duì)照實(shí)驗(yàn)為了提高轉(zhuǎn)化效率,實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：E.coli的電穿孔轉(zhuǎn)化：在高壓電場(chǎng)下使細(xì)胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個(gè)穿孔足夠大并可維持足夠的時(shí)間，使外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。這種方法也可用于真核生物的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)化方法E.coli的電穿孔轉(zhuǎn)化：在高壓電場(chǎng)下使細(xì)胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞系統(tǒng)永生細(xì)胞系細(xì)胞特異性的選擇標(biāo)記對(duì)抗某種藥物真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)抗某種藥物電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣。磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)：主要用于動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。將DNA溶液加入到CaCl2中，然后在強(qiáng)烈震蕩下加入由Na2HPO4和NaH2PO4組成的磷酸緩沖液，使溶液產(chǎn)生磷酸鈣沉淀并將DNA包裹在沉淀中。將這些沉淀加入到細(xì)胞中，利用細(xì)胞的胞飲作用將DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中。磷酸鈣一方面可以增加細(xì)胞的通透性，一方面可以避免DNA被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶水解。磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染重組體

+

磷酸鈣微粒內(nèi)吞作用重組體進(jìn)入細(xì)胞大顆粒轉(zhuǎn)染方法電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣。磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染重組基因槍轉(zhuǎn)染法：利用被電場(chǎng)或機(jī)械加速的金屬微粒能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的基本原理，先將DNA溶液與鎢、金等金屬微粒一起保溫，使DNA吸附在金屬微粒表面，隨高速的金屬微粒直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。激光微束穿孔法：利用直徑很小、能量很高的激光束在細(xì)胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA進(jìn)入細(xì)胞。顯微注射法：利用毛細(xì)管直接將DNA注入細(xì)胞內(nèi)。脂質(zhì)體（liposome）介導(dǎo)法：將DNA包裹在人工制備的磷脂雙分子層的膜狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，通過(guò)脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。多聚物介導(dǎo)法：利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚賴(lài)氨酸、多聚鳥(niǎo)氨酸等與二價(jià)陽(yáng)離子、DNA混合形成沉淀顆粒，通過(guò)細(xì)胞的胞飲作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)?；驑屴D(zhuǎn)染法：利用被電場(chǎng)或機(jī)械加速的金屬微粒能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞）

篩（選陽(yáng)性克?。┍恚ㄟ_(dá)目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向重組體克隆的篩選與鑒定轉(zhuǎn)化后的克隆群體：重組體克隆的篩選與鑒定轉(zhuǎn)化后的克隆群體：陽(yáng)性重組子的篩選與鑒定遺傳檢測(cè)法(根據(jù)重組載體的標(biāo)志作篩選)--插入失活法--α-互補(bǔ)法限制性酶切法PCR法雜交篩選法免疫學(xué)方法核苷酸序列測(cè)定法陽(yáng)性重組子的篩選與鑒定遺傳檢測(cè)法(根據(jù)重組載體的標(biāo)志作篩選)遺傳檢測(cè)法菌株為某種抗生缺陷型，而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素，卡拉霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出。遺傳檢測(cè)法菌株為某種抗生缺陷型，而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如對(duì)于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅活法進(jìn)行篩選。如pBR322中帶有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素基因，當(dāng)將目的基因插入抗四環(huán)素基因后，就可引起該基因失活，細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素耐藥，而對(duì)四環(huán)素敏感。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的細(xì)菌即為帶重組體的細(xì)菌。對(duì)于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅活法進(jìn)行篩選如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板α-互補(bǔ)法——藍(lán)白篩選現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含有一個(gè)大腸桿菌ＤＮＡ的短區(qū)段，其中含有β－半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和N端１４６個(gè)氨基酸偏碼區(qū)（全長(zhǎng)1201氨基酸）。這個(gè)編碼區(qū)中插入一個(gè)多克隆位點(diǎn)。受體菌是Z基因突變型，只含編碼β－半乳糖苷酶Ｃ端aa的序列。當(dāng)外源基因插入時(shí)，在IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）誘導(dǎo)下合成β－半乳糖苷酶N端片斷，和受體菌的C端片斷溶為一體后，可產(chǎn)生蛋白質(zhì)間的互補(bǔ)，形成有活性的β－半乳糖苷酶，稱(chēng)α互補(bǔ)。具有α互補(bǔ)的細(xì)菌培養(yǎng)在含IPTG及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的培養(yǎng)基上。X-gal本身是無(wú)色的，在半乳糖苷酶的水解下產(chǎn)生蘭色的物質(zhì)（被水解為無(wú)色的半乳糖及深蘭色的5-溴-4-氯靛蘭），因此會(huì)形成藍(lán)色菌落。而當(dāng)有外源基因插入到多克隆原點(diǎn)，從而造成插入突變失活，則不能產(chǎn)生α互補(bǔ)，因此菌落是白色的。通過(guò)顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。IPTG起誘導(dǎo)表達(dá)的作用，相當(dāng)于乳糖，但它的誘導(dǎo)效率遠(yuǎn)高于乳糖。α-互補(bǔ)法——藍(lán)白篩選現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含α-互補(bǔ)法α-互補(bǔ)法限制性酶切法

經(jīng)過(guò)粗篩后的含重組體的細(xì)菌，還需進(jìn)行限制酶譜分析進(jìn)一步鑒定。將單一細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增后分別提取其DNA，用重組時(shí)所用的同一限制酶進(jìn)行酶切，再將其與不含目的基因的載體一起進(jìn)行電泳比較分析，如發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)目的基因片段的電泳帶即證明重組體中帶有目的基因。限制性酶切法經(jīng)過(guò)粗篩后的含重組體的細(xì)菌，還需進(jìn)凝膠電泳檢測(cè)加樣孔DNAMarker空質(zhì)粒重組質(zhì)粒

重組質(zhì)粒酶切重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增片段凝膠電泳檢測(cè)加樣孔DNAMarker空質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組PCR法利用的目標(biāo)引物(例如分離目的基因所使用的引物)，抽提需要篩選的克隆的重組DNA作為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,根據(jù)是否擴(kuò)增出目的片段來(lái)確定陽(yáng)性克隆。PCR法利用的目標(biāo)引物(例如分離目的基因所使用的引物)，抽提雜交篩選法為了進(jìn)一步鑒定重組基因體中的目的基因，可采用與目的基因部分互補(bǔ)的DNA片段作為探針，與含有重組體的細(xì)菌菌落進(jìn)行雜交，經(jīng)放射自顯影，如結(jié)果為陽(yáng)性，即可確定重組體中帶目的基因。32P標(biāo)記的DNA分子探針雜交放射自顯影法雜交篩選法為了進(jìn)一步鑒定重組基因體中的目的基因，可采用與目的基因重組與基因工程技術(shù)課件依據(jù)：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則步驟：①合成核酸探針（與所需基因互補(bǔ)的核苷酸短鏈，并用同位素標(biāo)記）②升高溫度或改變pH使DNA變性③分子雜交（常用原位分子雜交）如果基因文庫(kù)中的一個(gè)DNA片段能和探針結(jié)合形成雙鏈，這一片段即含有所需基因。分子雜交依據(jù)：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則分子雜交免疫化學(xué)檢測(cè)法濾膜（固定抗體）+免疫化學(xué)檢測(cè)法濾膜（固定抗體）+DNA序列分析法該方法通常是用在目的基因篩選后最終的鑒定。ACTGAAGGCTDNA序列分析法該方法通常是用在目的基因篩選后最終的鑒定。A真核細(xì)胞的篩選新霉素抗性選擇系統(tǒng)：新霉素是原核生物的抗生素，對(duì)真核生物沒(méi)有抑制作用，但新霉素的類(lèi)似物G418對(duì)真核細(xì)胞及原核細(xì)胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo）能在真核細(xì)胞中表達(dá)并能使G418失活（neo基因編碼一個(gè)磷酸轉(zhuǎn)移酶），細(xì)胞可以生長(zhǎng)。真核細(xì)胞的篩選新霉素抗性選擇系統(tǒng)：真核細(xì)胞的篩選標(biāo)記新霉素類(lèi)藥物G418篩選AmNeoPoriG418滅活（-）蛋白質(zhì)合成真核細(xì)胞的篩選標(biāo)記新霉素類(lèi)藥物G418篩選AmNeoPortk-細(xì)胞突變株篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞選擇原理：

tk(胸苷激酶)基因的篩選：受體細(xì)胞必須是相應(yīng)的tk-，將細(xì)胞培養(yǎng)在含HAT（H：黃嘌呤，A：氨甲喋呤，T：胸苷）的培養(yǎng)基中。在A存在下，核苷酸的從頭合成途徑被阻斷，不能合成AMP、TMP及GMP。這三種核苷酸的合成只能有補(bǔ)償途徑合成，必須具有tk基因的存在細(xì)胞才可生長(zhǎng)。tk-細(xì)胞突變株篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞選擇原理：氨基喋呤篩選法氨基喋呤(HAT選擇)核酸從頭合成（-）核酸補(bǔ)救合成（TK酶）TK-TK+氨基喋呤篩選法氨基喋呤核酸從頭合成（-）核酸補(bǔ)救合成（TK酶DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞）篩（選陽(yáng)性克?。?/p>

表（達(dá)目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)重組子目的基因的mRNA表達(dá)蛋白質(zhì)大腸桿菌（E.coli）受體細(xì)胞外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)重組子目的基因的mRNA表達(dá)蛋白質(zhì)大腸桿菌（E.coli）原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點(diǎn)原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進(jìn)行。原核生物形成多順?lè)醋觤RNA：mRNA在合成過(guò)程中和多個(gè)核糖體結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。一般不含內(nèi)含子（intron），沒(méi)有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)。原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起，形成操縱子。操縱子是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個(gè)遺傳單位。原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點(diǎn)原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形D原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結(jié)構(gòu)：

啟動(dòng)子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。一般長(zhǎng)40-60bp，富含A-T堿基對(duì)具有保守序列：-10區(qū)（pribnowbox）：TATAAT

-35區(qū)：終止子（terminator，T）:位于基因3’端,給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結(jié)構(gòu)：與翻譯有關(guān)的原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)：——核糖體結(jié)合位點(diǎn)翻譯起始密碼子AUG或GUGSD順序（shine-dalgarno）：AUG上游3-11bp長(zhǎng)約3-9bpmRNA與16s核糖體亞基間的識(shí)別與結(jié)合序列與翻譯有關(guān)的原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)：——核糖體結(jié)合位點(diǎn)

人類(lèi)對(duì)大腸桿菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，對(duì)其特性和遺傳背景了解得最清楚，大腸桿菌培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、價(jià)格低廉，人們用大腸桿菌用外源基因的表達(dá)工具已有幾十年的經(jīng)驗(yàn)積累，大腸桿菌表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過(guò)細(xì)菌總蛋白量的80%。因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。設(shè)計(jì)外源基因在大腸桿菌表達(dá)就需要外源基因在大腸桿菌中表達(dá)所需要的元件，包括轉(zhuǎn)錄起始必需的啟動(dòng)子、翻譯起始所必需的核糖體識(shí)別序列等；外源基因表達(dá)的產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)大腸桿菌有毒害作用，會(huì)影響細(xì)菌的生存繁殖，所以大多數(shù)表達(dá)載體都帶有誘導(dǎo)性表達(dá)所需要的元件，即有操縱子序列以及與之配套的調(diào)控基因等；外源基因還應(yīng)當(dāng)插入到適合于表達(dá)的位置，所以表達(dá)載體中要設(shè)有適合的多克隆位點(diǎn)；此外還應(yīng)具備基因克隆篩選的條件，包括在細(xì)胞中復(fù)制必需的復(fù)制起始序列、篩選標(biāo)志如抗藥性基因等。人類(lèi)對(duì)大腸桿菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，對(duì)其特性和遺傳外源基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的必要條件：刪除內(nèi)含子和5’非編碼區(qū)外源基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子和SD順序控制下維持正確開(kāi)放閱讀框架（ORF）mRNA穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不被降解外源基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的必要條件：原核表達(dá)載體(expressingvector)特點(diǎn)：帶表達(dá)構(gòu)件—轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的DNA序列大腸桿菌表達(dá)載體：含啟動(dòng)子—核糖體結(jié)合位點(diǎn)—克隆位點(diǎn)—轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)啟動(dòng)子：trp-lac(tac)啟動(dòng)子、λ噬菌體PL啟動(dòng)子、T7噬菌體啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密碼子(ATG)和SD序列轉(zhuǎn)錄終止序列原核表達(dá)載體(expressingvector)特點(diǎn)：帶表影響外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)效率的因素：?jiǎn)?dòng)子終止子SDmRNA多肽鏈影響外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)效率的因素：?jiǎn)?dòng)子終止子SDmR啟動(dòng)子的選擇和改造強(qiáng)啟動(dòng)子可調(diào)控啟動(dòng)子P啟動(dòng)子：建立表達(dá)載體時(shí)，選擇強(qiáng)啟動(dòng)子。

啟動(dòng)子最佳作用距離-轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)啟動(dòng)子的選擇和改造P啟動(dòng)子：建立表達(dá)載體時(shí)，選擇強(qiáng)啟動(dòng)子。常見(jiàn)原核強(qiáng)啟動(dòng)子：Plac：受Lac阻遏蛋白負(fù)調(diào)，受IPTG的誘導(dǎo)Ptrp：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。Ptac:Lac啟動(dòng)子和Trp啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子。PL和PR啟動(dòng)子：噬菌體早期左/右向啟動(dòng)子，受λ噬菌體CI基因負(fù)調(diào)控。溫度誘導(dǎo)。常見(jiàn)原核強(qiáng)啟動(dòng)子：PromotersforE.coliPromotersforE.coli終止子：強(qiáng)終止子、二聚體終止子終止子啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄過(guò)度影響目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率干擾基因載體的復(fù)制等生物學(xué)功能增加受體細(xì)胞的無(wú)效能量消耗終止子：強(qiáng)終止子、二聚體終止子終止子啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄過(guò)度SD序列：影響翻譯效率SD序列與16SrRNA的互補(bǔ)性SD的后續(xù)序列的核苷酸組成SD與起始密碼之間的距離mRNASDSD序列：影響翻譯效率SD序列與16SrRNA的互補(bǔ)性mRN融合型表達(dá)載體：----融合蛋白非融合型表達(dá)載體：---天然完整蛋白分泌型表達(dá)載體：----產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙原核表達(dá)載體的類(lèi)型融合型表達(dá)載體：----融合蛋白原核表達(dá)載體的類(lèi)型融合型表達(dá)載體

PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合基因優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)效率高產(chǎn)物穩(wěn)定易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定易純化：利用融合原核多肽的特性融合型表達(dá)載體PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融技術(shù)關(guān)鍵：

克隆基因插入原核序列3’端而維持正確閱讀框架。選擇合適酶切位點(diǎn)加人工合成的DNA接頭構(gòu)建位相載體技術(shù)關(guān)鍵：位相載體--含有3種讀碼框的系列載體位相載體--含有3種讀碼框的系列載體Ptac：IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白—直接純化產(chǎn)物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因子位相載體融合型載體----pGEX系列Ptac：IPTG誘導(dǎo)融合型載體----pGEX系列非融合型表達(dá)載體PSDForeignDNA非融合型表達(dá)載體非融合基因主要元件：強(qiáng)啟動(dòng)子

SD：

ATG：第一個(gè)密碼子非融合型表達(dá)載體PSDForeignDNA非融合型表達(dá)載非融合型表達(dá)載體--pPL-LamdaPL啟動(dòng)子---溫度誘導(dǎo)插入位點(diǎn)--HpaI非融合型表達(dá)載體--pPL-LamdaPL啟動(dòng)子---溫度誘分泌型表達(dá)載體：主要元件：?jiǎn)?dòng)子和SD序列信號(hào)肽序列：SD下游，編碼信號(hào)肽，可引導(dǎo)蛋白跨膜優(yōu)點(diǎn)：分泌表達(dá)，避免降解。分泌型表達(dá)載體：分泌型表達(dá)載體--pINIII-ompA1分泌型表達(dá)載體--pINIII-ompA1沒(méi)有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，不能進(jìn)行mRNA的剪接，所以只能表達(dá)cDNA而不能表達(dá)真核的基因組基因；沒(méi)有真核翻譯后加工的功能，表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，不能進(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對(duì)和空間構(gòu)像折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)常沒(méi)有足夠的生物學(xué)活性；表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會(huì)在細(xì)菌內(nèi)聚集成包涵體（inclusionbody），尤其當(dāng)表達(dá)目的蛋白量超過(guò)細(xì)菌體總蛋白量10%時(shí)，就很容易形成包涵體。生成包涵體的原因可能有是蛋白質(zhì)合成速度太快，多肽鏈相互纏繞，缺乏使多肽鏈正確折疊的因素，導(dǎo)致疏水基因外露等。細(xì)菌裂解后，包涵體的離心后的沉淀中，雖然有利于目的蛋白的初步純化，但無(wú)生物活性的不溶性蛋白，要經(jīng)過(guò)復(fù)性（renaturation），使其重新散開(kāi)、重新折疊成具有天然蛋白構(gòu)象和良好生物活性的蛋白質(zhì)，常常是一件很困難的事情。也可以設(shè)計(jì)載體使大腸桿菌分泌表達(dá)出可溶性目的蛋白，但表達(dá)量往往不高。原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)沒(méi)有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，不能進(jìn)行mRNA的剪接，所以只能表具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)具翻譯后修飾系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表達(dá)基因治療真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢(shì)具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢(shì)真核基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)真核基因組的復(fù)雜性：真核基因組龐大，具大量非編碼序列---mR