四國藥典細菌內毒素對比

CP(2015版)1143EP〔8.0〕2.6.14USP〔36〕85JP〔16〕6.06定義CP(2015)EP(8.0)USP(36)JP(16)

本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內素素本法利用鱟試劑〔從美洲鱟或中華鱟——阿米巴細胞溶解產物制備而來〕檢測由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素或對內毒素進展定量檢查和定量供試品內毒素的方法。本法利用鱟〔美洲鱟或中華鱟〕阿米巴細胞溶解產物制備的用于內毒素檢測的鱟試劑〔LAL〕檢定內毒素本法利用鱟試劑〔從美洲鱟或中華鱟——阿米巴細胞溶解產物制備而來〕檢測由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素或對內毒素進展定量方法方法CP(2015)EP(8.0)一、凝膠法二、光度測定法1、濁度法2、顯色基質法A：凝膠法：限度試驗B：凝膠法：定量試驗C：動態(tài)濁度法D：終點顯色法USP(36)USP(36)JP(16)F：終點濁度法一、凝膠法二、光度測定法1、濁度法2、顯色法一、凝膠法二、光度測定法1、濁度法2、顯色法儀器CP(2015)EP(8.0)USP(36)JP(16)

干熱滅菌法2530分鐘以上干熱滅菌法2530分鐘以上干熱滅菌法2530分鐘以上干熱滅菌法2530分鐘以上溶液制備溶液制備CP(2015)EP(8.0)供試品溶液的制備某些供試品需進展復溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。必要時，可調整被測溶液(或其稀釋液〕的pH鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0-8.0的范圍內為宜，可使用適宜的酸、堿溶液或緩沖液調整pH值。酸或堿溶液須用細菌內毒素檢査用水在已去除內毒素的容器中配制。緩沖液必需經過驗證不含內毒素和干擾因子。內毒素儲藏標準溶液的制備用內毒素標準品制備內毒素儲藏標準溶液；所用的內毒素標準品必需先用國際標準品校準，如內毒素標準BRP。內毒素以國際單位〔IU〕表示。IU的換算見國際衛(wèi)生組織公布的國際標準。注：一國際單位I〕內毒素相當于一個內毒素單位E.U。依據包裝說明書上的標準和內毒素儲藏標準溶液的標簽上關于制備和貯存的說明。內毒素標準溶液的制備充分混合內毒素儲藏標準溶液后，用細菌內毒素試驗檢查用水〔BET檢查用水〕稀釋，制成適當的系列稀釋液，即得BET檢查用內毒素標準溶液。得到的稀釋液應盡快使用，以免因吸附而導致活性損失。供試品溶液的制備除非另有說明，以BET檢查用水溶解或稀釋活性成分或藥品來制備供試品溶液。某些成分或藥品可能在其它的水溶液中溶解度更高。如有必要，調整待測溶液〔或它的稀釋液〕的pH值，使鱟試劑和供試品溶液的混合物的pH值在所選鱟試劑生產商的指定pH范圍內。一般要求供試品溶液的pH6.0-8.0?？捎明c試劑生產商推舉的酸、堿或適當的緩沖溶液來調解pH值。酸或堿溶液須用BET檢查用水在去除內毒素的容器中配制。緩沖液必需經過驗證不含內毒素和干擾因子。USP(36)標準內毒素儲藏液WHO國際標準校準過的USP內毒素標準品制備的。內毒素用EU表示。【注：1EU=1IU】內毒素標準液——將內毒素儲藏液混合均勻，再用細菌內毒素檢查用水對其作適當的系列稀釋。盡快使用稀釋液，以避開因吸附而失去活性。供試液——供試溶液是通過用細菌內毒素檢查用水溶解、稀釋藥物制備。某些物質或制劑可能在其他水溶液中被更適當地溶解、稀釋。如有必要，調整待測溶液的pH值，使鱟試劑和樣品的混合物pH在由鱟試劑生產者定的pH范圍內。通常使用于pH范圍在6.0-8.0的產品。pH的緩沖劑必需進展驗證無內毒素和干擾因子。JP(16)

內毒素儲藏標準溶液的制備以BET10000100比照標準品，制取細菌內毒素試驗〔BET〕的內毒素儲藏標準溶液。內毒素的量用內毒素單位E〕1EU相當于1個內毒素國際單位I。內毒素標準溶液的制備充分混合內毒素儲藏標準溶液后，用水稀釋，即得BET檢查用內毒素標準溶液。得到的稀釋液應盡快使用，以免因吸附而導致活性損失。供試品溶液的制備除非另有說明，以除非另有說明，以BET待測溶液的pH值，使鱟試劑和供試品溶液的混合物的pH值在所選鱟試劑的使用pH范圍內。一般要求供試品溶液的pH值范圍為6.0-8.0。試液或調整pHBET內毒素限值確實定及最大有效稀釋倍數CP(2015) 藥品、生物制品的細菌內毒素限值(L)一般按以下公式確定：L=K/M式中L為供試品的細菌內毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性單位〕表示；K為人每千克體重每小時最大可承受的內毒素劑量，以EU/(kg?h)表示，注射劑K=5EU/(kg?h)，放射性藥品注射劑K=2.5EU/(kg?h)，鞘內用注射劑K=0.2EU/(kg?h)；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以ml/(kg?h)、mg/(kg?h)或U/(kg?h60kg計算，人體外表積按1.62m2計算。注射時間假設缺乏1小時，按1小時計算。供試品每平方米體外表積劑量乘以0.027即可轉換為每千克體重劑量(M)。按人用劑量計算限值時，如遇特別狀況，可依據生產和臨床用藥實際狀況做必要調整，但需說明理由。最大有效稀釋倍數是指在試驗中供試品溶液被允許到達稀釋的最大倍數〔1-MVD),在不超過此稀釋倍數的濃度下進展內毒素限值的檢測。用以下公式來確定MVD:MVD=cL/λ式中L為供試品的細菌內毒素限值；c為供試品溶液的濃度，當L以EU/mg或EU/U表示時，c的單位需為mg/ml或U/ml,當L以EU/ml表示時，則c等于l.0ml/ml。如需計算在MVD時的供試品濃度，即最小有效稀釋濃度，可使用公式c=λ/L；λ為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度〔EU/ml)，或是在光度測定法中所使用的標準曲線上最低的內毒素濃度。EP(8.0)

最大有效稀釋倍數〔MVD〕指可檢測出內毒素限值的供試品溶液的最大稀釋倍數。MVD按以下公式確定：MVD=內毒素限值×供試品溶液濃度/λ內毒素限值：在劑量的根底上，注射藥物的活性成分的內毒素限度為K/MK=人每公斤體重每小時最大可承受的內毒素劑量〔EU/kg〕M＝人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量。專論中，注射劑的活性成分的內毒素限度的單位有IU/ml、IU/mg、IU/生物活性單位等。供試品溶液的濃度表示法：－當內毒素限度以質量〔IU/mg〕表示時，用mg/ml-當內毒素限度以〔IU/ml〕表示時，用ml/ml-當內毒素限度以生物單位〔IU/Unit〕Units/mlλ=指凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度，或指濁度法或顯色法使用的標準回歸曲線上最低點〔IU/ml)的對應值。USP(36) 最大有效稀釋倍數〔MVD〕指可檢測出內毒素限值的供試品溶液的最大稀釋倍數。按以下公式確定：MVD=內毒素限值×供試品溶液濃度/λK/M2，其中K是每千克體重內毒素的閾值熱劑量；M是每千克體重產品的最大推舉劑量。當進展間隔頻繁注射和連續(xù)輸液時，MEU/mL,EU/mg,EU/單位生物活性等。供試液濃溶液——mg/mL:內毒素規(guī)定為重量〔EU/mg〕的狀況下表示；Units/mL：內毒素規(guī)定為重量〔EU/單位生物活性〕的狀況下表示；mL/mL：內毒素規(guī)定為重量〔EU/mL〕的狀況下表示。λ：凝膠法〔EU/mL〕或者用于濁度法和顯色法標準曲線的最低濃度的標示靈敏度。JP(16)

最大有效稀釋倍數〔MVD〕指可檢測出內毒素限值的供試品溶液的最大稀釋倍數。MVDMVD=內毒素限值×供試品溶液濃度/λ內毒素限值：依據劑量，注射劑的內毒素限度即為K/M的值，其中K為人每公斤體重可承受的內毒素中熱原的最小量EU/k，M小時的最大供試品劑量。供試品溶液的濃度表示法：當內毒素限度以質量〔EU/mg〕表示時，用mg/mL表示濃度。當內毒素限度以〔EU/mEq〕當內毒素限度以〔EU/mEq〕表示時，用mEq/mL表示濃度。當內毒素限度以生物單位〔EU/Unit〕表示時，用Units/mL表示濃度。當內毒素限度以體積〔EU/mL〕表示時，用mL/mLλ：指凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度〔EU/mL)，或為濁度法或顯色法使用的標準回歸曲線上最低點〔EU/mL)的對應值。凝膠法CP(2015) 凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產生凝集反響的原理進展限度檢測或半定量檢測內毒素的方法。鱟試劑靈敏度復核EU/ml表示。當使用批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結果的轉變時，應進展鱟試劑靈敏度復核試驗。依據鱟試劑靈敏度的標示值(A)15分鐘，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒。取分裝有0.1ml鱟試劑溶液的10mm×75mm試管或復溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加人0.lml不同濃度的內毒素標準溶液，每一個內毒素濃度平行做4管；另外2管參加0.1ml37±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉180°，假設管內形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫順拿取試管過程應避開受到振動，造成假陰性結果。當最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性比照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反響終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值(λc)。λc=antilg〔∑X/n〕式中X為反響終點濃度的對數值〔lg)。反響點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最終一個呈陽性結果的濃度；n為每個濃度的平行管數。當λc在0.5-2λ(包括0.5λ和2λ)時，方可用于細菌內毒素檢査，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。干擾試驗按表1制備溶液A、B、C和D(MVD)的溶液，按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。表1凝膠法干擾試驗溶液的制備編號內毒素濃度/被參加內毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數稀釋后內毒素的濃度平行管數A無/供試品溶液——－2B2λ/供試品溶液供試品溶液12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/檢查用水檢查用水12λ221λ240.5λ280.25λ2D無/檢查用水－－－2注：A為供試品溶液；B為干擾試驗系列；C為鱟試劑標示靈敏度的比照系列；D為陰性比照。只有當溶液A和陰性比照溶液D的全部平行管都為陰性，并且系列溶液C的結果符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，試驗方為有效。當系列溶液B的結果符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。MVDMVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗?？赏ㄟ^對供試品進展更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法(如過濾、中和、透析或加熱處理等)排解干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排解干擾且不會使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進展干擾試驗。當進展藥的內毒素檢査試驗前，或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進展干擾試驗。當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝轉變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重進展干擾試驗。EP(8.0) 凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產生凝集反響的原理來檢測或定量內毒素的方法。在標準條件下，可引起鱟試液凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度。為確保試驗結果準確、有效，應依據預備試驗中的說明開展試驗，復核鱟試劑的標示靈敏度和試驗的干擾因素。預備試驗鱟試劑的標示靈敏度復核試驗靈敏度用IU/ml表示。應在鱟試劑用于檢查內毒素之前對靈敏度進展復核；復核試驗需要制備標示靈敏度λ的4支平行管。當使用批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結果的轉變時，應進展鱟試劑靈敏度復核試驗。BET2λ、λ、0.5λ0.25λ四種濃度的標準溶液。在每支試管中，分別混合等體積〔通常為0.1mL)的鱟試液和標準溶液。如使用的是裝有鱟試劑凍干粉末的西林瓶或安瓿，可向其中直接加入溶液。依據鱟試劑生產商的建議，將反響混合物孵育一段時間(通常在37±1℃下保存60±2分鐘)，在此過程中，不能震驚試管。凝膠的完整性測試：如使用試管作為容器，先將試管從保溫箱中取出，再緩緩將試管倒轉1800。假設形成了堅實的凝膠，倒轉后凝膠不移位，此時將該項檢查的結果記錄為陽性。如未能形成堅實且不變形的凝膠，該項檢查的結果即為陰性。僅在最低濃度的標準溶液的全部平行管的檢查結果均為陰性的狀況下，試驗方為有效。反響終點濃度指系列遞減的內毒素濃度中最終一個呈陽性結果的濃度。將終點濃度取對數，計算它們的平均值，再將平均值的結果取反對數，最終的表達式如下：終點濃度的幾何平均值＝lg-1(Σe/f)Σe＝所用系列溶液的終點濃度的對數值的和f＝平行管的數量反響終點的濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的測量值IU/m。當終點濃度的幾何平均值在0.λ至2.λ劑的標示靈敏度為λ，可用于內毒素的檢查。干擾因素試驗開展該項試驗的目的是檢查供試品溶液中反響的增加因素或阻抑因素的存在。2.6.14.-1制備溶液A、B、C、D。供試品的稀釋度不得超過MVD，且供試品溶液不能檢查出內毒素，具體操作見〔1〕預備試驗的〔i〕鱟試劑標示靈敏度的復核試驗項。2.6.14-1溶液內毒素濃度/配制內毒素的溶液稀釋劑稀釋倍數稀釋后內毒素的濃度平行管數A無/供試品溶液－－－4B2λ/供試品溶液供試品溶液12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/BETBET12λ221λ240.5λ280.25λ2D0/BET－－－2A=經檢查無內毒素的溶液B=干擾試驗用C=鱟試劑標示靈敏度的比照品D=陰性比照品〔BET〕依據〔1〕預備試驗下的〔i〕鱟試劑標示靈敏度的復核試驗項中列出的公式，計算B和C溶液的終點濃度的幾何平均值。如試驗條件發(fā)生了任何可能影響到試驗結果的變化，須重進展干擾因素試驗。只有當溶液AD的全部平行管中無反響、且溶液C的結果在復核的鱟試劑靈敏度范圍內時，試驗方有效。經測定，假設溶液B的靈敏度在[0.5λ，2.0λ]間，可判定供試品溶液在該試驗條件下，對試驗無干擾；反之則判定供試品溶液對試驗能形成干擾。假設供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進展不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。使用靈敏度更高的鱟試劑進展內毒素的檢查時，由于靈敏度更高的鱟試劑能排解試驗的干擾因素，供試品的稀釋倍數也可適當放寬。可通過其他適宜的方法〔如過濾、中和、透析或加熱處理等〕排解干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排解干擾且不會使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進展干擾試驗。USP(36)凝膠法系通過LAL即為LAL試劑的標示靈敏度。為確保試驗結果準確、有效，應依據凝膠法的預備試驗中的說明開放試驗，復核鱟試劑的標示靈敏度和試驗的干擾因素。凝膠法的預備試驗LALLAL試劑批中至少一支西林瓶。用LAL試劑用水對倍稀釋USPRS2λ、λ、0.5λ0.25λ〔λ的定義見上文。每一個標準內毒素濃度和陰性比照品平行作4LAL條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結果的轉變時，應進展LAL在每支試管中，分別混合等體積〔如0.1mL)的LAL試劑和標準溶液。如使用的是裝有LAL試劑凍干粉末的西林瓶或安瓿，可向其中直接參加溶液。依據LAL生產廠家的說明，保溫裝有反響試劑混合物的試管〔通常在31℃下保存62分鐘保溫完畢后，為測試凝膠的完整性，緩緩將每個容器倒轉1800。假設形成了堅實的凝膠，倒轉后凝膠不移位，此時將該項檢查的結果記錄為陽性。如未能形成凝膠，或形成的凝膠不堅實、在倒轉過程中消滅了滑脫，該項檢查的結果即為陰性。僅在最低濃度的標準溶液的全部平行管的檢查結果均為陰性的狀況下，方可判定試驗有效。反響終點濃度指系列遞減的內毒素濃度中最終一個呈陽性結果的濃度。使用下面的公式，計算終點濃度的幾何平均值：終點濃度的幾何平均值＝lg-1(Σe/f)Σef為平行管的數量。反響終點的幾何平均值即為LAL試劑的標示靈敏度〔單位為EU/m0.5λ2.0λ之間，可判定受試LALλ。1制備溶液A、B、C、D，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過MVD的溶液，按LAL復核試驗項下操作。用檢查法給出的公式計算溶液B、C1凝膠法的阻抑/增加試驗溶液的制備溶液內毒素濃度/配制內毒素的溶液稀釋劑 稀釋倍數稀釋后內毒素的濃度平行管數A無/供試品溶液— －－4B2λ/供試品溶液供試品溶液 12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/LALLAL試劑用水 12λ221λ240.5λ280.25λ2D無/BET— －－2A：去除內毒素的供試品溶液B：干擾試驗溶液C：LALD：LAL如試驗條件發(fā)生了任何可能影響到試驗結果的變化，須重進展干擾因素試驗。只有當溶液A和D中無反響、且溶液C的結果在復核的標示靈敏度范圍內時，試驗方有效。計算溶液B的鱟試劑靈敏度，假設值在[0.5λ，2.0λ]間，可判定供試品溶液在該濃度下無干擾作用；反之則判定供試品溶液對試驗能形成干擾。假設供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進展不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。使用靈敏度更高的鱟試劑進展內毒素的檢查時，由于靈敏度更高的鱟試劑能排解試驗的干擾因素，供試品的稀釋倍數也可適當放寬。可通過對供試品溶液或進展更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法〔如過濾、中和、透析或加熱處理等〕排解干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排解干擾且不會造成內毒素的活性損失，要使用預先添加了USP內毒素RSJP(16)凝膠法系通過LAL即為LAL試劑的標示靈敏度。為確保試驗結果準確、有效，應依據凝膠法的預備試驗中的說明開放試驗，復核鱟試劑的標示靈敏度和試驗的干擾因素。凝膠法的預備試驗LALLAL試劑批中至少一支西林瓶。用LAL試劑用水對倍稀釋USPRS2λ、λ、0.5λ0.25λ〔λ的定義見上文。每一個標準內毒素濃度和陰性比照品平行作4LAL條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結果的轉變時，應進展LAL在每支試管中，分別混合等體積〔如0.1mL)的LAL試劑和標準溶液。如使用的是裝有LAL試劑凍干粉末的西林瓶或安瓿，可向其中直接參加溶液。依據LAL生產廠家的說明，保溫裝有反響試劑混合物的試管〔通常在31℃下保存62分鐘保溫完畢后，為測試凝膠的完整性，緩緩將每個容器倒轉1800。假設形成了堅實的凝膠，倒轉后凝膠不移位，此時將該項檢查的結果記錄為陽性。如未能形成凝膠，或形成的凝膠不堅實、在倒轉過程中消滅了滑脫，該項檢查的結果即為陰性。僅在最低濃度的標準溶液的全部平行管的檢查結果均為陰性的狀況下，方可判定試驗有效。反響終點濃度指系列遞減的內毒素濃度中最終一個呈陽性結果的濃度。使用下面的公式，計算終點濃度的幾何平均值：終點濃度的幾何平均值＝lg-1(Σe/f)Σef為平行管的數量。反響終點的幾何平均值即為LAL試劑的標示靈敏度〔單位為EU/m0.5λ2.0λ之間，可判定受試LALλ。1制備溶液A、B、C、D，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過MVD的溶液，按LAL試劑靈敏度復核試驗項下操作。用檢查法給出的公式計算溶液B、C的反響終點的幾何平均值。1凝膠法的阻抑/增加試驗溶液的制備溶液內毒素濃度/配制內毒素的溶液稀釋劑 稀釋倍數稀釋后內毒素的濃度平行管數A無/供試品溶液— －－4B2λ/供試品溶液供試品溶液 12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/LALLAL試劑用水 12λ221λ240.5λ280.25λ2D無/BET— －－2A：去除內毒素的供試品溶液B：干擾試驗溶液C：LALD：LAL如試驗條件發(fā)生了任何可能影響到試驗結果的變化，須重進展干擾因素試驗。只有當溶液A和D中無反響、且溶液C的結果在復核的標示靈敏度范圍內時，試驗方有效。計算溶液B的鱟試劑靈敏度，假設值在[0.5λ，2.0λ]間，可判定供試品溶液在該濃度下無干擾作用；反之則判定供試品溶液對試驗能形成干擾。假設供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進展不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。使用靈敏度更高的鱟試劑進展內毒素的檢查時，由于靈敏度更高的鱟試劑能排解試驗的干擾因素，供試品的稀釋倍數也可適當放寬?？赏ㄟ^對供試品溶液或進展更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法〔如過濾、中和、透析或加熱處理等〕排解干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排解干擾且不會造成內毒素的活性損失，要使用預先添加了USP方法能有效地排解干擾且不會造成內毒素的活性損失，要使用預先添加了USP內毒素RS再經過處理的供試品溶液進展干擾試驗。凝膠限度試驗CP(2015)按表2制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數不超過MVD并且已經排解干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。表2凝膠限度試驗溶液的制備編號 內毒素濃度/配制內毒素的溶液平行管數A 0/供試品溶液2B 2λ/供試品溶液2C 2λ/檢查用水2D 0/檢查用水2注：A為供試品溶液；B為供試品陽性比照；C為陽性比照；D為陰性比照。結果推斷保溫60分鐘±2分鐘后觀看結果。假設陰性比照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性比照溶液B的平行管均為陽性，陽性比照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。假設溶液A的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。假設溶液AA的兩個平行管A需做4支平行管，假設全部平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否則判定供試品不符合規(guī)定。假設供試品的稀釋倍數小于MVD而溶液A消滅不符合規(guī)定時，需將供試品稀釋至MVD重試驗，再對結果進展推斷。EP(8.0) 按鱟試劑標示靈敏度復核試驗項下有關形成含內毒素的堅實凝膠的說明進展操作，該法可檢查供試品溶液的內毒素含量是否超出了內毒素限度。方法按表2.6.14-2制備溶液A、B、C、D。試驗方法見〔1〕預備試驗的〔i〕鱟試劑標示靈敏度的復核試驗項。2.6.14-2溶液 內毒素濃度/配制內毒素的溶液A 0/供試品溶液

22λ/供試品溶液 22λ/BET檢查用水 20/BET檢查用水 2制備溶液〔供試品陽性比照，稀釋倍數不得超過MV。依據〕預備試驗〔i〕〔陽性比照〕所含標準內毒素的濃度為鱟試劑標示靈敏度的兩倍。溶液D〔陰性比照〕為BET結果推斷只有溶液BCDA如溶液的平行管的檢查結果均為陽性時：如供試品的稀釋倍數為MVD，供試品不符合規(guī)定。如供試品的稀釋倍數小于MVD，應將供試品溶液稀釋至較大但不超過MVD的倍數，再次開展試驗。假設溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進展復試。如復試中，溶液A的兩個平行管均呈陰性，可將供試品判為符合內毒素限度要求。USP(36) 方法——按表2制備溶液A、B、C、D。按凝膠法預備試驗的LAL試劑標示靈敏度復核試驗項下操作。以該四種溶液為一組試驗的供試品，每組試驗做兩組平行。2凝膠限量試驗溶液的制備溶液內毒素濃度/配制內毒素的溶液平行管數A0/供試品溶液2B2λ/供試品溶液2C2λ/LAL2D無/LAL試劑用水2用稀釋倍數不超過MVD的稀釋液制備溶液A和供試品陽性比照品；制備方法見凝膠法預備試驗的干擾試驗項。陽性比照溶液B和C含有內毒素LALDLAL結果推斷——只有陽性比照溶液B和C的平行管的試驗結果均為陽性、陰性比照溶液D的平行管的試驗結果均為陰性時，試驗方有效。溶液AA供試品不合格。假設溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進展復試。如復試中，溶液A的兩個平行管均呈陰性，可將供試品判為符合內毒素限度要求。假設供試品溶液再小于MVD的稀釋倍數下得到的試驗結果為陽性，應將供試品溶液以更大的但不超過MVD的倍數進展稀釋，再次開展試驗。JP(16)按鱟試劑標示靈敏度復核試驗項下有關形成含內毒素的堅實凝膠的說明進展操作，該法可檢查供試品溶液的內毒素含量是否超出了內毒素限度。方法按表2制備溶液A、B、C、D。以該四種溶液為一組試驗的供試品，每組試驗做兩組平行。依據〕預備試驗項下的i〕干擾因素試驗的說明制取溶液A和。孵育溫度、孵育時間和形成凝膠確實認方法見〕預備試驗的鱟試劑標示靈敏度的復核試驗項。2溶液內毒素濃度/配制內毒素的溶液平行管數A0/供試品溶液2B2λ/供試品溶液2C2λ/BET2D0/BET2結果推斷只有溶液BCDA假設溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進展復試。如復試中，溶液A的兩個平行管均呈陰性，可將供試品判為符合內毒素限度要求。以MVD稀釋的溶液A的兩個平行管均為陽性時，供試品不符合內毒素限度要求。假設供試品溶液再小于MVD的稀釋倍數下得到的試驗結果為陽性，應將供試品溶液以MVD凝膠半定量試驗CP(2015) 本方法系通過確定反響終點濃度來量化供試品中內毒素的含量。按表3制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。結果推斷假設陰性比照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性比照溶液B的平行管均為陽性，系列溶液C的反響終點濃度的幾何平均值在0.5-2λ，試驗有效。系列溶液A中每一系列的終點稀釋倍數乘以λ，為每個系列的反響終點濃度。假設檢驗的是經稀釋的供試品，則將終點濃度乘以供試品進行半定量試驗的初始稀釋倍數，即得到每一系列內毒素濃度c。式CE=antilg(∑c/2)]。假設試驗中供試品溶液的全部平行管均為陰性，應記為內毒素濃度小于λ(假設檢驗的是稀釋過的供試品，則記為小于λ乘以供試品進展半定量試驗的初始稀釋倍數〕。假設任何系列內毒素濃度不小于規(guī)定的限值時，則判定供試品不符合規(guī)定。當供試品溶液的全部平行管均為陽性，可記為內毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數乘以λ。表3凝膠半定量試驗溶液的制備編號A內毒素濃度/被參加內毒素的溶液無/供試品溶液稀釋用液檢查用水稀釋倍數1所含內毒素的濃度－平行管數22-24-28-2B2λ/供試品溶液－12λ2C2λ/檢查用水檢查用水12λ22λ240.5λ280.25λ2D無/檢查用水－－－2注：A為不超過MVD1倍、2倍、4倍和8倍，最終的稀釋倍數不得超過MVD。B為2λ濃度標準內毒素的溶液A(供試品陽性比照)。C為鱟試劑標示靈敏度的比照系列。D為陰性比照。EP(8.0) 〔i〕 方法通過將供試品滴定至反響終點，對供試品所含的細菌內毒素定量。按表2.6.14-3制備溶液A、B、C、D。以該四種溶液為一組試驗的供試品，每組試驗做兩組平行。具體試驗操作見〔1〕預備試驗的〔i〕鱟試劑標示靈敏度的復核試驗項。2.6.14-3溶液A內毒素濃度/配制內毒素的溶液無/供試品溶液稀釋劑BET稀釋倍數1稀釋后內毒素的濃度－平行管數22-24-28-2B2λ/供試品溶液－12λ2C2λ/BETBET12λ221λ240.5λ280.25λ2D無/BET－－－2AMVDBET1248最終的稀釋倍數不得超過MVD。溶液B=2λ濃度標準內毒素的溶液A〔供試品陽性比照〕溶液C=含有2λ、λ、0.5λ0.25λ濃度標準內毒素的BETD=BET〔陰性比照〕〔ii〕 計算和結果推斷符合以下三個條件時，可將試驗判為有效：溶液D〔陰性比照〕的兩組平行管均顯陰性，溶液B〔供試品陽性比照〕的兩個平行管均顯陽性，溶液C0.5λ—2λ之間。測定溶液A的內毒素濃度，計算溶液A的系列稀釋液的終點濃度時，應將內毒素濃度記為終點稀釋倍數乘以λ。〔〔1〕〔i〕鱟試劑標示靈敏度的復核試驗項下的公式。照試驗使用的是供試品的稀釋液，計算時，將檢查結果乘以稀釋倍數，即得到原始溶液的內毒素濃度。如在有效的試驗中，供試品的檢查結果均顯陰性，應記為內毒素濃度小于λ〔照試驗使用的是供試品的稀釋液，檢查結果應記為內毒素濃度小于λ乘以供試品的最小稀釋倍數。如供試品的全部結果均為陽性，應記為內毒素濃度大于或等于最大的稀釋倍數乘以λ〔如，在表2.6.14-3×λ。如內毒素的濃度小于其專論中的規(guī)定濃度，可判定供試品符合檢查要求。USP(36) 通過確定反響終點濃度，測定供試品的內毒素的含量。按表3制備溶液A、B、C、D。按凝膠法的預備試驗項下的LAL試劑標示靈敏度復核試驗項下的說明操作。3凝膠定量試驗溶液的制備溶液A內毒素濃度/配制內毒素的溶液無/供試品溶液稀釋劑BET稀釋倍數*1稀釋后內毒素的濃度－平行管數22-24-28-2B2λ/供試品溶液－12λ2C2λ/LALBET12λ221λ240.5λ280.25λ2D無/LAL－－－2A：不超過MVDLAL1248這些溶液的最終的稀釋倍數也不得超過MVD。也可選用其它適宜的溶液。溶液B：2λ濃度標準內毒素的溶液A〔供試品陽性比照。C：以LAL2λ、1λ、0.5λ0.25λ的兩組〔4〕比照系列。D：LAL〔陰性比照。計算和結果推斷：符合以下三個條件時，可將試驗判為有效〕陰性比照溶液D的兩組平行管均顯陰性〔〕供試品陽性比照溶液B兩個平行管均顯陽性〕溶液C的終點濃度的幾何平均值在0.λ-λ之間。系列溶液A中每一系列平行管的終點稀釋倍數乘以λ，為每個系列的反響終點濃度。全部平行管反響終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內毒素濃度〔計算公式見凝膠法預備試驗的LAL試劑標示靈敏度復核試驗項。假設檢驗時承受的是供試品溶液的稀釋液，則計算原始溶液內毒素濃度時，要將結果乘以稀釋倍數。如試驗中供試品溶液的全部平行管均為陰性，應記為內毒素濃度小于λ〔假設檢驗的是稀釋過的供試品，則記為小于λ乘以供試品進展定量試驗的初始稀釋倍數λ〔38λ。假設內毒素濃度小于各論中規(guī)定的限值，判供試品符合規(guī)定。JP(16) 通過將凝膠滴定至反響終點，測量供試品的內毒素終點濃度?！瞚〕 方法按表3制備溶液A、B、C、D。以該四種溶液為一組試驗的供試品，每組試驗做兩組平行。依據〔1〕預備試驗項下的〔ii〕干擾因素試驗的說明制取溶液AB。孵育溫度、孵育時間和形成凝膠確實認方法見〔1〕預備試驗的〔i〕鱟試劑標示靈敏度的復核試驗項。3溶液A內毒素濃度/配制內毒素的溶液0/供試品溶液稀釋劑BET稀釋倍數*1稀釋后內毒素的濃度－平行管數22-24-28-2B2λ/供試品溶液－12λ2C2λ/BETBET12λ221λ240.5λ280.25λ2D0/BET－－－2**可適當調整溶液AMVD?！瞚i〕 計算和結果推斷符合以下三個條件時，可將試驗判為有效a〕陰性比照溶液D的兩組平行管均顯陰性b〕供試品陽性比照溶液B〔c〕C0.5λ—2λ之間。反響終點指溶液A的系列稀釋液中最終一管呈陽性。計算溶液A的內毒素濃度時，應將內毒素濃度記為終點稀釋倍數乘以λ。用〔1〕預備試驗項下的〔i〕鱟試劑標示靈敏度的復核試驗項下的公式計算兩組平行試驗的內毒素濃度的幾何平均值。如溶液A的稀釋液均顯陰性，應記為內毒素濃度小于λ乘以溶液A的最小稀釋倍數。如溶液A的全部稀釋液均呈陽性，應記為內毒素濃度大于或等于最大的稀釋倍數乘以λ。依據溶液A的內毒素濃度的平均值計算供試品的內毒素濃度〔單位為EU/m、EU/m、EU/mE、EU/uni。光度測定法CP(2015) 光度測定法分為濁度法和顯色基質法。濁度法終點濁度法和動態(tài)濁度法。終點濁度法是依據反響混合物中的內毒素濃度和其在孵育終止時的濁度〔吸光度或透光率〕之間存在的量化關系來測定內毒素含量的方法。動態(tài)濁度法是檢測反響混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度或透光率所需要的反響時間，或是檢測濁度增加速度的方法。顯色基質法系利用檢測鱟試劑與內毒素反響過程中產生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少而測定內毒素含量的方法。依據檢測原理，分為終點顯色法和動態(tài)顯色法。終點顯色法是依據反響混合物中內毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的呈色團的量之間存在的量化關系來測定內毒素含量的方法。動態(tài)顯色法是檢測反響混合物的吸光度或透光率到達某一預先設定的檢測值所需要的反響時間，或檢測值增加速度的方法。光度測定試驗需在特定的儀器中進展，溫度一般為37℃±1℃.供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時間等，參照所用儀器和試劑的有關說明進展。為保證濁度和顯色試驗的有效性，應預先進展標準曲線的牢靠性試驗以及供試品的干擾試驗。標準曲線的牢靠性試驗當使用批號的鱟試劑或試驗條件有任何可能會影響檢驗結果的轉變時，需進展標準曲線的牢靠性試驗。用標準內毒素制成溶液，制成至少3個濃度的稀釋液(相鄰濃度間稀釋倍數不得大于10)，最低濃度不得低于所用鱟試劑的標示檢測限。每一稀釋步驟的混勻時間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時要求做2支陰性比照，當陰性比照的吸光度或透光率小于標準曲線最低點的檢測值或反響時間大于標準曲線最低點的反響時間，將全部數據進展線性回歸分析。依據線性回歸分析，標準曲線的相關系數r確實定值應大于或等于0.980，試驗方為有效。否則須重試驗。干擾試驗選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內毒素濃度(設為λm)，作為供試品干擾試驗中添加的內毒素濃度。按表4A、B、C和D。表4光度測定法干擾試驗溶液的制備編號內毒素濃度被參加內毒素的溶液平行管數A無供試品溶液2B標準曲線的中點〔或四周點〕的濃度〔設為λm〕供試品溶液2C至少3個濃度〔最低一點設為λ〕檢查用水每一濃度至少2D無檢查用水2注：A為稀釋倍數不超過MVD的供試品溶液。B為加人了標準曲線中點或靠近中點的一個內毒素濃度的，且與溶液A有一樣稀釋倍數的供試品溶液。C為如“標準曲線的牢靠性試驗”項下描述的，用于制備標準曲線的標準內毒素溶液。D為陰性比照。ct和cs，再按下式計算該試驗條件下的回收率(R〕。R=(cs-ct)/λm×100%當內毒素的回收率在50%-200%，則認為在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。當內毒素的回收率不在指定的范圍內，須按“凝膠法干擾試驗”中的方法去除干擾因素，并重復干擾試驗來驗證處理的有效性。當鱟試劑、供試品的來源、處方、生產工藝轉變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重進展干擾試驗。檢査法使用系列溶液C生成的標準曲線來計算溶液A的每一個平行管的內毒素濃度。試驗必需符合以下三個條件方為有效：(1)系列溶液C的結果要符合“標準曲線的牢靠性試驗”中的要求；(2)用溶液B中的內毒素濃度減去溶液A中的內毒素濃度后，計算出的內毒素的回收率要在50%-200%的范圍內；(3)陰性比照的檢測值小于標準曲線最低點的檢測值或反響時間大于標準曲線最低點的反響時間。結果推斷假設供試品溶液全部平行管的平均內毒素濃度乘以稀釋倍數后，小于規(guī)定的內毒素限值，判定供試品符合規(guī)定。假設大于或等于規(guī)定的內毒素限值，判定供試品不符合規(guī)定。注：本檢査法中，“管”的意思包括其他任何反響容器，如微孔板中的孔。EP(8.0) 〔1〕濁度法本法利用檢測鱟試液凝膠的濁度變化來測定供試品中內毒素的濃度。依據檢測原理，這種方法又可分為終點濁度法和動態(tài)濁度法。終點濁度法〔方法F〕系依據在孵育終止時，反響混合物的濁度〔吸光度或透光率〕與內毒素濃度之間的量化關系來測定內毒素含量的方法。動態(tài)濁度法〔方法C〕是檢測反響混合物的濁度到達某一預先設定的濁度到達某一預先設定的吸光度需要的反響時間，或是檢測濁度增加速度的方法。依據鱟試劑生產商的建議，光度測定試驗應在孵育溫度下進展〔通常為31℃。顯色法〔方法DE〕該法系利用檢測鱟試劑與內毒素反響使特定底物釋放出呈色團的多少而測定內毒素的含量的方法。依據檢測原理，這種方法又可分為終點顯色法和動態(tài)顯色法。終點顯色法〔方法E〕是依據反響混合物中內毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的呈色團的量之間存在的量化關系來測定內毒素含量的方法。動態(tài)顯色法〔方法D〕是檢測反響混合物的色度到達某一預定吸光度〔或透光率〕所需要的反響時間，或檢測色度增長速度的方法。依據鱟試劑生產商的建議，光度測定試驗應在孵育溫度下進展〔通常為31℃。預備試驗為確保濁度法和顯色法試驗結果準確、有效，應依據下面的說明，預先進展標準曲線的牢靠性和干擾因素試驗。當試驗條件發(fā)生了任何可能會影響檢驗結果的轉變時，需要驗證試驗方法。標準曲線的牢靠性試驗用內毒素標準溶液制成至少三個濃度的稀釋液，以獵取標準曲線。依據鱟試劑生產商的建議〔pH等毒素標準濃度的溶液至少做三支平行管。使用動態(tài)法檢測時，如預期范圍超過2log，為使標準曲線反映出每個對數增長，應相應增加標準品溶液。在鱟試劑生產商規(guī)定的內毒素濃度范圍內，相關系數確實定值︱r0.980。干擾因素試驗選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內毒素濃度。按表2.6.14-4制備溶液A、B、C、D。在鱟試劑生產商的建議測試條件〔供試品和鱟試液體積、供試品于鱟試液的體積比、孵育時間等〕下，對這些溶液開展試驗，每種溶液至少做兩組平行。2.6.14-4溶液內毒素濃度配制內毒素的溶液平行管或微孔數A無供試品溶液2B標準曲線的中點供試品溶液2C至少3個濃度〔最低濃度規(guī)定為λ〕BET2D0BET2A=稀釋倍數不超過MVD溶液B=參加了標準曲線終點或靠近中點的一個濃度內毒素的、且與溶液A有一樣稀釋倍數的供試品溶液。溶液C=如“3.預備試驗〔i〕標準曲線的牢靠性試驗”項下描述的、用于制備標準曲線的標準內毒素溶液。溶D=BET〔陰性比照〕用含標準內毒素的供試品溶液的平均內毒素含量減去供試品溶液的平均內毒素含量，計算內毒素的平均回收率。50%-200%之間時，可認為在此試驗條件下供試品溶液中不存在干擾因素。當內毒素的回收率不在指定范圍內，應依據凝膠法章節(jié)的“1.預備試驗〔ii〕干擾因素試驗”項下的說明排解干擾因素。重復干擾因素實驗以驗證處理的有效性。檢查法方法按3〕預備試驗下的ii〕干擾因素試驗”項下操作步驟。計算用系列溶液C生成的標準曲線計算溶液A的每一個平行管的內毒素濃度。試驗必需符合以下三個條件方有效。溶液D〔陰性比照〕的試驗結果不得大于所用鱟試劑的說明書中規(guī)定的空白值的限度。陽性比照系列溶液C的檢查結果要符合“3.預備試驗〔i〕標準曲線的牢靠性試驗”中的要求。用溶液B中的內毒素濃度減去溶液A中的內毒素濃度后，計算出的回收率在50%-200%的范圍內。結果推斷假設校正了稀釋倍數和濃度后，由溶液A的內毒素濃度計算得到的供試品內毒素平均濃度小于供試品的內毒素限度，可推斷供試品符合細菌內毒素檢查的要求。試劑鱟試液依據鱟試劑生產商的建議，用BET鱟試劑鱟試劑系從鱟〔美洲鱟或中華鱟〕的阿米巴細胞溶解產物制備而來。該試劑僅指在符合有關權威法規(guī)的生產條件下生產的鱟試劑產品。鱟試劑除了能與內毒素發(fā)生反響外，也能與某些β-葡聚糖反響。制備不與β-葡聚糖反響的鱟試劑時，需用鱟變形細胞溶解物中除去可與β-葡聚糖反響的GGBET〔細菌內毒素檢查用水〕BET檢查用水指注射用水R或由其他方法制取的內毒素含量低于所用鱟試劑的檢測限的水。為供給相關信息，有下面的章節(jié)。USP(36)濁度法系測量濁度的增加。依據檢測原理，可分為終點濁度法和動態(tài)濁度法。終點濁度法是依據反響混合物中的內毒素濃度及其在孵育終止時的濁度〔吸光度或透光率〕之間存在的定量關系來測定內毒素含量的方法。動態(tài)濁度法是檢測反響混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反響時間，或是檢測濁度增加速度的方法。顯色法系利用檢測LAL試劑與內毒素反響使特定底物釋放出呈色團的多少而測定內毒素的含量的方法。這種方法也可分為終點顯色法和動態(tài)顯色法。終點顯色法是依據反響混合物中內毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的呈色團的量之間存在的定量關系來測定內毒素含量的方法。動態(tài)顯色法是檢測反響混合物的色度到達某一預定吸光度〔或透光率〕所需要的反響時間，或檢測色度增長速度的方法。依據LAL試劑生產廠家的建議，光度測定試驗的試驗溫度一般為37±1℃。光度測定法的預備試驗為確保濁度法和顯色法試驗結果準確、有效，應依據下面的說明，預先進展標準曲線的牢靠性和干擾因素試驗。如試驗條件發(fā)生了任何可能會影響檢驗結果的轉變時，必需重進展驗證。標準曲線的牢靠性試驗——用內毒素標準溶液，制成至少三個濃度的稀釋液，以獵取標準曲線。依據LAL試劑生產廠家的說明〔體積比、pH等，每種標準內毒素濃度至少做三支平行管。如動態(tài)法的預期范圍超過2個對數，為使標準曲線反映出每個對數增長，應相應增加標準品溶液。依據LAL︱必需大于等于0.98。干擾因素試驗——選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內毒素濃度。按表4制備溶液A、B、C、D，每種溶液至少做兩組平行。遵照LAL試劑生產廠家的說明〔供試品和LAL試劑體積、供試品與LAL試劑的體積比、孵育時間等，對這些溶液開展試驗。4光度測定法干擾試驗溶液的制備溶液 內毒素濃度無標準曲線的中點

供試品溶液供試品溶液

22至少3個濃度〔最低一點設為λ〕 LAL試劑用水無 LAL試劑用水

22A：稀釋倍數不超過MVD溶液B：參加了標準曲線中點或靠近中點的一個濃度內毒素的、且與溶液A有一樣稀釋倍數的供試品溶液。溶液C：為“光度測定法的標準曲線牢靠性試驗”項下描述的、用于