生物化學(xué)第九章 DNA生物合成課件

第九章

DNA生物合成

周口師范學(xué)院生命科學(xué)系

(2008.12)

1主要內(nèi)容第一節(jié)DNA的復(fù)制第二節(jié)DNA的損傷與修復(fù)第三節(jié)逆轉(zhuǎn)錄和其它復(fù)制方式第四節(jié)DNA的體外復(fù)制-PCR主要內(nèi)容第一節(jié)DNA的復(fù)制2基因信息的傳遞DNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的長鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。生物體的遺傳信息就貯存在DNA的四種脫氧核糖核酸的排列順序中。

基因信息的傳遞DNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的長鏈大分子，3DNA通過復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子，從而決定生物的表現(xiàn)型。DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程就構(gòu)成了遺傳學(xué)的中心法則。在RNA病毒中，其遺傳信息貯存在RNA分子中。因此，在這些生物體中，遺傳信息的流向是RNA通過復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，通過反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給DNA，再由DNA通過轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的流向就稱為反中心法則。DNA通過復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，將4DNAdependentDNApolymerase——DDDPDNAdependentRNApolymerase——DDRPRNAdependentRNApolymerase——RDRPRNAdependentDNApolymerase——RDDPDNA復(fù)制（DDDP）轉(zhuǎn)錄（DDRP）RNA蛋白質(zhì)翻譯RNA復(fù)制（RDRP）反轉(zhuǎn)錄（RDDP）DNAdependentDNApolymerase——5第一節(jié)DNA的半保留復(fù)制

一、概念和實驗依據(jù)二、DNA聚合反應(yīng)的條件三、DNA的復(fù)制的起始點和方式四、原核細胞DNA的復(fù)制過程五、真核細胞DNA的復(fù)制六、DNA復(fù)制的忠實性

第一節(jié)DNA的半保留復(fù)制

一、概念和實驗依據(jù)6DNA在復(fù)制時，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個雙鏈子代DNA，每個子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)。一、概念和實驗依據(jù)復(fù)制親代DNA子代DNADNA在復(fù)制時，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩7

半保留復(fù)制模型按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。半保留復(fù)制模型按半保留復(fù)制方式，子代DN8DNA以半保留方式進行復(fù)制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的實驗所證明。該實驗首先將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。然后將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作密度梯度離心，將具有不同密度的DNA分離開。

DNA半保留復(fù)制的實驗證明：DNA以半保留方式進行復(fù)制，是在1958年由M.Mesel9DNA半保留復(fù)制研究實驗結(jié)果示意圖DNA半保留復(fù)制研究實驗結(jié)果示意圖10復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖(Cairns實驗)

將3H-胸苷標記大腸桿菌DNA，經(jīng)過近兩代的時間，3H-胸苷摻入大腸桿菌DNA。用溶菌酶把細胞壁消化掉，使完整的大腸桿菌染色體DNA釋放出來，放射自顯影，得到上圖。非復(fù)制部分（C）銀粒子密度較低，由一股放射性鏈和一股非放射性鏈構(gòu)成。已復(fù)制部分占整個染色體的三分之二，其中一條雙鏈（B）僅有一股鏈是標記的；另外一股雙鏈（A）的兩股鏈都是標記的，銀粒子密度為前二者的兩倍。ABC環(huán)狀DNA的復(fù)制

復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖(Cairns實驗)111）底物(substrate)2）模板(template)3）引發(fā)體和RNA引物4）各種酶系5)單鏈DNA結(jié)合蛋白

二DNA復(fù)制的條件

1）底物(substrate)二DNA復(fù)制的條件12以四種脫氧核糖核酸(deoxynucleotidetriphosphate)為底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。1）底物(substrate)

(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi以四種脫氧核糖核酸(deoxynucleotidetrip13DNA復(fù)制過程中脫氧核糖核苷酸的聚合反應(yīng)DNA復(fù)制過程中脫氧核糖核苷酸的聚合反應(yīng)14DNA復(fù)制是模板依賴性的，必須要以親代DNA鏈作為模板。親代DNA的兩股鏈解開后，可分別作為模板進行復(fù)制。2）模板(template)DNA復(fù)制是模板依賴性的，必須要以親代DNA鏈作為模板。親代15引物酶(primerase)本質(zhì)上是一種依賴DNA的RNA聚合酶（DDRP），該酶以DNA為模板，聚合一段RNA短鏈引物(primer)，以提供自由的3’-OH，使子代DNA鏈能夠開始聚合。引物酶需組裝成引發(fā)體才能催化RNA引物的合成。3）引發(fā)體和RNA引物

在E.coli中，含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)被稱為引發(fā)體(primosome)。

引物酶(primerase)本質(zhì)上是一種依賴DNA的RNA聚16

DnaA

DnaBDnaCDNA拓撲異構(gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

引發(fā)體的組裝形成DnaADnaBDna173'HO5'3

5

3

5

引物酶催化合成短鏈RNA引物分子

引物引物酶3'HO5'3535引物酶催化合成短鏈RNA引物分184)DNA復(fù)制的酶類a.引物酶(peimase)和引發(fā)體(primosome)b.DNA聚合酶(DNApolymetases)c.DNA連接酶（DNAligase）d.DNA解螺旋酶(DNAhelicase)e.拓撲異構(gòu)酶(topoisomerase)(兼具內(nèi)切酶和連接酶活力，能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài)，便于解鏈。)4)DNA復(fù)制的酶類a.引物酶(peimase)和引發(fā)體(19解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物

DNA復(fù)制酶類作用點模型解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA20DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase,DDDP

)簡稱：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合酶活性

2.核酸外切酶活性DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-215′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′3

5

外切酶活性

5

3

外切酶活性?能切除突變的DNA片段。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。

DNA聚合酶的核酸外切酶活性

5′AGCTTCAG22在原核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有三種，分別命名為DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ），DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ），DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ），這三種酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。參與DNA復(fù)制的主要是polⅢ和polⅠ。

種類和生理功能在原核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有三種，分別命名為DNA23polⅠ為具有三種酶活性的單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì)，可被特異的蛋白酶水解為兩個片段，其中的大片段保留了兩種酶活性,即5'→3'聚合酶和3'→5'外切酶活性，通常被稱為Klenowfragment。

Klenow片段的分子結(jié)構(gòu)polⅠ為具有三種酶活性的單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì)，可被特異24polⅢ由十種亞基組成不對稱異源二聚體結(jié)構(gòu)，其中

亞基具有5'→3'聚合DNA的酶活性，具有復(fù)制DNA的功能；而

亞基具有3'→5'外切酶的活性，與DNA復(fù)制的校正功能有關(guān)。

polⅢ的二聚體結(jié)構(gòu)polⅢ由十種亞基組成不對稱異源二聚體結(jié)構(gòu)，其中亞基具有25大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能

延長因子DNA聚合酶Ⅲ兩個亞基夾住DNADNA聚合酶Ⅲ異二聚體核心酶校對引物的結(jié)合和識別促使核心酶二聚化大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能延長26

原核生物三種DNA聚合酶比較

polⅠpolⅡpolⅢ5'→3'聚合酶活性+++5'→3'外切酶活性+--3'→5'外切酶活性+++生理功能填補缺口修復(fù)損傷校正錯誤未知復(fù)制DNA校正錯誤原核生物三種DNA聚合酶比較

polⅠpolⅡpol27真核生物五種DNA聚合酶DNA-pol

起始引發(fā)，有引物酶活性。參與低保真度的復(fù)制。DNA-pol

在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-pol

延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。DNA-pol

在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補缺口的作用。DNA-pol

真核生物五種DNA聚合酶DNA-pol起始引發(fā)，有引物28真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

分子量(kD)16.54.014.012.525.55'→3'聚合酶活性++?+++++++++3'→5'外切酶活性--+++生理功能起始引發(fā)引物酶活性低保真度復(fù)制線粒體DNA復(fù)制延長子代鏈的主要酶,解螺旋酶活性填補缺口,切除修復(fù),重組真核生物的DNA聚合酶DNA-pol分子量(kD)29DNA連接酶(DNAligase)可催化兩段DNA片段之間磷酸二酯鍵的形成，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶

DNA連接酶(DNAligase)可催化兩段DNA片段之間30DNA連接酶ATP（NAD+）ADP+Pi（NMN++AMP）HO5’3’5’3’3’5’5’3’DNA連接酶的連接作用DNA連接酶ATP（NAD+）ADP+Pi（NMN++AMP31DNA連接酶催化的條件①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈是完整的；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。DNA連接酶催化的條件32DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。

DNA連接酶的作用DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。DNA連接酶33解螺旋酶，又稱解鏈酶或rep蛋白，是用于解開DNA雙鏈的酶蛋白。每解開一對堿基，需消耗2分子ATP。

解螺旋酶(helicase)

解螺旋酶，又稱解鏈酶或rep蛋白，是用于解開DNA雙鏈的酶蛋34DNA拓撲異構(gòu)酶(DNAtopoisomerase)人類拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的分子結(jié)構(gòu)能夠松解DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的酶DNA拓撲異構(gòu)酶(DNAtopoisomerase)人類拓35108局部解鏈后DNA復(fù)制過程中正超螺旋的形成108局部解鏈后DNA復(fù)制過程中正超螺旋的形成36解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成37拓撲異構(gòu)酶的作用特點既能水解、又能連接磷酸二酯鍵拓撲異構(gòu)酶Ⅰ

拓撲異構(gòu)酶Ⅱ分類拓撲異構(gòu)酶的作用特點拓撲異構(gòu)酶Ⅰ分類38拓撲異構(gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓撲異構(gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。DNA拓撲異構(gòu)酶的作用機制

拓撲異構(gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)39單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB），又稱螺旋反穩(wěn)蛋白(HDP)，是一些能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。5）單鏈DNA結(jié)合蛋白單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandbindin40SSB的生理作用使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于其作為模板復(fù)制子代DNA；保護單鏈DNA，避免核酸酶的降解。SSB的生理作用使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)41DNA在復(fù)制時，需在特定的位點起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點(origin)。在原核生物中，復(fù)制起始點通常為一個，而在真核生物中則為多個。1)有一定的復(fù)制起始點三、DNA的復(fù)制的起始點和方式DNA在復(fù)制時，需在特定的位點起始，這是一些具有特定核苷酸排42細菌和酵母菌中DNA復(fù)制起始點的堿基序列細菌和酵母菌中DNA復(fù)制起始點的堿基序列43大腸桿菌復(fù)制起點成串排列的重復(fù)序列GATCTNTTNTTT成串排列的三個13bp序列共有序列共有序列TTATCCACADnaA蛋白結(jié)合位點四個9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DNA復(fù)制起點在起始階段的結(jié)構(gòu)模型大腸桿菌復(fù)制起點成串排列的重復(fù)序列GATCTNTTNTTT成44習(xí)慣上把兩個相鄰DNA復(fù)制起始點之間的距離（或DNA片段）定為一個復(fù)制子(replicon)

。復(fù)制子是獨立完成復(fù)制的功能單位。DNA復(fù)制時，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。復(fù)制子和復(fù)制叉習(xí)慣上把兩個相鄰DNA復(fù)制起始點之間的距離（或DNA片段）定455’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制子3’復(fù)制起始點與復(fù)制子示意圖5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’46復(fù)制起始點、復(fù)制子與復(fù)制叉（動畫演示）復(fù)制起始點、復(fù)制子與復(fù)制叉（動畫演示）47DNA復(fù)制時，以復(fù)制起始點(origin)為中心，向兩個方向進行解鏈，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。但在低等生物中，也可進行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。復(fù)制中的放射自顯影圖象2)雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)DNA復(fù)制時，以復(fù)制起始點(origin)為中心，向兩個方向48DNA的雙向和單向復(fù)制環(huán)狀DNA復(fù)制時所形成的θ結(jié)構(gòu)起始點復(fù)制叉的推進復(fù)制叉起始點起始點起始點復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制DNA的雙向和單向復(fù)制環(huán)狀DNA復(fù)制時所形成的θ結(jié)構(gòu)起始點49oriterABCA.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點B.復(fù)制中的兩個復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(termination,ter)DNA的雙向復(fù)制示意圖oriterA50參與DNA復(fù)制的DNA聚合酶，必須以一段具有3’端自由羥基（3’-OH）的RNA作為引物(primer)

，才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個核苷酸，而在真核生物中約為10個核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。

3)需要引物

參與DNA復(fù)制的DNA聚合酶，必須以一段具有3’端自由羥基（51DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈的方向必須是3'→5'。由于DNA分子中兩條鏈的走向相反，因此當(dāng)分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時，子代鏈的聚合方向也是不同的。4)半不連續(xù)復(fù)制

(semi-discontinuousreplication)DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA鏈，即模板DN523

5

3

5

3′5′3′5′解鏈方向領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)DNA的半不連續(xù)復(fù)制3′5′35353′5′3′5′解鏈方向領(lǐng)頭鏈隨從鏈DNA的53以3’→5’方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時基本上是連續(xù)進行的，其子代鏈的聚合方向為5’→3’，這一條鏈被稱為領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)。以5’→3’方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是5’→3’，這條鏈被稱為隨從鏈(laggingstrand)。領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。

領(lǐng)頭鏈和隨從鏈以3’→5’方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時基本上是54由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時是逐步解開的，因此，隨從鏈的合成也是一段一段的。DNA在復(fù)制時，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazakifragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個核苷酸，而在真核生物中約為100個核苷酸。

岡崎片段(Okazakifragment)由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時是逐步解開的，因此，隨從鏈的合成也55四、原核細胞DNA的復(fù)制過程1）復(fù)制的起始2）復(fù)制的延長3）復(fù)制的終止

四、原核細胞DNA的復(fù)制過程1）復(fù)制的起始56

DNA復(fù)制的起始階段，由下列步驟構(gòu)成。a.識別起始點：由解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA復(fù)制起始區(qū)域形成引發(fā)體；b.解旋解鏈：由拓撲異構(gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。c.SSB結(jié)合：單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）四聚體結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。d.合成引物：在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3'端自由羥基（3'-OH）。

1）復(fù)制的起始DNA復(fù)制的起始階段，由下列步驟構(gòu)成。1）復(fù)制的57

DnaA

DnaB

DnaCDNA拓撲異構(gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

引發(fā)體的組裝形成DnaADnaBDna583'HO5'3

5

3

5

引物酶催化合成短鏈RNA引物分子

引物引物酶3'HO5'3535引物酶催化合成短鏈RNA引物分592）復(fù)制的延長

復(fù)制的延長指在DNA聚合酶催化下，以3’→5’方向的親代DNA鏈為模板，從5’→3’方向聚合子代DNA鏈。其化學(xué)本質(zhì)是dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，磷酸二酯鍵不斷生成。在原核生物中，參與DNA復(fù)制延長的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中是DNA聚合酶δ。2）復(fù)制的延長復(fù)制的延長指在DNA聚合酶催化下，以3’→5605'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polDNA復(fù)制的延長過程5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTP61領(lǐng)頭鏈的合成過程領(lǐng)頭鏈的合成過程62隨從鏈的合成過程隨從鏈的合成過程63DNA聚合酶Ⅲ催化領(lǐng)頭鏈和隨從鏈同時合成DNA聚合酶Ⅲ催化領(lǐng)頭鏈和隨從鏈同時合成64DNA復(fù)制過程簡圖DNA復(fù)制過程簡圖653）復(fù)制的終止

在復(fù)制過程中形成的RNA引物，需由RNA酶來水解去除；RNA引物水解后遺留的缺口，由DNA聚合酶Ⅰ（原核生物）或DNA聚合酶

（真核生物）催化延長缺口處的DNA，直到剩下最后一個磷酸酯鍵的缺口。（a）去除引物，填補缺口：3）復(fù)制的終止在復(fù)制過程中形成的RNA引物，需由RNA酶來66在DNA連接酶的催化下，生成最后一個磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的雙螺旋DNA長鏈后分開。（2）連接岡崎片段，分開子代DNA在DNA連接酶的催化下，生成最后一個磷酸酯鍵，將岡崎片段連接675

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP568五、真核細胞DNA的復(fù)制真核生物DNA復(fù)制的特點真核生物的DNA聚合酶端粒和端粒酶（telomerase）五、真核細胞DNA的復(fù)制真核生物DNA復(fù)制的特點69

真核生物DNA復(fù)制的特點A、真核生物染色體有多個復(fù)制起點，稱為自主復(fù)制序列（ARS）或復(fù)制基因(replicator);多復(fù)制眼，呈雙向復(fù)制，多復(fù)制子。D、真核生物染色體在全部復(fù)制完之前起點不再重新開始復(fù)制；而在快速生長的原核生物染色體DNA復(fù)制中，起點可以連續(xù)發(fā)動復(fù)制。真核生物快速生長時，往往采用更多的復(fù)制起點。B、岡崎片段長約200bp。C、真核生物DNA復(fù)制速度比原核慢，速度為1000～3000bp/min(僅為原核生物的1/20～1/50）。真核生物DNA復(fù)制的特點A、真核生物染色體有多個復(fù)制起點，70真核細胞DNA復(fù)制的特點

多個起點復(fù)制起點起點起點起點起點起點真核細胞DNA復(fù)制的特點多個起點復(fù)制起點起點起點起點起點71G、RPA：真核生物的單鏈結(jié)合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物；DNA聚合酶ε填補缺口。E、真核生物有多種DNA聚合酶,DNA聚合酶Ⅲ（δ）是真正的復(fù)制酶，在PCNA存在下有持續(xù)的合成能力。PCNA稱為增殖細胞核抗原，相當(dāng)于大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ的β-夾子，RFC蛋白相當(dāng)于夾子裝配器。F、真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu).它是由許多成串的短重復(fù)序列組成，端粒功能是穩(wěn)定染色體末段結(jié)構(gòu)，防止染色體間的末端連接，并可補償滯后鏈5’-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色體保持一定長度。端粒酶是含一段RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶.G、RPA：真核生物的單鏈結(jié)合蛋白；RNaseH1和MF-172真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶

分子量亞基數(shù)細胞內(nèi)分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶

110-23，000多個細胞核～80%無120，000一個細胞核和線粒體2～15%無-400，000一個細胞核+10～25%5

-3

外切酶DNA聚合酶

DNA聚合酶

45，000一個細胞核10～15%無真核生物的DNA聚合酶DNA分子量DNA110-23，00073真核細胞DNA復(fù)制示意圖真核細胞DNA復(fù)制示意圖74真核和原核DNA細胞復(fù)制比較真核和原核DNA細胞復(fù)制比較75

端粒（telomere）是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。真核生物端粒和端粒酶端粒（telomere）是指真核生物染色體線性DNA分76

功能?維持染色體的穩(wěn)定性?保證DNA復(fù)制的完整性端粒的結(jié)構(gòu)特點?由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。?末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、T堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…功能?維持染色體的穩(wěn)定性端粒的結(jié)構(gòu)特點?由末端單鏈D77端粒酶（telomerase）

DNA復(fù)制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機制在引物被降解后合成相應(yīng)的片段.如果沒有特殊的機制合成末端序列，染色體就會在細胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清，端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，實質(zhì)上是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，它可以其RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄過程對末端DNA鏈進行延長。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒酶（telomerase）DNA復(fù)制需要引物78端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

端粒酶的組成和作用線性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進行延長反應(yīng)。5

3

3

55

3

3

5端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,79端粒酶的作用機制——爬行模型端粒酶的作用機制——爬行模型80端粒酶的爬行模型（動畫演示）端粒酶的爬行模型（動畫演示）81

六DNA復(fù)制的忠實性

DNA復(fù)制過程是一個高度精確的過程。據(jù)估計，大腸桿菌DNA復(fù)制5

109堿基對僅出現(xiàn)一個誤差，保證復(fù)制忠實性的原因主要有以下三點:

DNA聚合酶的高度專一性（嚴格遵循堿基配對原則，錯配率為7

10-6）

DNA聚合酶的校對功能（錯配堿基被3’-5’外切酶切除）

起始時以RNA作為引物

六DNA復(fù)制的忠實性

DNA復(fù)制82復(fù)制的保真性和堿基選擇DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價（氫鍵）與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。

復(fù)制的保真性和堿基選擇DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價（83DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合酶活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，DNA-pol不表現(xiàn)外切酶活性。DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀A：DNA-pol的84DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯配鹼基復(fù)制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯配核苷酸DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯配鹼基復(fù)制方向正確核苷酸5′585

起始時以RNA作為引物的作用

DNA復(fù)制為什么要合成一個RNA引物，而后又把這個引物消除呢？這是保證DNA聚合過程高度精確的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校對復(fù)制過程中的核苷酸，也就是說聚合酶在開始形成一個新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一條低忠實性的多核苷酸來開始DNA的合成，并以核糖核苷酸來表示是“暫時”的，當(dāng)DNA開始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠實性的脫氧核苷酸取而代之，確保復(fù)制的忠實性。

起始時以RNA作為引物的作用

86

第二節(jié)DNA的損傷（突變）與修復(fù)

一、DNA突變及意義二、引起DNA突變的因素三、DNA突變的分子改變類型四、DNA損傷修復(fù)機制第二節(jié)DNA的損傷（突變）與修復(fù)87由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNA一級結(jié)構(gòu)的任何異常的改變稱為DNA的損傷，也稱為突變（mutation）。常見的DNA的損傷包括堿基脫落、堿基修飾、交聯(lián)，鏈的斷裂，重組等。

一、DNA突變及意義突變是進化、分化的分子基礎(chǔ)突變導(dǎo)致基因型改變突變導(dǎo)致死亡突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNA一級結(jié)構(gòu)的任何異常的改變稱為D88（1）自發(fā)因素：自發(fā)脫堿基：由于N-糖苷鍵的自發(fā)斷裂，引起嘌呤或嘧啶堿基的脫落。每日可達近萬個核苷酸殘基。自發(fā)脫氨基：胞嘧啶自發(fā)脫氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自發(fā)脫氨基可生成次黃嘌呤。每日可達幾十到幾百個核苷酸殘基。復(fù)制錯配：由于復(fù)制時堿基配對錯誤引起的損傷，發(fā)生頻率較低。二、引起突變的因素

（1）自發(fā)因素：二、引起突變的因素89由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA損傷。其中，X射線和電離輻射常常引起DNA鏈的斷裂，而紫外線常常引起嘧啶二聚體的形成，如TT，TC，CC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價鍵連接的環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而會引起復(fù)制障礙。

（2）物理因素：由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA90嘧啶二聚體的形成

UV嘧啶二聚體的形成UV91

脫氨劑：如亞硝酸與亞硝酸鹽，可加速C脫氨基生成U，A脫氨基生成H。（3）化學(xué)因素：脫氨劑：如亞硝酸與亞硝酸鹽，可加速C脫氨基生成U，A脫92

烷基化劑：這是一類帶有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起堿基或磷酸基的烷基化，甚至可引起鄰近堿基的交聯(lián)。

DNA加合劑：如苯并芘，在體內(nèi)代謝后生成四羥苯并芘，與嘌呤共價結(jié)合引起損傷。

堿基類似物：如5-FU，6-巰基嘌呤（6-MP）等，可摻入到DNA分子中引起損傷或突變。

斷鏈劑：如過氧化物，含巰基化合物等，可引起DNA鏈的斷裂。

烷基化劑：這是一類帶有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷93三、突變的分子改變類型三、突變的分子改變類型94

DNA突變的類型

-T-C-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-G-C-G-A-C-A-T-G-C-轉(zhuǎn)換野生型基因

-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基對的置換(substitution)移碼突變(framesshiftmutation)

-T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-插入

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失ATDNA突變的類型

-T-C-C-G-C-T-G-T-A-95DNA分子上單一堿基的改變稱點突變(pointmutation)發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。

轉(zhuǎn)換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。

顛換點突變(pointmutation)DNA分子上單一堿基的改變稱點突變(pointmutati96鐮形紅細胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)

亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

glu

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CTCGAG基因血紅蛋白

-亞基的點突變鐮形紅細胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val·h97

缺失

一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。

插入

原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間?？蛞仆蛔兪侵溉?lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。

缺失或插入都可導(dǎo)致框移突變?？蛞仆蛔?nèi)笔б粋€堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。98谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起的框移突變谷酪蛋99DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型

重排(重組Recombination)DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。由基因重排引起的100DNA損傷修復(fù)(repair)：是對已發(fā)生分子改變的補償措施，使其盡可能回復(fù)為原有的天然狀態(tài)光修復(fù)(lightrepair)切除修復(fù)(excisionrepair)重組修復(fù)(recombinationrepair)SOS修復(fù)

修復(fù)的主要類型：無差錯修復(fù)有差錯傾向修復(fù)四、DNA損傷修復(fù)機制DNA損傷修復(fù)(repair)：是對已發(fā)生分子改變的補償101這是一種廣泛存在的修復(fù)作用，能夠修復(fù)任何嘧啶二聚體的損傷。修復(fù)過程由光修復(fù)酶(photolyase)催化完成。1）光修復(fù)（lightrepair）其修復(fù)過程為：a.光修復(fù)酶(photolyase)識別嘧啶二聚體并與之結(jié)合形成復(fù)合物。b.在300-600nm可見光照射下，酶獲得能量，將嘧啶二聚體的丁酰環(huán)打開。c.光修復(fù)酶從DNA上解離。這是一種廣泛存在的修復(fù)作用，能夠修復(fù)任何嘧啶二聚體的損傷。1102DNA紫外線損傷的光裂合酶修復(fù)1、形成嘧啶二聚體2、光復(fù)合酶結(jié)合于損傷部位3、酶被可見光激活4、修復(fù)后酶被釋放DNA紫外線損傷的光裂合酶修復(fù)1、形成嘧啶二聚體2、光復(fù)合酶103這也是一種廣泛存在的修復(fù)機制，可適用于多種DNA損傷的修復(fù)。切除修復(fù)機制的基本過程是將受損的DNA片段切除，然后再以對側(cè)鏈為模板，重新合成新鏈進行修復(fù)。2）切除修復(fù)(excisionrepair)這也是一種廣泛存在的修復(fù)機制，可適用于多種DNA損傷的修復(fù)。104DNA的損傷和切除修復(fù)堿基丟失堿基缺陷或錯配結(jié)構(gòu)缺陷切開核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA連接酶AP核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切開切除修復(fù)連接糖苷酶插入酶堿基取代DNA的損傷和切除修復(fù)堿基丟失堿基缺陷或錯配結(jié)構(gòu)缺陷切開核酸105這是DNA的復(fù)制過程中所采用的一種有差錯的修復(fù)方式。修復(fù)時，利用重組蛋白的核酸酶活性，將另一股健康親鏈與損傷缺口相互交換。

3）重組修復(fù)(recombinationrepair)這是DNA的復(fù)制過程中所采用的一種有差錯的修復(fù)方式。3）106DNA的重組修復(fù)胸腺嘧啶二聚體復(fù)制核酸酶及重組蛋白修復(fù)復(fù)制DNA聚合酶DNA連接酶重組DNA的重組修復(fù)胸腺嘧啶二聚體復(fù)制核酸酶及重組蛋白修復(fù)復(fù)制D107這是一種特殊的