三章細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)市公開課獲獎?wù)n件省名師優(yōu)質(zhì)課賽課一等獎?wù)n件

第三章

細(xì)胞生物學(xué)試驗技術(shù)METHODSANDTECHNIQUES1/12第三節(jié)細(xì)胞分離技術(shù)2/12一、離心技術(shù)是分離細(xì)胞器（如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本伎倆。轉(zhuǎn)速為10~25kr/min離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機(jī)。當(dāng)前超速離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min，離心力超出500Kg。

3/12（一）差速離心Differentialcentrifugation特點(diǎn)：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐層離心。用途：分離大小相差懸殊細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降次序：核——線粒體——溶酶體與過氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體——核蛋白體。可將細(xì)胞器初步分離，常需深入經(jīng)過密度梯離心再行分離純化。4/12LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation5/12（二）密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)頂部，經(jīng)過離心力場作用使細(xì)胞分層、分離。類型：速度沉降、等密度沉降。慣用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分離活細(xì)胞介質(zhì)要求：1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高；2）PH中性或易調(diào)為中性；3）濃度大時滲透壓不大；4）對細(xì)胞無毒。6/121、速度沉降velocitysedimentation

用途：分離密度相近而大小不等細(xì)胞或細(xì)胞器。特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒最小密度。原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自沉降系數(shù)以不一樣速度沉降而到達(dá)分離。7/122.等密度沉降isopycnicsedimentation用途：分離密度不等顆粒。特點(diǎn)：介質(zhì)密度較高，陡度大，介質(zhì)最高密度應(yīng)大于被分離組分最大密度。所需力場通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速離心。原理：樣品各成份在連續(xù)梯度介質(zhì)中經(jīng)過一定時間離心則沉降到與本身密度相等介質(zhì)處，并停留在那里到達(dá)平衡，從而將不一樣密度成份分離。8/12Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation9/12二、流式細(xì)胞術(shù)用途：對單個細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選一門技術(shù)。原理：包在鞘液中細(xì)胞經(jīng)過高頻振蕩控制噴嘴，形成包含單個細(xì)胞液滴，在激光束照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可依據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計（flowcytometer）。10/1211/12三、細(xì)胞電泳原理：在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈正或負(fù)電荷，能在外加電場作用下發(fā)生泳動。各種細(xì)胞或處于不一樣生理狀態(tài)同種細(xì)胞荷電量有所不一樣，