微生物限度檢查法省名師優(yōu)質(zhì)課賽課獲獎課件市賽課一等獎課件

微生物限度檢查法第1頁1．微生物程度檢驗法概述2．我國藥品微生物程度標準發(fā)展情況3．我國藥品微生物程度檢驗方法發(fā)展情況4．微生物程度檢驗法所需材料5．微生物程度檢驗試驗用物品準備6．無菌室技術要求7．細菌、霉菌與酵母菌檢驗方法供試品抽樣、保留及檢驗量試驗操作前準備供試液制備對照用菌液制備第2頁菌數(shù)測定陰性對照試驗細菌、霉菌（酵母菌）檢驗程序供試液稀釋（10倍遞增稀釋法）注平皿傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落計數(shù)菌數(shù)匯報規(guī)則注意事項8.細菌、霉菌（酵母菌）其它檢驗方法①管稀釋法（試管法、MPN法）②濾膜法③計數(shù)板法④儀器法⑤平板涂布法第3頁①表面涂抹平板法②濾膜培養(yǎng)法③酵母菌鏡檢計數(shù)法9.大腸桿菌檢驗法概述、原理檢驗程序增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)純培養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢生化試驗（IMViC）試驗中注意事項10．沙門菌檢驗法11．銅綠假單胞菌檢驗法12．金黃色葡萄球菌檢驗法13．破傷風梭菌檢驗法14．活螨檢驗法15．結(jié)果判斷第4頁1．微生物程度檢驗法意義藥品是防病治病、關系用藥者生命健康特殊商品，必須確保其質(zhì)量，用藥安全與有效。微生物污染藥品引發(fā)藥源性疾病屢見不鮮，在國內(nèi)外都有報道。為確保藥品質(zhì)量，必須對微生物污染進行必要控制和檢驗。其意義在于：已經(jīng)有許多實例表明，藥品污染微生物不但危及病人用藥安全，而且也直接影響藥品有效性，所以藥品衛(wèi)生質(zhì)量是藥品質(zhì)量不可分割部分。反應藥品生產(chǎn)工藝科學性、合理性及質(zhì)量管理水平。經(jīng)過檢驗，凡工藝條件、生產(chǎn)管理水平、生產(chǎn)人員素質(zhì)差，不注意文明生產(chǎn)單位和企業(yè)，其生產(chǎn)藥品，染菌必定嚴重，不合格率無疑就高。微生物程度檢驗是提供藥品衛(wèi)生質(zhì)量情況主要依據(jù)，因而確保銷售與使用過程中藥品有效性與安全性，是促進與提升生產(chǎn)單位全方面質(zhì)量管理水平與提升藥品質(zhì)量主要依據(jù)。微生物程度檢驗法概述第5頁2．微生物程度檢驗范圍依據(jù)藥品使用要求，可劃分為兩大類：要求滅菌藥品：包含注射劑和輸液劑，及用于體腔、嚴重燒傷、潰瘍、出血及眼科用藥等制劑。非要求滅菌藥品：包含慣用口服制劑與普通外用制劑。對這一部分制劑普通不要求絕對無菌，允許一定限量微生物存在，但同時要求不得有可疑致病細菌存在。因為致病菌范圍很廣，各國藥典都要求了幾個常見致病菌或指標菌作為控制菌。在非要求滅菌制劑中，對每克或每毫升藥品按劑型或品種不一樣要求：染菌量檢驗：包含細菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)測定，以檢驗這幾類微生物對藥品污染程度?？刂凭鷻z驗：包含大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌檢驗等。第6頁3．藥品微生物程度檢驗抽樣量與檢驗量藥品微生物程度檢驗中困難，最根本原因在于檢驗對象本身特殊性。藥品微生物程度檢驗對象特征：不確定性：藥品受外來微生物污染，這種污染是可無可有；在有中又可多可少；其種類能夠多樣。污染情況可依生產(chǎn)、設備、原材料、管理、劑型等條件而定，非藥品本身所固有。所以微生物程度檢驗對象是不確定。藥品所要求檢驗項目，除無菌檢驗、熱原檢驗含有上述性質(zhì)，其它項均無此特征。這一點往往被忽略。污染對藥品而言是一個意外事件。污染批號中不合格品是一個隨機變量。分布不均勻性：不均勻性是不確定性另一個表現(xiàn)形式，在一個批號內(nèi)產(chǎn)品有被污染，有不被污染，分布不勻；在被污染部分中有數(shù)量極多，有較少，種類上能夠復雜或較單一。這種不均勻性源于污染源復雜性；原輔料污染、工藝污染、空間污染第7頁和操作人員污染等等組成污染量多少差異，形成不均態(tài)。再者，微生物含有簇團性；簇團大小、緊密程度是可遺傳，簇團分散性差異極大，該特點無疑強化了不均勻性?；铙w特征：藥典中以活微生物作為檢驗對象也是獨特特征。因為以上特殊性，抽樣對微生物程度檢測值將產(chǎn)生很大影響。當藥品無污染時，抽樣將不影響檢驗，當批產(chǎn)品存在污染品時，抽樣樣本是隨機變量，抽樣影響以下：抽樣方法：不一樣抽樣方法對批產(chǎn)品總體代表性是不一樣，測定值也是有差異。如抽取可疑樣品與隨機抽樣，其檢出率與數(shù)字顯然前者大于后者。抽樣量：抽樣量多少，對樣本代表性極為主要，如含10％不合格率批產(chǎn)品，從中抽取2件數(shù)為樣本進行控制菌檢驗時，有81％機率判定為合格品，而抽取30件數(shù)時，會有96％機率判定為不合格品。第8頁以上表明抽樣方法、抽樣數(shù)量、抽樣次數(shù)均影響測定結(jié)果。以控制菌檢驗為例，決定染菌檢出是否必須具備兩個條件：（A）樣品是否是含染菌樣品；（B）檢驗操作正確無誤，其中（A）是前提條件。中國藥典關于抽驗方法與抽樣數(shù)量要求：供試品為隨機抽樣，普通抽樣量為檢驗用量（兩個以上最小包裝單位）3倍量。對異常供試品應針對性抽樣，對外觀可疑污染或?qū)τ袪幾h復驗樣品應抽取能夠污染和有爭議復驗原樣品。對異常供試品應針對性抽樣，對外觀可疑污染或?qū)τ袪幾h復驗樣品應抽取能夠污染和有爭議復驗原樣品。凡能從藥品、瓶（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍）外觀看出發(fā)霉、生蟲以及變質(zhì)藥品無須再繼續(xù)檢驗，應直接判為不合格。不能以有時外觀有上述情況而檢驗內(nèi)容為合格，來判定該藥品合格，因為瓶口染菌，對服用者是不安全，如自瓶口直接服藥時，所染菌隨之進入人體，同時發(fā)覺瓶口一旦染菌，瓶內(nèi)藥液最終要受到污染。檢驗量與抽樣量是兩種不一樣范圍量，后者指從全批產(chǎn)品第9頁（或抽樣全過程）抽取單位包裝，前者是指檢驗用量，普通抽樣量大于檢驗量。檢驗量只是抽樣量各包裝混合樣品一部分。中國藥典要求檢驗量為每次最少應分取兩瓶（盒）以上樣品共10克或10毫升，中藥蜜丸最少應分取4丸以上共10克。當前我國以1克或1毫升、膜劑以10cm2作為匯報單位；英美藥典及歐洲藥典也是以1克或1毫升作為限量，但控制菌有是以10克或10毫升作為限量，比我國限量要求嚴格?？傊?，抽樣量和檢驗量大小對檢驗結(jié)果影響較大（盡管當前抽樣方案還存在不科學，漏檢率高）。因為藥品微生物檢驗是破壞性檢驗，檢驗1瓶（盒）會破壞1瓶（盒），檢驗量愈大，則破壞性愈大，尤其對珍貴藥品，生產(chǎn)單位、經(jīng)營單位損失也就越大。所以，怎樣確定適宜既能滿足抽樣檢驗基本要求，又能使生產(chǎn)、經(jīng)營者可接收抽樣方案，是當前需要處理問題。但當前要求必須遵照，不能隨意變動，尤其不能降低（除對珍貴、微量包裝藥品可酌情降低檢驗量除外）。第10頁微生物程度檢驗方法發(fā)展情況

1．1980年我國藥品微生物程度檢驗工作正式發(fā)行《藥品衛(wèi)生檢驗方法》。2．1984年出版第二版《藥品衛(wèi)生檢驗方法》。3．1990.中檢所出版第三版，主要對原《方法》中各地反應意見較多問題進行了改寫；增加了部分檢驗方法和供試液制備方法；為了同國內(nèi)外檢驗方法相協(xié)調(diào)，對一些內(nèi)容作了對應更改，另外，還參考國家標準編寫格式作了編排。4．1990年版藥典第二增補本收載了微生物程度檢驗法。這也是我國首次在藥典上收載此方法。5．1995年版藥典也收載了此檢驗法，少數(shù)劑型收載了程度要求。（20個化學藥品要求程度）。第11頁6、藥典一、二部同時收載了檢驗法和程度標準。首次把微生物程度檢驗法和程度標準同時公布。第12頁微生物程度標準發(fā)展情況

1．1972年開展此項工作2．1978年頒布我國第一個“藥品衛(wèi)生標準”3．1986年頒布修改后“藥品衛(wèi)生標準”，1987年12月1日起供內(nèi)部執(zhí)行4．1989年下達“藥品衛(wèi)生標準補充要求和說明”5．1990年版藥典第二增補本收載了20個化學藥品種微生物程度標準要求，與國際通例一致6．1995年版藥典少數(shù)幾個劑型（滴眼劑等）收載了微生物程度。要求按微生物程度檢驗法檢驗不得有菌生長7．藥典按劑型、中西藥分類要求微生物程度，還對幾個生化藥品在各論中項下作了詳細要求第13頁實

驗

所

用

培

養(yǎng)

基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD）膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）4－甲基傘形酮葡糖苷酸蛋白胨培養(yǎng)基（MUG）乳糖培養(yǎng)基5％乳糖培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基枸櫞酸鹽培養(yǎng)基曙紅亞甲藍瓊脂（EMB）麥康凱瓊脂（MacC）營養(yǎng)肉湯第14頁微生物程度檢驗慣用檢驗設備及器材

恒溫培養(yǎng)箱30～35℃36±1℃霉菌培養(yǎng)箱25～28℃恒溫水浴箱45±1℃凈化工作臺生物顯微鏡1500X體視顯微鏡或放大鏡電冰箱電熱干燥箱250～300℃高壓蒸汽消毒器電子天平或藥品天平感量0.1g勻漿儀或研缽錐形瓶100ml，250ml，500ml，1000ml第15頁直形吸管1ml，10ml量杯10ml試管18x180mm，13x200mm，30x200mm試管筒培養(yǎng)皿9cm培養(yǎng)皿筒陶瓦蓋12cm量筒100ml，500ml，1000ml濾器及微孔濾膜孔徑0.45±0.02um注射器1ml，5ml，10ml，30ml載玻片及蓋玻片接種針及接種環(huán)試管架第16頁乙醇燈康氏振蕩器離心機500～4000／min紫外燈365nm玻璃或搪瓷消毒缸（帶蓋）大、小橡皮乳頭乙醇棉球或碘伏棉球滅菌剪刀、鑷子、鋼錐滅菌稱樣紙滅菌不銹鋼藥匙火柴、記號筆（玻璃鉛筆）白瓷盤、洗手盆試驗統(tǒng)計紙第17頁細菌、霉菌與酵母菌檢驗方法

（平皿菌落計數(shù)法）

（一）供試品抽樣、保留及檢驗量1．

供試品應隨機抽樣。普通抽樣量（2個以上最小包裝單位）為檢驗量3倍量。2．對異常供試品應針對性抽樣。抽樣時，凡發(fā)覺有異?；蚩梢蓸悠?，應選取有疑問樣品，但機械損傷、顯著破裂包裝不得作為樣品。凡能從藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍）、外觀看出長螨、發(fā)霉、蟲蛀及變質(zhì)藥品，可直接判為不合格，無需在抽樣檢驗。不能以外觀有上述情況而檢驗內(nèi)容物合格，來判斷該藥品合格。3．供試品收檢后應及時檢驗，若有困難，應存放在該品種要求儲存條件下（普通為陰涼干燥處），勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)污染菌因保留條件不妥引發(fā)致死、損傷或繁殖。第18頁4．供試品在檢驗之前，應保持原包裝狀態(tài)，禁止開啟，包裝已開啟樣品不得作為供試品。5．供試品取樣必須在凈化條件下無菌操作，嚴防再污染。（原料藥、裝量大藥）6．有劑型檢驗量均需取自2個以上包裝單位（中藥蜜丸、膜劑，除需取自2個以上包裝外，還應取4丸、片以上樣品）。7．固體及半固體（粘稠性供試品）制劑檢驗量為10克。8．液體制劑檢驗量為10毫升。9．膜劑除另有要求外，中藥膜劑檢驗量為30～50cm2，化學膜劑及生化藥膜劑檢驗量為100cm2。10．珍貴或微量包裝供試品檢驗量能夠酌減，除另有要求外，口服固體制劑不低于3克，液體制劑采取原液者不得少于6毫升，采取供試液者不得少于3毫升，外用藥品不得少于5克6第19頁（二）試驗操作前準備1．將供試品及全部已滅菌平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、研缽、吸管（1ml10ml）、量筒、稀釋劑等移至無菌室內(nèi)。每次試驗所用物品必須事先計劃，準備足夠用量，防止操作中出入操作間。編號后將全部外包裝（牛皮紙、布）取掉。另外還有增菌液、培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，保持在45℃左右水浴中）、MUG培養(yǎng)基試管等……………..濕熱滅菌物品稱量紙、手術鑷子、剪子等…………...干熱滅菌物品2．開啟無菌室紫外殺菌燈和空氣凈化裝置，并使其工作不少于30分鐘。3．操作人員用肥皂洗手，關閉紫外殺菌燈，進入緩沖間，換工作鞋。再用0.1％苯扎溴銨溶液或其它消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴無菌衣、帽、口罩。第20頁4．操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供試品瓶、盒、袋等開口處周圍，待干后用滅菌手術鑷或剪將供試品啟封。（三）供試液制備（1：10供試液）按供試品理化特征與生物學特征采取適宜方法制備供試液。不得改變污染微生物數(shù)量和種類。1．液體供試品取供試品10ml，加入到稀釋劑90ml中，混勻，作為供試液。（有書上講取10ml，置滅菌錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，搖勻）。①

油劑可加適量聚山梨酯－80；第21頁

②氣霧劑、噴霧劑供試品將供試品置冰室內(nèi)2hr后，取出，用滅菌鋼錐小心鉆孔，使拋射劑遲緩釋放，然后用滅菌注射器加入稀釋劑，混勻后吸收相當于10g或10ml供試品，再稀釋成1：10供試液。USPXXIV要求是拋射劑導出后，吸收10ml或取10g供試品，加稀釋液使成100ml。③合劑（系指含蜂蜜或王漿者）與滴眼劑可用供試品作為供試液。（滴眼劑不得檢出霉菌和酵母菌）。含蜂蜜、王漿制劑2．固體、半固體或粘稠供試品稱取供試品10g，置裝有0.9％無菌氯化鈉100ml勻漿杯中，用勻漿儀（3000～5000r／2－4min），或其它適宜方法（振蕩器或研缽研磨等方法分散混勻，作為供試液。在制備過程中，必要時可加適量聚山梨酯－80，并適當加溫，但不應超出45℃。第22頁3．非水溶性供試品①軟膏劑、乳化劑稱取供試品5g(5ml)，加入含已滅菌熔化并保溫45℃左右司盤－8050g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯－8010g混合物燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團后，慢慢加入45℃左右0.9％無菌氯化鈉溶液約80ml，（實際測可能是85ml），邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為供試液（1：20）。②油劑取供試品10ml，加入無菌聚山梨酯－805～8ml，搖勻，再加入稀釋劑至100ml。③栓劑稱取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加適量稀釋劑，置45℃左右水浴保溫10min，使溶，加入無菌聚山梨酯－805～8ml，振搖使之乳化，再加稀釋劑（稀釋劑和聚山梨酯－80總量為100ml），搖勻第23頁④

茶劑取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml，振搖30秒，以滅菌紗布過濾（如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱樣結(jié)果按1：10加稀釋劑，浸泡30分鐘）。⑤

膠丸劑（如魚肝油丸等）同膠囊劑⑥

膠劑（如阿膠）取膠劑若干，搗碎，稱取10g，再用研缽研細，轉(zhuǎn)入250ml錐形瓶內(nèi)，加入稀釋劑100ml，置45℃±1℃水浴中，振搖使溶，即為1：10供試液。⑦膠丸劑（如魚肝油丸等）同膠囊劑⑧

膠劑（如阿膠）取膠劑若干，搗碎，稱取10g，再用研缽研細，轉(zhuǎn)入250ml錐形瓶內(nèi)，加入稀釋劑100ml，置45℃±1℃水浴中，振搖使溶，即為1：10供試液。第24頁4．含抑菌成份供試品（僅限檢驗控制菌時用）凡含防腐劑或抑菌成份且影響檢驗（供試品按常規(guī)檢驗法，加入要求量對照菌，不能檢出時）供試品，可依據(jù)供試品性質(zhì)，控制菌特征及檢驗條件等按以下方法之一或兩種以上方法聯(lián)合應用處理后，依法檢驗。同時做陽性和陰性對照。藥典要求：供試品如干擾控制菌檢驗，按以下方法處理后，依法檢驗。實際操作中：先把供試液離心（500r/min5min）這么菌體在上層，吸收上清液過濾，把濾膜直接貼在培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可，詳細吸收上清液10ml還是100ml按品種要求自己定。取10ml過濾測出來是個／克，取100ml過濾測出來是個／10克。（程度檢驗）①稀釋法：將供試品種入較大量培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用濃度（使該供試液稀釋至陽性對照菌能生長濃度）。此法用作控制菌檢驗和程度檢驗。本法適合用于抑菌作用不強中藥、化學藥品檢驗。第25頁②離心沉淀集菌法：取要求量供試液于無菌刻度離心管中，離心（每分鐘3000轉(zhuǎn)）30分鐘，棄去上清液，留底部集菌液約2ml，再稀釋成原要求供試液。如有不溶性藥渣，可先離心（每分鐘500轉(zhuǎn)）5分鐘，取全部上層液，再行集菌處理。本法適合用于一些抑菌作用不強中、西藥品，如蜜丸、水丸、片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑及液體制劑。應用本法需嚴防操作污染，并注意上層液或上清液和底部殘渣分離，防止沉渣混入其中。③薄膜過濾法：取要求量供試液，置稀釋劑100ml中，搖勻，以無菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑小于0.45um±0.02um微孔濾膜過濾器中，減壓抽干后，用稀釋劑沖洗濾膜3次，每次50～100ml，取出濾膜備檢。沖洗時每次最好不少于100ml，能夠?qū)⑴囵B(yǎng)基加入濾器或取出濾膜，加入增菌培養(yǎng)基中，能夠用加入濾器中供試品量來控制檢驗量，也能夠把濾膜取出來剪成2～4片，使每片相當于供試品1g或1ml，放入增菌培養(yǎng)基中，作控制菌檢驗。第26頁本法適合用于水溶性抑菌成份中、西藥品和滴眼劑等制劑“滅活”處理。安放濾膜時，注意濾膜與濾器應密合，預防濾膜破損、漏液。本法所用濾膜孔徑0.45um±0.02um。④（鈍化）中和法：凡含磺胺、汞、砷類或防腐劑供試品，可用對應試劑鈍化活性因子，中和毒性后制成供試液。磺胺類藥品中和法取要求量含磺胺類供試品，于100ml增菌液中加入含1％對氨基苯甲酸約1～5ml（以前講加入0.5ml）。本法用于含磺胺較少制劑，如：三黃軟膏、消炎眼藥水、斑馬眼藥水等。應用本法可因供試品不一樣，對氨基苯甲酸用量可適當調(diào)整。含砷、汞等重金屬藥品中和法，取要求量供試品，加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100ml中，作增菌培養(yǎng)。第27頁本法適合用于含重金屬鹽類藥品檢驗，如磺胺嘧啶銀軟膏等。含洗必泰等防腐劑供試品中和法，取要求量供試品，加入含適量聚山梨酯－80等表面活性劑100ml增菌液中（表面活性劑用量應預試，用量過大有抑菌作用）。本法適合用于洗必泰含片、洗必泰栓、霉滴栓劑及其它含抑菌成份供試品。應用本法需注意，因為供試品不一樣，表面活性劑用量應預試，用量不宜過大，不然本身易產(chǎn)生抑菌作用。⑤沉降法：（藥典上沒收載此法）取要求量供試液，自然沉降5分鐘，取上層液于100ml增菌液中，作增菌培養(yǎng)。本法用于單一成份固體制劑如磺胺嘧啶片。取要求量供試液，自然沉降5分鐘，吸收上層液于（含1％對氨基苯甲酸1ml）100ml增菌液中，作增菌培養(yǎng)。本法適合用于復方磺胺制劑，如復方磺胺嘧啶片、復方新諾明片等第28頁以上兩法適合用于難溶于水抗菌制劑。如磺胺類藥應用沉降法時，供試品應充分研細，并與稀釋劑充分搖勻，使污染菌分散于液相中；沉降時間不宜超出5分鐘，以防菌細胞下沉；取上清液時，防止吸入藥渣。（四）對照用陽性菌液控制菌檢驗均應作對應已知菌陽性對照試驗。對照菌株為大腸桿菌［CMCC(B)44102］、沙門菌CMCC(B)50094］、銅綠假單胞菌、［CMCC(B)10104］及金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]制備：取對應菌株營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)18～20小時后，稀釋至1：106。對照菌加入量為50～100個。CMCC――醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心。國內(nèi)藥品微生物檢驗所用菌種主要是CMCC(B)、CMCC(F)菌號，B(bacteria)代表細菌，F(xiàn)(fungi)代表真菌。中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心提供這些干燥菌種。第29頁（五）平皿菌落計數(shù)法取均勻供試液，深入稀釋成1：1021：103等適宜稀釋級。分別取連續(xù)三級10倍稀釋供試品液各1ml，置直徑約9mm平皿中，再注入約45℃培養(yǎng)基約15ml，混勻，待凝固后，倒置培養(yǎng)，每稀釋級應作2～3個平皿。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細菌計數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌計數(shù)。在特殊情況下，前者同時點記霉菌、酵母菌菌落數(shù)，后者同時點記細菌菌落數(shù)。酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計數(shù)。含蜂蜜、王漿制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基與酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分別測定霉菌、酵母菌菌落數(shù)，合并計數(shù)。含糖液體及半固體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基同時點計霉菌菌落數(shù)及酵母菌菌落數(shù)。（六）菌數(shù)測定陰性對照試驗取供試驗用稀釋劑各1ml，置4個無菌平皿中，分別按細菌、霉菌計數(shù)用培養(yǎng)基制備平板，培養(yǎng)，檢驗，不得長菌。（七）檢驗程序第30頁細菌、霉菌（酵母菌）檢驗程序

第31頁第32頁第33頁第34頁

（八）供試液稀釋（10倍遞增稀釋法）

取2～3支滅菌試管，分別加入9ml滅菌稀釋劑。另取1支1ml滅菌吸管吸收1：10均勻供試液1ml，加入裝有9ml滅菌稀釋劑試管中混勻，即得1：100供試液。依這類推，依據(jù)供試品污染程度，可稀釋至1：103、1：104等適宜稀釋級（最少共三級）。普通取1：101：1021：103三級稀釋液檢驗。每遞增一個稀釋級，必須另換一支吸管。在作10倍遞增稀釋時，吸管插入第1級稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm，重復吸吹約10次。吸液時，應先吸至高于吸管上部刻度少許，然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度，再沿第2支稀釋管內(nèi)壁靠近液面（勿接觸液面）遲緩地吹出全部供試液（吸管內(nèi)應無粘附或殘留液體），然后將吸管放入消毒液缸內(nèi)。第35頁（九）注平皿在進行10倍遞增稀釋同時，以該稀釋級吸管，吸收各級稀釋液各1ml至每個平皿中，每一稀釋劑注2～3個平皿。（此時，普通為左手執(zhí)平皿，將蓋半開，右手執(zhí)吸管），注平皿時，將1ml供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無殘留液體，預防反流到吸管尖端部。同時做陰性對照（待各級稀釋液注皿完成后，用一支1ml吸管吸收稀釋劑各1ml，分別注入4個平皿中。其中兩個作細菌陰性對照；另2個作霉菌、酵母菌陰性對照，如另用YPD瓊脂測定酵母菌數(shù)時，再增加2個平皿作酵母菌數(shù)陰性對照）。（十）傾注培養(yǎng)基將預先配制好培養(yǎng)基（細菌計數(shù)用營養(yǎng)瓊脂，霉菌、酵母菌計數(shù)普通用玫瑰紅鈉瓊脂，含蜂蜜、王漿液體制劑另加用YPD瓊脂）溶化，冷至約45℃時，第36頁傾注上述各個平皿約15ml，以順時針或反時針方向快速旋轉(zhuǎn)平皿，使試液與培養(yǎng)基混勻，（注意，混勻時切勿將培養(yǎng)基濺到平皿邊及皿蓋上），置操作臺上待凝。（十一）培養(yǎng)細菌計數(shù)平板倒置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，霉菌、酵母菌計數(shù)平板于25～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。（十二）菌落計數(shù)1．細菌培養(yǎng)時間為48小時，分別在二十四小時及48小時點記菌落數(shù)，普通以48小時菌落數(shù)為準，霉菌、酵母菌培養(yǎng)時間為72小時，分別在48小時及72小時點記菌落數(shù)，普通以72小時菌落數(shù)為準。菌落如蔓延生長成片，此平板不宜計數(shù)。點計后，計算各稀釋級平均菌落數(shù)，按菌數(shù)匯報規(guī)則匯報菌數(shù)。第37頁2．普通將平皿置菌落計數(shù)器或從平皿后面直接以肉眼點計，以透射光襯以暗色背景，仔細觀察。勿漏計細小瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長菌落。注意細菌菌落與霉菌菌落和酵母菌菌落以及它們與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡等區(qū)分。必要時用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察或挑取可疑物涂片鏡檢。如仍難區(qū)分，可延長培養(yǎng)時間4～7天，細菌菌落常會生長增大而加以區(qū)分。3．供試品如為微生物制劑，應將有效微生物菌落排除，不可點記在細菌、霉菌和酵母菌數(shù)內(nèi)。排除方法須按該制劑微生物品種而定，并須觀察菌落特征及染色形態(tài)。4．供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料，（尤其是1：10級別）培養(yǎng)基注皿后亦可能產(chǎn)生沉淀物，經(jīng)過培養(yǎng)后有時形成數(shù)量很多且難與菌落用肉眼相區(qū)分有形物。為了有利于菌落計數(shù)，可在操作時將適宜稀釋級供試液多增加注皿第38頁（1～2個平皿），注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱（勿結(jié)凍）中，在計數(shù)菌落時作為對照。或用0.001％TTC營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后可將細菌菌落與其它有形物區(qū)分開來。［0.001%TTC肉湯瓊脂培養(yǎng)基（0.001%2、3、5氯化三苯四氮唑瓊脂），在每1000ml營養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌1％TTC溶液1ml混勻后傾注平皿，預防菌落蔓延］。有些軟膏等非水溶性供試品，經(jīng)營養(yǎng)瓊脂注皿后呈乳白色，培養(yǎng)后生長菌落不易識別和點計，為預防這種情況，也可用0.001％TTC營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后生長菌落為紅色，襯以白色背景上易于點計。5．若平板上有2個或2個以上菌落重合，肉眼可區(qū)分時仍以2個菌落或2個以上菌落計數(shù)；若平板生長有鏈狀菌落，菌落間無顯著界限，一條鏈作為一個菌落計，但若鏈上出現(xiàn)性狀與鏈狀菌落不一樣可辨菌落時，仍應分別計數(shù)，若生長蔓延較大片狀菌落或花斑樣菌落，普通不宜作為計數(shù)用。第39頁附表：細菌、霉菌、酵母菌形態(tài)特征比較（營養(yǎng)瓊脂及玫瑰紅鈉瓊脂平板）

第40頁

6．如同一稀釋級2個平板菌落數(shù)超出1倍以上，不應計數(shù)，菌落蔓延成片不應計數(shù)。7．當2個平板菌落數(shù)均在15（含15）以下時，按菌落計數(shù)Poisson分布菌數(shù)95%可信限計。二個平板最大差值分別在0～4，1～7，2～9，3～10，4～12，5～14，6～15，以上各數(shù)分別為菌落平均值1、2、3、4、5、6、7上限及下限，超出以上程度，視為操作誤差，不得作為計數(shù)依據(jù)。每個稀釋級使用3個平板時，平板菌落數(shù)均在10個以下情況。0～3，1～5，2～7，3～9，4～10，5～12，6～13，7～14。8．對有疑議供試品以YPD培養(yǎng)基作酵母菌計數(shù)時，可培養(yǎng)至1周再點計菌落數(shù)。（十三）菌數(shù)匯報規(guī)則1．細菌數(shù)選取平均菌落數(shù)在30～300（國外近年有選取25～250趨向）之間稀釋級，霉菌、酵母菌選取平均菌落數(shù)在30～100之間稀釋級作為匯報菌第41頁數(shù)計算依據(jù)。如只有1個稀釋級平均菌落數(shù)在30～300（30～100）之間，則將該稀釋級菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)匯報。2．如有2個相鄰稀釋級平均菌落數(shù)在30～300（30～100）之間時，則按比值計算。當比值≤2時，則以2個稀釋級均值匯報。當比值＞2時，則以低稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)匯報。比值＝（高稀釋級平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）／（低稀釋級平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）3．如有3個稀釋級平均菌落數(shù)均在30～300（30～100）之間時，則以后2個稀釋級計算級間比值匯報。4．如各稀釋級平均菌落數(shù)均在300（100）以上，則按最高稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)匯報；如各稀釋級平均菌落數(shù)均在30以下，普通則按最低稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)匯報。第42頁5．如各稀釋級平均菌落數(shù)均不在30～300（30～100）之間，則以最靠近30或300（100）稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)匯報。6．如各稀釋劑平板均無菌落生長或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于1時，則匯報菌數(shù)為小于10個／g或ml。如供試品原液平板均未生長霉菌及酵母菌，則匯報未檢出霉菌及酵母菌／ml。7．當各稀釋級平均菌落數(shù)均小于30時，如高稀釋級平均菌落數(shù)大于或等于低稀釋級平均菌落數(shù)時，應以培養(yǎng)基稀釋法重新測定，按測定結(jié)果匯報菌數(shù)。

培養(yǎng)基稀釋法：取低稀釋級供試液（原液或1：10供試液）3份，每份各1ml，分別注入5個或5個以上平皿中（每皿0.2ml或＜0.2ml)，每1個平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)，計數(shù)。5個或5個以上平板點計菌落數(shù)之和，即為每1ml菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)。以3份低稀釋級供試液菌落數(shù)平均值乘以稀釋倍數(shù)匯報。第43頁8．結(jié)果匯報①

菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按實有數(shù)匯報。②

菌落數(shù)大于100時，取兩位有效數(shù)字匯報，第三位按數(shù)值修約規(guī)則處理。③

復試供試品細菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)其中任一項一次檢驗不合格，應重新取2倍包裝量供試品，依法作單項復試兩份，以三次檢驗結(jié)果平均值匯報。第44頁（十四）注意事項1．供試品檢驗全過程必須符合無菌技術要求。使用滅菌用具時，不能接觸可能污染任何器物，滅菌吸管不得用口吹吸。2．從供試品稀釋至傾注瓊脂培養(yǎng)基操作應在1小時內(nèi)完成，防止因為時間過長造成菌細胞繁殖或死亡。3．供試液稀釋及注皿應取均勻供試液，以免造成試驗誤差。4．為防止細菌菌落蔓延生長，宜采取以下方法處理：開蓋干燥換陶瓦蓋加TTC(0.001%)5．在凈化工作臺上操作時，應防止雙手往返出入工作臺；在無菌室操作時，應防止操作者往返出入無菌室。

第45頁細菌、霉菌及酵母菌其它檢驗方法

（一）

細菌計數(shù)其它測定方法細菌計數(shù)除平板菌落計數(shù)法外，還有其它方法，大致上可分兩大類：1．活菌計數(shù)包含試管稀釋法、濾膜法、毛細血管法等前者是液體培養(yǎng)法，后二者是固體培養(yǎng)法。其特點都是檢測含有繁殖能力細菌數(shù)。2．總菌數(shù)計數(shù)法是以細菌（或其它菌類）形態(tài)特征檢測細菌總數(shù)，包含無生殖能力菌細胞在內(nèi)。試管稀釋法（試管法、MPN法）第46頁濾膜法（BP、JP已收載此法）計數(shù)板法（采取血球計數(shù)板或其它計數(shù)板進行細菌計數(shù)）儀器法（應用儀器測定菌數(shù)是當代菌數(shù)檢測技術一個發(fā)展動向。細菌細胞則屬不導電粒子，可被計數(shù)）平板涂布法（二）

霉菌、酵母菌數(shù)測定其它方法1．表面涂抹平板法本法適合用于污染比較嚴重供試品2．濾膜培養(yǎng)法3．酵母菌鏡檢計數(shù)法血球計數(shù)板或其它計數(shù)板進行酵母菌計數(shù)

第47頁大

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法

大腸桿菌即大腸埃希菌(Escherichiacoli)，為腸桿菌科埃希菌屬模式種。埃希菌屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)覺有非脫羧埃希菌等四個種（有資料說五種）。大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內(nèi)棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸桿菌，表明該樣品受到了人和溫血動物糞便污染，即可能污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸桿菌外還有致病性大腸桿菌，可引發(fā)嬰幼兒、成人暴發(fā)性腹瀉。為確保人體健康，口服藥品必須檢驗大腸桿菌。用4－甲基傘形酮葡糖苷酸(4－Methylumbelliferyl－β－D－glucuronide，即MUG)和靛基質(zhì)（Indole）試驗檢驗大腸桿菌是一項新技術，專一性強，試驗證實94％大腸埃希菌MUG陽性，且在大腸埃希菌屬中，除E.coli以外，其它5種第48頁大腸埃希桿菌MUG皆為陰性。其檢驗步驟為：增菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種MUG蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，多數(shù)情況下不需要從混合菌種分離單個菌，如MUG、Indole試驗為陽性或陰性即可匯報結(jié)果，如MUG、Indole試驗不一致時，則需分離培養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢及生化試驗判別。原理：利用目標菌限定酶作用低物水解產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色或熒光反應作為指標系統(tǒng)來判定目標菌。試驗證實96％大腸桿菌含β－葡糖苷酸酶（β－glucuronidase,GUD），約10％沙門菌屬一些菌種也含有此酶。MUG被GUD水解，產(chǎn)生熒光，因為熒光反應敏感度較顏色反應強千萬倍，易于觀察，沒有主觀性，因而用MUG判定大腸桿菌已被廣泛應用于臨床、食品、飲水、污水等檢測。單一MUG判別大腸桿菌其漏檢率達6％，這不符合藥典檢驗方法準確度要求，鑒于98％大腸桿菌靛基質(zhì)試驗為陽性，故將MUG－靛基質(zhì)試驗結(jié)合，用EMB瓊脂平板分離，輔以IMViC試驗，在理論上可使大腸桿菌檢出率達99％。第49頁（一）大腸桿菌檢驗程序（見下頁圖表）供試液制備方法：1．液體供試品2．固體、半固體或粘稠液體供試品3．非水溶性供試品4．含抑菌成份供試品（稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法、沉降法）（二）增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基3份，每份各100ml，2份分別加入要求量供試液，其中1份加入對照菌50～100個作陽性對照，第3份加入與供試液等量稀釋劑作陰性對照。37℃培養(yǎng)18～二十四小時（必要時可延長至48小時）。陰性對照應無菌生長。第50頁搖勻上述膽鹽乳糖增菌液，以滅菌吸管吸收供試品膽鹽乳糖增菌液、供試品陽性對照增菌液、陰性對照培養(yǎng)液各0.2ml，分別加入5mlMUG－蛋白胨培養(yǎng)基管，37℃培養(yǎng)，分別于5小時、二十四小時，取未接種MUG培養(yǎng)基管作本底對照，將各管置365nm紫外燈下觀察。陽性對照管展現(xiàn)熒光，MUG陽性，供試液MUG管展現(xiàn)熒光，MUG陽性；無熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。（三）分離培養(yǎng)如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性時，將上述供試品BL第51頁大

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驗

程

序

圖

示

第52頁

增菌液輕輕搖動，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB或麥康凱瓊脂平板上，培養(yǎng)18～二十四小時。當陰性對照呈陰性，陽性對照平板呈經(jīng)典菌落生長時，如上述供試液培養(yǎng)物分離平板無菌落生長，判未檢出大腸桿菌。假如有菌落生長，應挑選2～3個可疑菌落作靛基質(zhì)試驗（I）、甲基紅試驗（M）、乙酰甲基甲醇生成試驗（V－P）、枸櫞酸鹽利用試驗（C）及革蘭染色，鏡檢。按表中要求判斷結(jié)果：（見下頁）第53頁大腸桿菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)

曙紅亞甲藍瓊脂（EMB）經(jīng)典菌落呈紫黑色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，有金屬光澤。非經(jīng)典菌落呈淺紫色、粉紅色，或菌落中心紫色或無顯著暗色中心，無金屬光澤。麥康凱瓊脂

經(jīng)典菌落呈鮮桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。非經(jīng)典菌落呈微紅色，或菌落中心呈紅色。

第54頁（四）純培養(yǎng)（復壯）如生長菌落與（大腸桿菌菌落形態(tài)特征表）所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個疑似菌落表面中心，沾取培養(yǎng)物，應挑選2～3個以上疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18～二十四小時，作以下檢驗。如平板上無單個可疑菌落，但有可疑菌團（紫黑色，或有金屬光澤），應沾取可疑菌團培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液劃線接種于EMB瓊脂平板，培養(yǎng)18～二十四小時，在挑選單個疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢驗。（五）革蘭染色、鏡檢1．以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，輕輕研開，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再經(jīng)過火焰2～3次（載玻片不燙手為宜）固定。第55頁2．滴加結(jié)晶紫染液，染色1分鐘，水洗3．滴加碘液，媒染1分鐘，水洗，以濾紙吸干余水4．滴加95％乙醇，脫色20～30秒，水洗。或?qū)?5％乙醇滴滿整個涂片，馬上傾去，再用乙醇滴滿涂片脫色10秒，水洗、吸干5．滴加沙黃染液，復染1分鐘，待干后，鏡檢染色結(jié)果：革蘭陽性菌呈藍紫色；革蘭陰性菌呈紅色。大腸桿菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。注意事項：1．玻片必須潔凈，涂片菌量宜少，菌量不可濃，不然，菌細胞成堆或連成片?？床磺鍐蝹€菌體形態(tài)。染色反應難于判斷，菌細胞形態(tài)難于觀察。2．待檢菌菌齡以16～二十四小時為宜。革蘭陽性菌易受菌齡影響，老化細胞易呈陰性。3．脫色是本法關鍵步驟，脫色時間不足菌細胞易染成陽性，脫色時間過長易染成陰性。第56頁（六）生化試驗1．靛基質(zhì)試驗（I）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48小時，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。98％大腸桿菌I試驗為陽性。普通二十四小時即可出現(xiàn)陽性結(jié)果，以無菌操作先從管中取出1ml或2ml培養(yǎng)液進行檢驗，如靛基質(zhì)試驗是陰性，余下蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng)二十四小時，作靛基質(zhì)試驗。2．甲基紅試驗(M)取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時±2小時，于管內(nèi)加入甲基紅指示液2～3滴（約每1ml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕微搖動，馬上觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。第57頁3．乙酰甲基甲醇生成試驗(V－P)取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時±2小時，于每2ml培養(yǎng)液中加入α－萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40％KOH溶液0.4ml，充分振搖，在4小時（通常在30min）內(nèi)出現(xiàn)紅色應判為陽性，無紅色反應為陰性。4．枸櫞酸鹽利用試驗(C)取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，普通培養(yǎng)48～72小時，培養(yǎng)基斜面有菌落生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色時為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變?yōu)殛幮浴＃ㄆ撸┳⒁馐马?．本法（MUG法）無須從混合菌中分離單個菌落。除大腸埃希菌外，還有部分志賀菌屬、沙門菌屬菌株；亦有極少數(shù)革蘭陽性球菌、桿菌和芽孢菌，其MUG為陽性。所以在MUG培養(yǎng)基成份中增加了去氧膽酸鈉，可排除革蘭陽性第58頁菌干擾。至于志賀菌、沙門菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中較難生長，即使有生長，本法能檢出。既然藥品中不得檢出大腸桿菌，更不允許檢出志賀菌、沙門菌。2．配制MUG培養(yǎng)基時，務必校正PH值，滅菌后PH不得過7.4，不然PH值偏高，MUG管本身分解則顯熒光，分裝MUG培養(yǎng)基試管應挑選，試管本身不得顯熒光。3．培養(yǎng)時間供試品培養(yǎng)液接種于MUG培養(yǎng)基中培養(yǎng)時間，普通在5小時、二十四小時觀察是否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能準確判斷時，可延長培養(yǎng)至48小時再觀察結(jié)果。因為大腸埃希菌各菌株間GUD（β－葡萄糖醛酸苷酶）活性不完全相同，對低物和低物濃度反應差異；培養(yǎng)基中選擇因子影響；培養(yǎng)時間、溫度；PH改變；大量競爭菌和樣品本身物質(zhì)成份干擾等，對結(jié)果判斷亦有影響。第59頁4．結(jié)果觀察取供試品MUG試驗管、陽性對照管、陰性對照管同時在365nm紫外燈下觀察，陽性對照管應有較強藍白色熒光，陰性對照管無熒光。供試品MUG管是否有熒光，應仔細觀察比較，或?qū)⒏鞴苷{(diào)換位置（陰性管居中間），適當傾斜試管。如陽性對照管熒光強烈，影響供試品管與陰性對照管觀察時，亦可移去陽性對照管。5．藥品中污染大腸桿菌，亦受生產(chǎn)工藝及藥品影響。在曙紅亞甲藍瓊脂或麥康凱瓊脂平板上菌落形態(tài)特征時有改變，挑取可疑菌落往往憑經(jīng)驗，主觀性較大，務必挑選2～3個以上菌落分別做IMViC試驗判別，挑選菌落越多，檢出陽性菌機率越高，如僅挑選一個菌落做IMViC試驗判別，則易漏檢。第60頁6．在IMViC試驗中，以滅菌接種針沾取菌苔，首先接種于枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，然后接種于蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中。且勿將培養(yǎng)基帶入枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，以免產(chǎn)生假陽性結(jié)果。枸櫞酸鹽利用培養(yǎng)時間，原定為2天，依據(jù)試驗資料，發(fā)覺培養(yǎng)3天后，枸櫞酸鹽利用試驗產(chǎn)生陽性。僅培養(yǎng)2天是不夠，故試驗培養(yǎng)時間改為2～4天（藥典要求48～72小時）。7．陽性對照試驗是檢驗供試品是否有抑菌作用及培養(yǎng)條件是否適宜。陽性對照菌液制備、計數(shù)及加入含供試品培養(yǎng)基中等操作，不能在檢測供試品無菌室或凈化臺上進行，必須在單獨隔離間或凈化臺操作，以免污染供試品及操作環(huán)境。第61頁8．在各類供試品中檢測大腸桿菌及其它控制菌，按一次檢出結(jié)果為準，不再抽樣復驗。檢出大腸桿菌及其它控制菌培養(yǎng)物須保留備查。（普通保留1個月）9．大腸埃希桿菌（E.coli）是大腸埃希桿菌屬中一個細菌，已知大腸埃希菌屬有6種，其中IMViC試驗模式為＋＋――或－＋――。故中國藥典大腸埃希桿菌檢驗法所指IMViC試驗結(jié)果與BP1998E.coli檢驗法比較，判斷檢出或未檢出大腸埃希桿菌，都有其不足。BP1998法中含IMViC試驗為＋＋――菌株但BP1998法中不含IMViC試驗為－＋――菌株第62頁附：經(jīng)典大腸桿菌＋＋――非經(jīng)典大腸桿菌－＋――經(jīng)典中間型大腸桿菌＋＋―＋非經(jīng)典中間型大腸桿菌－＋―＋經(jīng)典產(chǎn)氣腸桿菌――＋＋非經(jīng)典產(chǎn)氣腸桿菌＋―＋＋

第63頁沙門菌檢驗法

（見

頁）

銅綠假單胞菌檢驗法（見

頁）

金黃色葡萄球菌檢驗法（見頁）

破傷風梭菌檢驗法

（見

頁）

第64頁微生物程度檢驗法結(jié)果判斷

（一）細菌菌落數(shù)、霉菌（酵母菌）菌落數(shù)、控制菌三項均符合該品種微生物程度項下要求，應判為供試品符合要求；其中任何一項不符合該品種項下要求，應判供試品不合格。（二）細菌菌落數(shù)、霉菌（酵母菌）菌落數(shù)第一次測定結(jié)果超出該品種項下要求時，應從同一批號樣品中隨機抽樣，復試2次，以3次結(jié)果平均值匯報。（三）眼科用藥霉菌和酵母菌菌落數(shù)復試匯報，須以2次復試結(jié)果均不得長菌，方可判供試品合格。第65頁（四）如營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板生長霉菌（酵母菌）菌落數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上生長細菌菌落數(shù)超出該品種項下微生物程度要求時，經(jīng)復試2次，如3次結(jié)果平均值仍超出要求，應判供試品不合格。（五）各類制劑檢出控制菌或其它致病菌時，按一次檢出結(jié)果為準，不再抽樣復試，即應判該供試品不符合要求。第66頁沙

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序第67頁銅

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菌

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技

術

要

求微生物程度及無菌檢驗試驗室條件應滿足工作任務要求，有完善試驗設施和管理制度。在未普遍采取當代化無菌隔離器技術之前，無菌試驗室仍