《中國(guó)藥典》療法中療法定刺成分的含量

《中國(guó)藥典》療法中療法定刺成分的含量

這種復(fù)雜的多酚類(lèi)化合物，是一種復(fù)雜的水下雙酚類(lèi)化合物。廣泛分布于植物材料，如五倍子、貫草、兒茶等。近年來(lái),對(duì)鞣質(zhì)生理活性的研究方興未艾。研究表明,鞣質(zhì)能清除生物體內(nèi)過(guò)剩的自由基,維護(hù)細(xì)胞膜的流動(dòng)和蛋白質(zhì)的構(gòu)象,防止輻射誘發(fā)的DNA斷裂,從而在抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、心血管病、抗癌、抗突變、抗衰老、抗白內(nèi)障等方面有獨(dú)特功效。鞣質(zhì)的經(jīng)典含量測(cè)定方法有很多種,如重量法、容量法、比色法等。最常用的有皮粉法、高錳酸鉀法、干酪素法、絡(luò)合量法。皮粉法是國(guó)際公認(rèn)的鞣質(zhì)含量測(cè)定方法。皮粉的主要成分是蛋白質(zhì),鞣質(zhì)可通過(guò)分子中的酚羥基與蛋白質(zhì)的酰胺基形成氫鍵而結(jié)合成不溶于水的沉淀,以重量法測(cè)定含量?！吨袊?guó)藥典》一部鞣質(zhì)含量測(cè)定法一直沿用皮粉法,適用范圍廣。缺點(diǎn)是耗用樣品多,測(cè)定時(shí)間長(zhǎng),且沒(méi)有選擇性,測(cè)定結(jié)果偏高,而且皮粉用量很大。近年來(lái),皮粉試劑的供應(yīng)和質(zhì)量都很難保證,使皮粉法的應(yīng)用受到很大限制。《英國(guó)藥典》2002版鞣質(zhì)測(cè)定法附錄采用的是磷鉬鎢酸-皮粉比色法,即利用鞣質(zhì)在堿性溶液中將磷鉬鎢酸還原,產(chǎn)生深藍(lán)色,其吸收度與含量成正比,采用比色法測(cè)定。其中,以焦性沒(méi)食子酸為對(duì)照,測(cè)定總酚和不被皮粉吸附的酚,二者之差計(jì)為鞣質(zhì)的含量。羅文毓等報(bào)道了改進(jìn)的干酪素法,其關(guān)鍵步驟是以干酪素代替皮粉,采用磷鉬鎢酸比色法測(cè)定;藥材樣品提取采用浸泡過(guò)夜代替加熱回流提取等。本文參照《英國(guó)藥典》和干酪素法,重點(diǎn)對(duì)提取方法、顯色劑、干酪素用量等進(jìn)行了比較,提出了鞣質(zhì)含量測(cè)定方法,為藥典相關(guān)附錄方法的修訂提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1試劑與藥品化學(xué)品島津UV-2100,2201紫外分光光度計(jì),Agilent8453紫外分光光度計(jì);鎢酸鈉(分析純,廣東汕頭西隴化工廠)、鉬酸鈉(分析純,北京化學(xué)試劑公司)、硫酸鋰(分析純,天津天河化學(xué)試劑廠)、無(wú)水碳酸鈉(分析純,北京化學(xué)試劑公司);磷酸(北京化學(xué)試劑公司)、鹽酸(北京化學(xué)試劑公司)均為分析純;干酪素(生化試劑,北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠);焦性沒(méi)食子酸(分析純,貴州遵義市建強(qiáng)化工廠);鞣酸(遵義,北京化學(xué)試劑商店分裝);沒(méi)食子酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):0831-9501);五倍子、地榆藥材(均為徐繼民藥師采自吉林通化、河北張家口等地或購(gòu)自中藥材市場(chǎng),并進(jìn)行鑒定)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1種比色液最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果取對(duì)照品、總酚和不被吸附的多酚比色液,在400～1000nm波長(zhǎng)測(cè)定,結(jié)果三種比色液均在760nm具最大吸收。因此,確定測(cè)定波長(zhǎng)為760nm。2.2加熱和冷浸提取兩種方法的比較《英國(guó)藥典》2000版鞣質(zhì)測(cè)定法藥材供試液提取方法采用加熱提取,羅文毓等報(bào)道,鞣質(zhì)遇熱不穩(wěn)定,采用室溫浸提過(guò)夜的方法操作簡(jiǎn)單,提取完全。本試驗(yàn)對(duì)加熱和冷浸提取兩種方法進(jìn)行了比較,結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明,冷浸過(guò)夜提取測(cè)定含量高于加熱提取法,且操作較簡(jiǎn)單。因此,附錄正文采用室溫浸提過(guò)夜的提取方法。2.3皮粉法和干酪素法《英國(guó)藥典》法采用皮粉作為吸附劑測(cè)定不被吸附的多酚類(lèi)。參考文獻(xiàn)干酪素對(duì)鞣質(zhì)的吸附更具專(zhuān)屬性,即可選擇性吸附有生理活性鞣質(zhì),而鞣酐等非活性鞣質(zhì)則不被吸附,選擇性較皮粉法高。以鞣酸為例,試驗(yàn)分別采用皮粉和干酪素為吸附劑,測(cè)定含量。結(jié)果皮粉法測(cè)定值為81.18%,干酪素法測(cè)定值為62.26%。2.4干結(jié)構(gòu)測(cè)定樣品的制備試驗(yàn)考察了干酪素的用量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明,對(duì)于測(cè)定樣品,三倍取樣量的干酪素用量基本可吸附完全。試驗(yàn)使用干酪素0.6克。2.5照照劑的確定《英國(guó)藥典》2000版鞣質(zhì)測(cè)定法附錄采用焦性沒(méi)食子酸為對(duì)照品,試驗(yàn)表明焦性沒(méi)食子酸很不穩(wěn)定,溶液在室溫放置很快變色,必須新鮮配置使用?？紤]到?jīng)]食子酸具有相似的結(jié)構(gòu)和顯色行為,且已有含量測(cè)定用對(duì)照品,可以作為鞣質(zhì)含量測(cè)定對(duì)照物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)比較了焦性沒(méi)食子酸和沒(méi)食子酸分別作為對(duì)照的測(cè)定情況。以鞣酸含量測(cè)定為例,采用不同對(duì)照物比較測(cè)定結(jié)果:以沒(méi)食子酸對(duì)照,測(cè)得含量平均值為62.26%,以焦性沒(méi)食子酸對(duì)照,測(cè)得含量平均值為45.45%。以沒(méi)食子酸對(duì)照,含量值較高。3方法學(xué)的檢驗(yàn)3.1線性關(guān)系研究本法為標(biāo)準(zhǔn)曲線法,每次測(cè)定均隨行測(cè)定,現(xiàn)舉3次測(cè)定數(shù)據(jù),表示線性關(guān)系情況,見(jiàn)表3。3.2重復(fù)試驗(yàn)取樣品6份,按正文方法測(cè)定,測(cè)得含量結(jié)果見(jiàn)表4。3.3加樣回收率測(cè)定取同一樣品4份,分別精密稱(chēng)取約75mg,置250ml量瓶中,分別精密加入鞣酸溶液(以沒(méi)食子酸計(jì)含量為62.26%)50ml,加水100ml,按供試品溶液制備方法制備,并按總酚和不被吸附的多酚測(cè)定法分別測(cè)定含量,計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表5。4樣品測(cè)定4.1對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品50mg,置100ml棕色量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,精密量取5ml,置50ml棕色量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液。4.2磷鰲銻酸溶液的稀釋精密量取對(duì)照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml,分別置25ml棕色量瓶中,各加入磷鉬鎢酸試液1ml,再分別加水11ml、10ml、9ml、8ml、7ml,用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度,搖勻。以相應(yīng)的試劑為空白,照分光光度法(附錄ⅤB),30分鐘后,在760nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度,以吸收度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.3供試品溶液的制備取五倍子、地榆藥材,粉碎,過(guò)三號(hào)篩,分別稱(chēng)取0.15g和0.75g,精密稱(chēng)定,置250ml棕色量瓶中,加水150ml,放置過(guò)夜,超聲處理10分鐘,放冷,用水稀釋至刻度,搖勻,靜置(使固體物沉淀),濾過(guò),棄去50ml初濾液,精密量取續(xù)濾液20ml,置100ml棕色量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。4.4加樣中沒(méi)食子酸的量總酚測(cè)定精密量取供試品溶液2ml,置25ml棕色量瓶中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法,自“加入磷鉬鎢酸試液1ml”起,加水10ml,同法測(cè)定吸收值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒(méi)食子酸的量(mg),計(jì)算,即得。不被吸附的多酚測(cè)定取供試品溶液25ml,加至已盛有0.6g干酪素的100ml具塞錐形瓶中,密塞,置30℃水浴中保溫1小時(shí),時(shí)時(shí)振搖,取出,放冷,搖勻,濾過(guò),棄去初濾液,精密量取續(xù)濾液2ml,置25ml棕色量瓶中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法,自“加入磷鉬鎢酸試液1ml”起,加水10ml,同法測(cè)定吸收值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒(méi)食子酸的量(mg),計(jì)算,即得。鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸附的多酚量樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6:5測(cè)定條件的改進(jìn)5.1本法主要參考了《英國(guó)藥典》鞣質(zhì)測(cè)定法附錄方法。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn),主要在以下四個(gè)方面進(jìn)行了改進(jìn):(1)《英國(guó)藥典》法采用單點(diǎn)對(duì)照計(jì)算方法。比色法含量測(cè)定受到的影響因素較多,實(shí)驗(yàn)表明線性曲線有明顯的截距值。在同樣測(cè)定條件下,單點(diǎn)對(duì)照計(jì)算結(jié)果偏高,標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性較好。因此,本法改為采用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法。(2)《英國(guó)藥典》法采用焦性沒(méi)食子酸為對(duì)照品,計(jì)算含量。鑒于焦性沒(méi)食子酸不穩(wěn)定的性質(zhì),本法改用沒(méi)食子酸作為對(duì)照物。(3)實(shí)驗(yàn)比較了皮粉和干酪素吸附的測(cè)定結(jié)果,皮粉吸附的測(cè)定值明顯高于干酪素吸附,表明干酪素的吸附作用更具專(zhuān)屬性。(4)《英國(guó)藥典》法皮粉吸附步驟是在樣品濃溶液階段,10ml溶液加0.2克皮粉吸附后,濾過(guò)液量很少,再精密吸取2ml稀釋,操作難度較大,且總酚測(cè)定和不被吸附的多酚測(cè)定需兩次精密稀釋操作。本法改為取樣品提取液25ml,定容至100ml制成稀釋液,取25ml進(jìn)行干酪素吸附步驟,濾過(guò)后,溶液直接用于測(cè)定。不僅減少了精密稀釋步驟,吸附液的量也足夠進(jìn)行移液管的清洗等使用。5.2《中國(guó)藥典》鞣質(zhì)含量測(cè)定法一直沿用皮粉法,該法