o-glccnac糖基化的功能研究進(jìn)展

o-glccnac糖基化的功能研究進(jìn)展

糖基化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯形式（ptms）。它在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，并發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。所謂蛋白質(zhì)的糖基化就是低聚糖以糖苷的形式與蛋白質(zhì)上特定的氨基酸殘基共價結(jié)合的過程。糖基化能使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,功能更為完善,調(diào)節(jié)更為精細(xì),作用更為專一。糖基化參與了一系列重要的生物學(xué)過程,如基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫保護(hù)、病毒復(fù)制、細(xì)胞生長與分化、細(xì)胞間的黏附、蛋白質(zhì)降解以及炎癥的產(chǎn)生等。許多具有重要生物學(xué)功能的蛋白質(zhì),如細(xì)胞骨架蛋白、核孔蛋白、染色質(zhì)相關(guān)蛋白、RNA聚合酶Ⅱ、轉(zhuǎn)錄因子、原癌基因、腫瘤抑制因子、激素受體、磷酸酶以及激酶等均有糖基化的形式在體內(nèi)存在。蛋白質(zhì)糖基化可以按照氨基酸和糖連接的方式主要劃分為四類:O-糖基化、N-糖基化、C-甘露糖化以及GPI(glycophosphatidlyinositol,GPI)錨定連接。其中O-糖基化、N-糖基化連接是最為廣泛的兩類糖基化。本文所要涉及的一類特殊的O-糖基化修飾即O-GlcNAc糖基化,于1984年由美國約翰霍普金斯大學(xué)的G.W.Hart等最先發(fā)現(xiàn),由于該種糖基化形式的獨(dú)特性及功能上的重要性,從發(fā)現(xiàn)至今,一直是一個重要的研究熱點(diǎn),尤其是在近幾年,相關(guān)機(jī)制和功能研究的報道層出不窮。O-GlcNAc糖基化以類似于磷酸化的修飾機(jī)制參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、細(xì)胞應(yīng)答以及蛋白質(zhì)降解等一系列復(fù)雜的細(xì)胞活動。O-GlcNAc糖基化的異常與一些嚴(yán)重威脅人類健康的復(fù)雜疾病,如癌癥、糖尿病以及神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。雖然O-GlcNAc糖基化在功能上極其重要,但相關(guān)的機(jī)制研究仍亟待提高。O-GlcNAc糖基化與磷酸化的修飾位點(diǎn)及修飾形式非常類似,而且在體內(nèi)也有眾多的蛋白質(zhì)可被O-GlcNAc糖基化修飾。在人體內(nèi)有由518種負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的磷酸化的蛋白質(zhì)激酶和大約200種負(fù)責(zé)去磷酸化的磷酸酶所組成的龐大的系統(tǒng)來負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的磷酸化。與之類比的是只有一種糖基化轉(zhuǎn)移酶N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(β-N-acetylglucosaminyltransferase,OGT)來負(fù)責(zé)O-GlcNAc糖基化及一種糖苷酶N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-D-N-acetylglucosaminidase,OGA)來負(fù)責(zé)去糖基化。這里面的一個關(guān)鍵問題是單一的OGT和OGA是如何識別成千上萬的底物蛋白,以實現(xiàn)修飾和去修飾并對這些蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)的。雖然相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)這可能與OGT和OGA自身的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān),但是具體的分子機(jī)制仍不明了。對O-GlcNAc糖基化系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制的研究將有助于加深我們對與之相關(guān)的重要疾病,如癌癥、糖尿病及神經(jīng)退行性疾病等頑疾的發(fā)病機(jī)制、演化過程的理解,從而為有針對性的治療提供線索。1o-glcnac糖基化的可逆修飾1984年,Torres和Hart首次在小鼠淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了N-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)修飾的核質(zhì)蛋白,由于這種糖基化與其他糖基化類型相比的特殊性及在生物學(xué)功能上的重要性,從發(fā)現(xiàn)至今,一直是一個重要的研究熱點(diǎn),尤其是在近幾年,相關(guān)機(jī)制和功能研究的報道層出不窮。O-GlcNAc糖基化(圖1)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白上廣泛存在,主要修飾位點(diǎn)是靶蛋白的絲氨酸和蘇氨酸殘基。這種糖基化修飾也已被證實存在于一些細(xì)菌、原生動物、絲狀真菌和多細(xì)胞生物中。O-GlcNAc糖基化與傳統(tǒng)糖基化的區(qū)別主要表現(xiàn)在:(1)與位于細(xì)胞表面及胞腔的糖鏈相比,這種糖基化幾乎只特異性地存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白中;(2)O-GlcNAc糖基化修飾的結(jié)構(gòu)簡單,是一個單一的己糖分子,一般不會形成復(fù)雜的復(fù)合糖結(jié)構(gòu);(3)與磷酸化作用相似,是一種可誘導(dǎo)的、可逆的、動態(tài)的翻譯后修飾,可以作為對環(huán)境刺激的一種應(yīng)答反應(yīng),通過瞬時的糖基化與去糖基化調(diào)節(jié)復(fù)雜的細(xì)胞活動;但是與磷酸化有眾多激酶與磷酸酶共同參與不同,O-GlcNAc糖基化的可逆修飾僅由OGT糖基化和OGA去糖基化兩種酶的催化來實現(xiàn)。在動物中(還包括某些植物),OGT和OGA的編碼序列高度保守,尤其是編碼催化中心和與蛋白質(zhì)相互作用的位點(diǎn)。目前推測OGT和OGA對底物的特異性識別是通過它們與一些輔助蛋白的相互作用形成具有底物特異性的全酶來實現(xiàn)的。同時,OGT對底物UDP-GlcNAc的濃度高度敏感,而糖基化的糖基供體UDP-GlcNAc來自糖代謝的氨基己糖合成途徑(hexosaminebiosyntheticpathway,HBP)(圖1),所以,體內(nèi)葡萄糖的的濃度會嚴(yán)重影響到蛋白質(zhì)的糖基化水平,這或許就是O-GlcNAc與糖尿病相關(guān)的根本原因所在。人體中發(fā)現(xiàn)的OGT主要有三種同工酶:相對分子質(zhì)量分別為110×103(p110,ncOGT)、78×103(p78,sOGT)和103×103(p103,mOGT),這三種同工酶的主要區(qū)別在于N端的三角四肽結(jié)構(gòu)(tetratricopeptiderepeats,TPRs)的重復(fù)數(shù)不同(圖2),C端為相同的活性區(qū)域。p110催化亞基可以根據(jù)細(xì)胞的類型形成同源二聚體或與p78形成異源三聚體結(jié)構(gòu),而p103主要位于線粒體中,但是并未發(fā)現(xiàn)它催化線粒體蛋白的糖基化,因此,推測可能具有其他未知的生物學(xué)功能。OGT亞基由相互獨(dú)立的兩部分組成,N端包括TPRs,主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用,C端則是活性部位,在相應(yīng)的蛋白質(zhì)需要糖基化時,它可能與輔助因子瞬時作用形成特異性的全酶,通過催化靶蛋白的糖基化來實現(xiàn)該蛋白的特定生物學(xué)功能。Sakaidani等還在果蠅中發(fā)現(xiàn)了一種全新的OGT,被命名為EOGT;在小鼠中也發(fā)現(xiàn)了與其同源的基因。與前三種OGT不同,它位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi),主要修飾的是一些表皮生長因子,通過影響細(xì)胞的分泌蛋白及細(xì)胞膜表面糖蛋白來介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間的相互作用。2關(guān)于o-glcnac糖基化與地位的關(guān)系O-GlcNAc糖基化廣泛存在于各種細(xì)胞中,對于細(xì)胞活動的正常進(jìn)行具有非常重要的作用。O-GlcNAc糖基化參與了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、配受體相互作用、病毒感染、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、細(xì)胞應(yīng)答以及蛋白質(zhì)翻譯與降解等。而這些作用的實現(xiàn)主要是通過與其他一些蛋白質(zhì)翻譯后修飾相互作用來進(jìn)行。在與O-GlcNAc糖基化相互影響的多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式中,磷酸化與O-GlcNAc糖基化的互調(diào)研究得最為透徹。這兩者之間的互調(diào),目前有四種公認(rèn)的形式(圖3),即分別為在同一個位點(diǎn)的競爭性修飾、不同位點(diǎn)的交替性修飾、鄰近區(qū)域內(nèi)的不同位點(diǎn)的各自修飾和位點(diǎn)依賴性的交替修飾或同時修飾,由此可見,兩者之間競爭與依賴并存。由于O-GlcNAc糖基化是一種可誘導(dǎo)的、可逆的、動態(tài)的翻譯后修飾,這種作用方式與磷酸化修飾極為相似,并且它們都有相同的修飾位點(diǎn)——靶蛋白的絲氨酸、蘇氨酸羥基,兩種修飾相互依賴相互影響形成了一種動態(tài)的平衡,協(xié)同完成多種復(fù)雜的生命活動,在這種平衡被打破時,機(jī)體就可能會產(chǎn)生一些相關(guān)的疾病,如2型糖尿病的發(fā)生就是由于一些胰島素信號通路中的蛋白被過度的O-GlcNAc糖基化,而相應(yīng)地降低了磷酸化的水平,最終導(dǎo)致糖異生途徑的增加,糖原合成減少,導(dǎo)致葡萄糖耐受。而在一些神經(jīng)退行性疾病中卻是由于大腦中一些蛋白的O-GlcNAc糖基化水平降低,磷酸化水平升高,導(dǎo)致一些蛋白在大腦中過度累積并形成一些纖維纏結(jié)而致病,可見這兩種修飾之間輕微的改變都會造成嚴(yán)重的疾病,而且Fujiki等研究發(fā)現(xiàn),O-GlcNAc糖基化還與泛素化、乙?；纫泊嬖谥欢ǖ年P(guān)聯(lián),如組蛋白H2BS112的糖基化能夠促進(jìn)H2BK120的單泛素化,從而影響下游基因的表達(dá)。此外,TET2/3(teneleventranslocationenzymes,TET)催化5-甲基胞嘧啶的羥基化,在表觀遺傳學(xué)的研究中具有舉足輕重的作用。2012年,Chen等研究發(fā)現(xiàn),TET2/3與ncOGT之間存在著明顯的相互作用,并且TET2通過與ncOGT相互作用來影響組蛋白H2BS112的糖基化,進(jìn)而影響下游基因的表達(dá)。一些重要的蛋白因子,如重組因子Oct4及Sox2是已知的誘導(dǎo)細(xì)胞的多能性所必需的,相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn),在胚胎干細(xì)胞中Oct4和Sox2也是被O-GlcNAc糖基化的,而O-GlcNAc糖基化在這兩種關(guān)鍵蛋白上的缺失會降低干細(xì)胞自我更新的能力及阻礙體細(xì)胞的重編程。3o-glcnac糖基化作用O-GlcNAc糖基化的底物之一UDP-GlcNAc是氨基己糖生物合成途徑(HBP)的終產(chǎn)物。而HBP途徑的的合成情況與UDP-GlcNAc的利用效率受到葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等不同營養(yǎng)物質(zhì)的直接影響。在這些相互的影響中,通過UDP-GlcNAc的生物合成途徑將細(xì)胞中三大營養(yǎng)物質(zhì)聯(lián)系起來。OGT負(fù)責(zé)將單個的葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到靶蛋白的絲氨酸蘇氨酸殘基上,與絲氨酸蘇氨酸的磷酸化作用相似,絲氨酸蘇氨酸的糖基化修飾也參與大量的細(xì)胞過程。Slawson等研究表明,O-GlcNAc糖基化的異常與癌癥及2型糖尿病等的發(fā)生密切相關(guān)。雖然相關(guān)機(jī)制還有待闡明,但已發(fā)現(xiàn)這些疾病的產(chǎn)生均與細(xì)胞能量代謝的異常有關(guān),而O-GlcNAc糖基化與細(xì)胞中ATP的濃度密切相關(guān)。3.1磷酸化的oft-glcnac活性2型糖尿病是一種代謝缺陷性疾病,主要表現(xiàn)為血液中葡萄糖濃度持續(xù)升高和對胰島素的不敏感。在正常狀態(tài)下,OGT位于細(xì)胞核中。當(dāng)葡萄糖濃度升高時,胰島素分子會結(jié)合到胰島素受體上導(dǎo)致其上的酪氨酸殘基磷酸化,胰島素受體的磷酸化激活使下游位于細(xì)胞膜上的PDK1(PIP3-dependentkinase,PDK1)和AKT(proteinkinaseB,AKT)依次被磷酸化激活,從而使大量的調(diào)節(jié)蛋白磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)糖原的合成并降低糖異生過程,使體內(nèi)的葡萄糖濃度盡快恢復(fù)正常。而在2型糖尿病患者體內(nèi),由于對胰島素的不敏感,隨著葡萄糖濃度的持續(xù)升高,部分OGT從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上,PIP3(phosphatidylinositol3,4,5trisphosphate,PIP3)與OGT結(jié)合,隨后OGT的酪氨酸被磷酸化,磷酸化的OGT活性增強(qiáng),可使許多重要的信號分子,如PDK1、AKT和FOXO(forkheadtranscriptionfactors,FOXO)糖基化,PDK1、AKT和FOXO的糖基化影響了這些蛋白質(zhì)自身及下游蛋白質(zhì)的磷酸化,從而產(chǎn)生相反的效應(yīng),即不但沒有增加糖原的合成,反而使得糖異生明顯增強(qiáng),最終導(dǎo)致血液中葡萄糖濃度持續(xù)升高,并在持續(xù)的高糖條件下,氨基己糖途徑增強(qiáng),產(chǎn)物UDP-GlcNAc濃度升高,而OGT對UDP-GlcNAc的濃度也高度敏感,導(dǎo)致蛋白的O-GlcNAc糖基化水平升高,從而也使細(xì)胞表現(xiàn)出胰島素拮抗。因此,胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的異常O-GlcNAc糖基化影響了它們的正常磷酸化可能是導(dǎo)致2型糖尿病的重要原因。3.2o-glcnac糖基化與肺癌癌細(xì)胞為了維持快速生長和分化,其胞內(nèi)的代謝異?；钴S。癌細(xì)胞為了獲得大量中間代謝產(chǎn)物以支撐細(xì)胞的快速生長,其有氧糖酵解,即Warburgeffect,較之普通細(xì)胞高出許多倍。為了保證正常的物質(zhì)和能量代謝,細(xì)胞必然會動員所有的途徑來提高細(xì)胞葡萄糖濃度。隨著葡萄糖濃度的提高,進(jìn)入HBP途徑的葡萄糖量必然會增加,此外,在HBP途徑的的各個中間環(huán)節(jié),也會有大量的中間代謝產(chǎn)物進(jìn)入,最后都導(dǎo)致UDP-GlcNAc的合成量增加,從而導(dǎo)致細(xì)胞中大量的底物蛋白的O-GlcNAc糖基化水平發(fā)生變化,進(jìn)而影響一些細(xì)胞功能的正常進(jìn)行。目前認(rèn)為O-GlcNAc糖基化與癌癥的關(guān)系主要表現(xiàn)在對原癌基因及抑癌基因所編碼蛋白質(zhì)的修飾上,如所熟知的c-Myc、p53等。c-Myc是一個促進(jìn)細(xì)胞增殖,調(diào)節(jié)糖酵解、脂質(zhì)代謝等有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子,它也調(diào)節(jié)谷氨酸鹽代謝、線粒體的生物合成、細(xì)胞周期、HBP途徑等。c-Myc第58位的蘇氨酸可以被O-GlcNAc糖基化,同時也是一個磷酸化位點(diǎn),在Burkett淋巴瘤中,c-Myc58位的蘇氨酸磷酸化導(dǎo)致c-Myc的穩(wěn)定性降低,加速降解,c-Myc靶基因表達(dá)減少。相反,如果將c-Myc58位的蘇氨酸O-GlcNAc糖基化來屏蔽磷酸化,則會明顯增加c-Myc的穩(wěn)定性。同樣的情況也存在于轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ中。在癌細(xì)胞中還有一個最常見的表現(xiàn)是異倍化,異倍化會促進(jìn)腫瘤發(fā)生。對關(guān)鍵有絲分裂節(jié)點(diǎn)控制的缺失會引起低水平的異倍化,完全的控制缺失則會導(dǎo)致嚴(yán)重的異倍化和細(xì)胞死亡。在正常情況下,M期部分OGT位于在紡錘體上,隨后轉(zhuǎn)移到中間體上。如果在有絲分裂過程中雙倍表達(dá)OGT則會破壞分裂的正常進(jìn)行。推測OGT在紡錘體上可能有多種功能:(1)OGT大量地糖基化一些與紡錘體和中間體相關(guān)的蛋白,并調(diào)節(jié)它們的功能;(2)OGT可能通過它的TPR結(jié)構(gòu)域來促進(jìn)蛋白質(zhì)間的相互作用,但目前具體的機(jī)制不明。3.3神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerativedisease,ND)是一類以原發(fā)性神經(jīng)元變性為基礎(chǔ)的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,主要包括阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)、帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)、亨廷頓舞蹈病(Huntingtondisease,HD)、脊髓小腦失調(diào)(spinalcerebellarataxias,SCA)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)等,多發(fā)于老年患者。神經(jīng)元的退行性病變和凋亡是這類疾病的主要病征。O-GlcNAc在大腦中含量豐富,尤其在神經(jīng)纖絲、微管相關(guān)蛋白、網(wǎng)格蛋白以及β淀粉樣前體蛋白等蛋白質(zhì)中含量較高。這些蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的異常與一些神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。目前推測人腦中O-GlcNAc水平的降低可能是導(dǎo)致ND疾病的主要原因。人腦中的Tau蛋白除被磷酸化修飾外,也被O-GlcNAc糖基化修飾,且Tau蛋白的O-GlcNAc修飾可以影響其磷酸化水平。隨著年齡的增長,腦的糖酵解代謝活性逐漸降低,結(jié)果可能導(dǎo)致一些關(guān)鍵的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白質(zhì)的O-GlcNAc修飾水平的降低,如Tau蛋白的O-GlcNAc糖基化修飾水平降低導(dǎo)致其過度磷酸化是AD致病過程中的重要因素。過度磷酸化的Tau蛋白聚集形成雙螺旋細(xì)絲(pairedhelicalfilament,PHF),進(jìn)而形成神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangles,NFTs)。此外,大腦中的β-淀粉樣前體蛋白(amyloid-βprecursorprotein,APP)在17年前已被證明是O-GlcNAc糖基化的,但是對這種修飾卻沒有更為深入的研究。而近年來的研究發(fā)現(xiàn),AD疾病的發(fā)生與腦內(nèi)積累疏水性的β-淀粉樣小肽(Aβ)有關(guān),β-淀粉樣前體蛋白O-GlcNAc糖基化的提高會降低β-淀粉樣小肽的積累,從而使疾病得到有效地緩解,這或許會成為一條可行的AD治療策略,而且神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生除了與這些蛋白的O-GlcNAc異常修飾有關(guān)外,催化O-GlcNAc糖基化的兩個酶OGT和OGA都存在于神經(jīng)元細(xì)胞的突觸小體中,相關(guān)的研究證明,抑制OGA的活性,提高一些前突觸蛋白O-GlcNAc糖基化水平,相應(yīng)地會延長突觸傳遞的長程增強(qiáng)效應(yīng)(longtermpotentiation,LTP)。LTP是一種突觸可塑性的標(biāo)志,與大腦學(xué)習(xí)記憶的功能密切相關(guān),在AD中,LTP受到了損害。在AD患者大腦中,蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的水平下降了約95.5%。因此,提高大腦中蛋白質(zhì)的O-GlcNAc水平,降低一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)的過度磷酸化,或許將成為ND防治研究中的熱點(diǎn)領(lǐng)域。4oft與o-glcnac糖基化的分子如前所述,O-GlcNAc糖基化修飾參與了各種復(fù)雜的細(xì)胞活動,就目前已證明有上千種O-GlcNAc糖基化修飾的底物存在,其中不少蛋白質(zhì)都具有重要的生物學(xué)功能,并且相信在未來的研究中還將有更多的O-GlcNAc糖基化的蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)。我們已知O-GlcNAc糖基化是一種可誘導(dǎo)的、可逆的、動態(tài)的修飾,這種作用方式與磷酸化修飾極為相似,并且它們都有相同的修飾位點(diǎn)——靶蛋白的絲氨酸、蘇氨酸羥基;但是與磷酸化的激酶磷酸酶系統(tǒng)不同,O-GlcNAc糖基化修飾系統(tǒng)只用一對酶來完成糖基化與去糖基化的作用,那么它是怎樣特異性識別成千上萬的底物蛋白質(zhì),以及如何來全局性鑒定某個物種所有的O-GlcNAc糖基化蛋白質(zhì),目前都還沒有成熟的技術(shù)?？梢圆捎玫募夹g(shù)只有質(zhì)譜技術(shù)、凝集素芯片等。已發(fā)現(xiàn)的O-GlcNAc糖基化蛋白質(zhì)中也不乏一些具有重要功能的蛋白質(zhì),如RNA聚合酶II、c-Myc及p53等。為了能夠更好地解釋OGT的底物識別機(jī)制,我們需要系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)OGT相互作用蛋白質(zhì)及O-GlcNAc糖基化的蛋白質(zhì)。在OGT的N端有不同的TPR重復(fù)單位,現(xiàn)有的三類OGT的分類即基于其上TPR的數(shù)目的不同。在解釋OGT如何特異性地識別底物上,目前比較公認(rèn)的一種理論是OGT的TPR結(jié)構(gòu)域會與不同蛋白質(zhì)輔助因子瞬時相互作用,形成具有底物特異性的全酶來特異性地識別它的糖基化底物,所以,對于與OGT相互作用的蛋白因子的尋找或許能夠為我們解開其機(jī)制提供幫助(圖4)。目前已報道的與OGT相互作用的蛋白質(zhì)只有20多種(表1),這與已發(fā)現(xiàn)的上千種底物相比,極其不相稱,制約了對OGT糖基化機(jī)制的研究。我們迫切需要一種系統(tǒng)層次的研究方法來