羊產氣莢膜梭菌的分離鑒定

一株羊源產氣莢膜梭菌的分離及鑒定[=金鐸如2,林家琪1，2,董真1，2,展天松1，2,顧敏1，2,焦庫華1，2,王彥紅*基金項目：江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程；江蘇省大學生創(chuàng)新訓練計劃省級重點項目（201311117039Z）作者簡介：金鐸（1992一），男，山東青島人，揚州大學獸醫(yī)學院本科生，主要從事羊臨床菌株耐藥性及質粒指紋圖譜分析研究。*通訊作者：王彥紅，揚州大學獸醫(yī)學院講師，E-mail:*基金項目：江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程；江蘇省大學生創(chuàng)新訓練計劃省級重點項目（201311117039Z）作者簡介：金鐸（1992一），男，山東青島人，揚州大學獸醫(yī)學院本科生，主要從事羊臨床菌株耐藥性及質粒指紋圖譜分析研究。*通訊作者：王彥紅，揚州大學獸醫(yī)學院講師，E-mail:wyh7405@163.com通訊作者：劉文博，揚州大學獸醫(yī)學院副教授，E-mail:lwb@（1,揚州大學獸醫(yī)學院，揚州，江蘇，225009；2,江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州，江蘇，225009；）摘要：2013年4月，揚州大學動物醫(yī)院畜禽門診接診一例山羊急性死亡的病例，對其進行剖檢，無菌恒溫厭氧分離培養(yǎng)，純化鑒別，革蘭氏染色，生化反應，結果表明為產氣莢膜梭菌，并對此進行了一定的討論關鍵詞：產氣莢膜梭菌；分離；鑒定。產氣莢膜梭菌舊名魏氏梭菌，產氣莢膜桿菌，根據致死性毒素與其抗毒素的中和實驗，將此菌分為A、B、C、D、E5個類型，以菌體抗原進行血清型分類意義不大，菌體抗原與毒素分型之間沒有明顯關系，毒素至少已經發(fā)現15種，其中a、。、￡、1、0、。、K、入、^、u、CPE、其他毒素、神經氨酸酶等。A型、C型、D型的某些菌株可以產生腸毒素，A型產氣莢膜梭菌主要引起動物的氣性壞疽，牛、羔羊、新生羊駝、馴鹿、仔豬、家兔的腸毒血癥，B型菌主要引起羔羊痢疾，還可以引起犢牛、羔羊、山羊的腸毒血癥或壞死性腸炎，C型菌是綿羊猝狙的病原。D型、E型菌也是導致牛羊腸毒血癥和豬的腹瀉［1］。筆者結合相關知識，在此整理于揚州大學動物醫(yī)院所見的一例羊源產氣莢膜梭菌感染的疾病。1材料與方法1.1病料來源2013年4月，江蘇某養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的240多只母山羊陸續(xù)產羔，羔羊在產后24-48小時開始出現劇烈腹瀉，拉水樣黑色稀糞，虛弱，隨后死亡，羔羊的死亡率達60%。剖檢后發(fā)現病死羊羔嚴重脫水，真胃和大腸內容物呈糊狀，小腸壁變薄，或黃或黑，透明，充滿空氣，部分腸道黏膜充血出血，卡他性出血性炎癥，肝臟腫大。臨床疑為產氣莢膜梭菌感染，需進一步進行實驗室檢測。1.2細菌分離取山羊的腸道、肝臟、脾臟、腎臟等病變組織在無菌環(huán)境下接種與血瓊脂平板上，在37°C條件下用燭缸厭氧罐進行厭氧培養(yǎng)24小時。然后在無菌條件下分別挑取血平板上的單個菌落，在血平板和麥康凱瓊脂近進行鑒別培養(yǎng)。取單個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢。1.3生化試驗利用細菌微量生化反應管（購于杭州微生物試劑有限公司，操作方法與判定標準參照該公司操作方法與標準）對所分離的菌株進行生化指標測定，利用牛乳進行暴烈牛乳發(fā)酵實驗。在37C條件下培養(yǎng)24h，然后觀察結果。2結果2.1細菌分離取山羊的病變組織（肺臟）在無菌環(huán)境下接種于血瓊脂平板上，37C條件培養(yǎng)24h后出現表面光滑、半透明、圓屋頂狀的菌落。菌落周圍有溶血環(huán)，出現明顯的雙溶血環(huán)，內環(huán)為完全溶血，外圍為不完全溶血環(huán)。經過純化培養(yǎng)，麥康凱瓊脂板上沒有菌落生長。經過革蘭氏染色鏡檢，結果菌體為直桿狀，兩端鈍圓，單個或成雙的革蘭氏陽性細菌，芽孢大而卵圓。肝臟，腎臟，脾臟與分離結果相同。2.2生化實驗結果分離菌接種在生化反應管后于37C培養(yǎng)24h后，取出觀察，分離細菌能發(fā)酵葡萄糖，麥芽糖，乳糖，蔗糖等，爆裂牛乳發(fā)酵實驗呈現明顯的陽性。其他生化試驗結果見下表（表1）。表1生化實驗結果發(fā)酵反應項目消化酪蛋白水解明膠酯酶卵磷脂酶葡萄糖麥芽糖乳糖蔗糖吲哚實驗甘露醇硫化氫硝酸鹽實驗牛乳實驗分離株+ + - + ++ ++ -- + + +本病例中病死山羊的腸道出現明顯卡他性滲出并伴有出血癥狀，肝臟和腎臟出現壞死灶。分離菌株為直桿狀，兩端鈍圓，單個或成雙的革蘭氏陽性細菌，芽孢大而卵圓。通過生化試驗檢驗，結果表明病原菌與產氣莢膜梭菌的生化反應結果一致，從而證明分離菌是產氣莢膜梭菌。該病例的死亡率較高，對羊群危害較大。近年來，江浙一帶地區(qū)養(yǎng)羊的人越來越多，產氣莢膜梭菌對于草食動物的危害非常嚴重，本病的研究有重要意義。本病的防治重在飼養(yǎng)管理，保持環(huán)境，溫濕度穩(wěn)定。平時要注意搞好環(huán)境衛(wèi)生，及時清理糞便，定期用生石灰、百毒殺等不同消毒劑殺滅環(huán)境中的病原體。不要突然更換飼料，平時可在飼料中添加微量元素硒，增加益生菌以調節(jié)腸道中的正常菌群平衡對減少本病的發(fā)生具有一定的臨床效果3。加強對畜舍環(huán)境和糞便內產氣莢膜梭菌的檢測和監(jiān)控有利于該病的防控，對暴發(fā)過該病的地區(qū)，需要掌握其流行形勢以便于采取合理防治措施⑷。該疾病發(fā)展太快，治療一般是沒有太大效果。接種疫苗是預防本病的一種有效方法，預防羔羊痢疾、猝狙，腸毒血癥等，可用三聯(lián)菌苗和五聯(lián)菌苗進行免疫防治。由于產氣莢膜梭菌病常呈急性散發(fā)，目前尚無有效的治療措施，治療時一般遵循強心補液、解毒、鎮(zhèn)靜、調理腸胃的原則進行對癥治療；給予抗生素等藥物，如青霉素、四環(huán)素等,值得注意的是，磺胺嘧啶和多粘菌素類藥物對產氣莢膜梭菌生長沒有抑制作用，對其他的細菌卻有較強的抑制作用互，應用這兩類藥物治療產氣莢膜梭菌感染往往不會得到理想的結果；采用同型的高免血清治療,對癥加減，也可收到一定的效果。中藥治療法，采用能增加胃腸蠕動、清熱解毒、涼血止痢、阻止瘟疫熱毒進入機體的中藥，如黃苓黃連解毒湯加減，煎水灌服，每天2次，連用3?5d,可收到良好的效果⑹。臨床上，產氣莢膜梭菌常與其他菌混合感染，如巴氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌等等⑺，在診斷和治療的時候應格外注意，不能僅僅針對單一病原采取對癥治療措施而忽略可能的繼發(fā)感染。產氣莢膜梭菌是羊腸道內正常菌，正常情況下數量有限，腸道菌群處于平衡狀態(tài)，其發(fā)病原因主要與氣候變化飼養(yǎng)管理不當或疫苗免疫失敗等有關，如長期陰雨潮濕飼喂精料過多粗纖維含量較少，致使腸道正常菌群失調，產氣莢膜梭菌大量繁殖，產生毒素，使機體發(fā)病產氣莢膜梭菌有不同的血清型［&,確診本病應依靠實驗室診斷血清型鑒定，否則可能導致誤診。參考文獻：［1］ 陸承平.獸醫(yī)微生物學（第四版）［M］.中國農業(yè)出版社，2007：193-195［2］ 張紅英，盧中華，楊霞，王亞賓,金鉞.我國魏氏梭菌病的流行特點［J］.中國畜牧獸醫(yī),2004,1:39-41.［3］ 李長安，王正園，常順蘭.牛魏氏梭菌病概述［J］.畜牧獸醫(yī)雜志,2012,6:48-49+52［4］ 鄭曉麗，竇賢明,胡道俊,肖勇,趙翠榮，倪學勤.湖北襄陽地區(qū)規(guī)?；霎a氣莢膜梭菌的分離和鑒定［J］.湖北農業(yè)科學,2011,23:4893-4895.［5］ 陳天壽.微生物培養(yǎng)基的制造與應用［M］.北京：中國農業(yè)出版社，1995:332.［6］ 鄭