第一章 紫外-可見分光光度法

第一篇光學(xué)儀器分析技術(shù)

根據(jù)物質(zhì)發(fā)射的電磁波或物質(zhì)與電磁波的相互作用建立起來的分析方法統(tǒng)稱為光學(xué)分析法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、選擇性好、用途廣；一般光學(xué)分析方法：折光、旋光、濁度法、圓二色譜法

光譜法：紫外可見、紅外、熒光、原子吸收、核磁共振第一章紫外-可見分光光度法

ultraviolet-visiblespectrophotometry遠(yuǎn)紫外（真空紫外）（10-200nm）*近紫外（200-400nm）*可見光（400-760nm）紫外－可見分光光度法根據(jù)物質(zhì)分子中價(jià)電子對波長為200~760nm的電磁輻射的吸收特性建立起來的定性、定量和結(jié)構(gòu)分析的方法。屬于電子光譜。特點(diǎn)：規(guī)律性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、靈敏度高。10-6~10-4g/ml，部分可達(dá)10-7g/ml應(yīng)用：①定性②定量③推斷結(jié)構(gòu)一紫外-可見分光光度法的基本原理和概念二紫外－可見分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)三應(yīng)用實(shí)例§1.紫外-可見分光光度法的基本原理和概念一、分子吸收光譜電子躍遷類型二、紫外－可見吸收光譜中的常用術(shù)語

三、吸收光譜

四、Lambert-Beer定律五、偏離L-B定律的因素分子吸收光譜的形成過程：運(yùn)動的分子外層電子--------吸收外來輻射------產(chǎn)生電子能級躍遷-----分子吸收光譜。能級組成：除了電子能級(Electronenergylevel)的躍遷外，分子吸收能量將伴隨著分子的振動(Vibration)和轉(zhuǎn)動(Rotation)能級的躍遷！分子的能量變化

E為各種形式能量變化的總和：不同物質(zhì)將選擇性地吸收不同波長或能量的外來輻射，這是UV-Vis定性分析的基礎(chǔ)。定性分析具體做法根據(jù)吸收曲線的特性(峰強(qiáng)度、位置及數(shù)目等)研究分子結(jié)構(gòu)。分子中的價(jià)電子：

電子、電子和n電子軌道：幾率分布成鍵軌道、；反鍵軌道

*、*非鍵軌道n

當(dāng)兩個(gè)原子靠近結(jié)合成分子時(shí)，兩個(gè)原子的原子軌道以線性組合而生成的兩個(gè)分子軌道。紫外-可見吸收光譜就是分子中的價(jià)電子在不同的分子軌道之間躍遷而產(chǎn)生的一、分子吸收光譜的電子躍遷類型各軌道能級高低順序：

n

*

*；H2的成鍵和反鍵軌道在紫外-可見光區(qū)范圍內(nèi)，有機(jī)化合物的吸收光譜主要有

-

*；n-*；-

*；n-*及電荷遷移躍遷產(chǎn)生；

*>n

*>

*>n

*

*躍遷：分子中的成鍵

電子躍遷到

*反鍵軌道上去，這是一切飽和有機(jī)化合物都可能產(chǎn)生的電子躍遷類型。n

*躍遷：分子中未成鍵的n電子激發(fā)到

*軌道上去，所有含有雜原子（O、N、S、P、鹵素等）的飽和烴衍生物都可發(fā)生這種躍遷。含有

*、n

*躍遷的化合物，如：飽和烷烴、鹵代烷烴、醇、醚等是紫外可見吸收光譜測定時(shí)的良好溶劑。電子躍遷類型

*躍遷：可以發(fā)生在任何具有不飽和鍵的有機(jī)化合物分子中，其最大摩爾吸光系數(shù)

max很大。n

*躍遷：發(fā)生在含有雜原子（O、N、S、P、鹵素等）的不飽和化合物中，其最大摩爾吸光系數(shù)

max

比較小。二、常用術(shù)語*生色團(tuán)：分子中可以吸收光子產(chǎn)生電子躍遷的基團(tuán)。含有

鍵的不飽和基團(tuán)*助色團(tuán)：有些基團(tuán)本身沒有生色作用，但卻能增強(qiáng)生色團(tuán)的生色能力，即它們與生色團(tuán)相連時(shí)，會使其吸收帶最大吸收波長發(fā)生紅移，并且增加其強(qiáng)度。通常是帶有非鍵電子對的雜原子的飽和基團(tuán)，如-OH、-NH2、-OR、-SH、-SR、-Cl、-Br、-I等。*紅移和紫移：吸收帶的最大吸收波長發(fā)生移動，向長波方向移動稱為紅移，向短波方向移動稱為紫移。

用不同波長的光依次透過待測物質(zhì)，并測量物質(zhì)對不同波長的光的吸收程度（吸光度A或透光率T），以波長為橫坐標(biāo)，吸收強(qiáng)度參數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，就可以得到該物質(zhì)在測量波長范圍內(nèi)的吸收曲線。這種曲線體現(xiàn)了物質(zhì)對不同波長的光的吸收能力，也稱為吸收光譜。三、吸收光譜只有具備共軛基團(tuán)的物質(zhì)才能在紫外-可見區(qū)產(chǎn)生吸收，但是吸收曲線并不反映非共軛部分的結(jié)構(gòu)。吸收峰：曲線上吸光度最大的地方，它對應(yīng)的波長稱最大吸收波長（

max）吸收谷：峰與峰之間吸光度最小的部位，該處的波長稱最小吸收波長（

min）肩峰：在一個(gè)吸收峰旁邊產(chǎn)生的一個(gè)曲折末端吸收：只在圖譜短波端呈現(xiàn)強(qiáng)吸收而不成峰形的部分吸收曲線的形狀，最大吸收波長

max的位置及吸收強(qiáng)度與分子的結(jié)構(gòu)有關(guān)，可對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。**五、朗伯—比爾定律

光吸收的基本定律和定量測定的依據(jù)。**物理意義:當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí),其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度c及吸收層厚度b成正比.用數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

A=lgI0/I=-lgT=ECl吸光系數(shù)(E)：物理意義：吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí)的A。在一定條件下（單色光、溶劑和溫度等），E是物質(zhì)的特性常數(shù)，表明物質(zhì)對某一波長光的吸收能力。不同物質(zhì)對同一波長的單色光可有不同的E。E越大，表明該物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng)。測定的靈敏度越高。E值及單位與c的單位有關(guān)

當(dāng)l以cm，c：g/L，E稱為吸光系數(shù)，用a表示，即：A=aclc：mol/L，E稱為摩爾吸光系數(shù)，用

表示，它比a更為常用，

的單位為Lmol-1cm-1，即：A=

clc：百分質(zhì)量濃度g/100mL，E稱為比吸光系數(shù)或百分吸光系數(shù)，用E1cm1%表示

=0.1M

E1cm1%例：M（氯霉素）=323.15g/mol，質(zhì)量濃度為

2mg/100ml，l=1cm，T=24.3%，求？

吸光度具有加和性：則A總=Aa+Ab+Ac+…。每個(gè)組分的吸光度由ci和

i決定。吸光度的加和性是計(jì)算分光光度法測定混合組分的依據(jù)。透光率T與吸光度A的關(guān)系

透光率T描述入射光透過溶液的程度T=I/I0

A=lg(I0/I)=lg(1/T)=-lgT

T=10-A=10-ECl

樣品吸光度A與c是成正比，A與c的關(guān)系是通過原點(diǎn)的一直線。但事實(shí)上，A與c并不總是成正比，即偏離L-B定律。這種偏離有化學(xué)方面和光學(xué)方面的因素。*六、偏離L-B定律

負(fù)偏離正偏離CA（一）化學(xué)因素：溶液中溶質(zhì)可因濃度改變而有離解、締合、與溶劑間的相互作用等原因而發(fā)生偏離Beer定律的現(xiàn)象；偏離朗伯－比爾定律的因素

1.非單色光

Beer定律的一個(gè)重要前提是入射光是單色光，但事實(shí)上用單色器分離出來的光是具有一定波長范圍的光。（二）光學(xué)因素

當(dāng)E1

E2時(shí)，則吸光度與濃度是非線性的。二者差別越大，則偏離L-B越大；

當(dāng)E1>E2，測得的吸光度比在“單色光”

1處測得的低，產(chǎn)生負(fù)偏離；反之，當(dāng)E1<E2，則產(chǎn)生正偏離。這種影響的程度還與兩種光的強(qiáng)度比和檢測器對兩種光靈敏度的差異等因素有關(guān)。所以入射光的譜帶寬度將嚴(yán)重影響物質(zhì)的吸光系數(shù)值和吸收光譜形狀。分析譜帶的選擇在所使用的波長范圍內(nèi)，吸光物質(zhì)的吸光系數(shù)變化越大，這種偏離就顯著。所以通常選擇吸光物質(zhì)的最大吸收波長作為分析波長。這樣不僅能夠保證測定有較高的靈敏度，而且此處曲線較為平坦，吸光系數(shù)變化不大，對Beer定律的偏離程度就比較小。2.雜散光

從單色器得到的單色光中與所需波長相隔較遠(yuǎn)的光。3.散射光與反射光使透光強(qiáng)度減弱，吸光度值偏高。4.非平行光使l增大影響測量值由于光源不穩(wěn)定性、讀數(shù)不準(zhǔn)等帶來的誤差。由L-B定律微分后得：微分后除以上式可得：

透射光測量誤差ΔT是測量中的隨機(jī)誤差，來自儀器的噪音：1暗噪音：檢測器與放大電路等各部件不確定性引起。2訊號噪音：亦稱訊號散粒噪音電子躍遷的不相等性測量光強(qiáng)的不確定性

（三）透光率測量誤差T當(dāng)相對誤差

c/c

最小時(shí)，求得T=0.368或A=0.4343。即當(dāng)A=0.4343時(shí)，誤差最?。⊥ǔ？赏ㄟ^調(diào)節(jié)溶液濃度或改變光程l來控制A

的讀數(shù)在0.2~0.7范圍內(nèi)?！?.紫外－可見分光光度計(jì)的

基本結(jié)構(gòu)

一、主要部件二、分光光度計(jì)的類型和光學(xué)性能在UV-vis區(qū)可任意選擇不同波長的光測定吸光度的儀器光源單色器吸收池檢測器顯示和處理功能：提供能量激發(fā)被測物質(zhì)分子，使之產(chǎn)生電子光譜譜帶（提供寬帶輻射）。發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命且發(fā)光面較小的光源。連續(xù)光源： 紫外光區(qū)

氘燈、氫燈（氣體放電光源)） 可見光區(qū) 鎢燈、碘鎢燈（熱輻射光源）一、主要部件1.光源

功能：將光源發(fā)射的復(fù)合光（連續(xù)光譜）按波長順序色散，并從中分離出一定寬度的譜帶。

①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；

②準(zhǔn)光裝置：透鏡或反射鏡使入射光成為平行光束；

③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。

狹縫寬度要適當(dāng)。2.單色器功能：盛放樣品溶液石英（氧化硅）：紫外光區(qū)、可見光區(qū)玻璃池：可見光區(qū)盛空白溶液的吸收池和盛試樣溶液的吸收池也應(yīng)相互匹配，即有相同的厚度和透光性。3.吸收池4.檢測器功能：將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栴愋停海?）光電池：硒光電池（可見） 硅光電池（紫外可見）（2）光電管：

紫（藍(lán)）敏光電管銫陰極

紅敏光電管銀和氧化銫陰極（3）光電倍增管：放大倍數(shù)106～107。（4）光二極管陣列檢測器：顯示方式：T、AC、E5.顯示系統(tǒng)二、紫外－可見分光光度計(jì)的類型

(1)單波長單光束分光光度計(jì)固定波長，分別測量樣品、空白對照的T或A，要求光源和檢測器供電電壓穩(wěn)定性高缺點(diǎn)：受電源波動的影響較大，誤差較大。（2）單波長雙光束分光光度計(jì)

優(yōu)點(diǎn)：消除光源強(qiáng)度不穩(wěn)帶來的影響，操作簡單，自動記錄，快速全波段掃描，不需移動吸收池。仍宜用固定波長測量方式單色光能在很短的時(shí)間內(nèi)交替通過空白和樣品溶液（3）雙波長分光光度計(jì)通過切光器使兩束不同波長的光交替通過吸收池，測得吸光度差

A。試樣溶液濃度與A成正比。優(yōu)點(diǎn)：可測多組份試樣、混濁試樣、而且可作成導(dǎo)數(shù)光譜、不需參比液(消除了由于參比池的不同和制備空白溶液等產(chǎn)生的誤差)、克服了電源不穩(wěn)而產(chǎn)生的誤差，靈敏度高。具有快速掃描的特點(diǎn)（4）光多道二極管陣列檢測分光光度計(jì)可在0.1秒內(nèi)獲得190～820nm范圍的全光光譜。用于追蹤化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)動力學(xué)研究。操作簡單，只需將樣品放入無蓋開放式樣品室，并點(diǎn)擊“開始”即可。MultiSpec-1500型紫外可見光電二極管陣列分光光度計(jì)紫外-可見分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)1、取吸收池時(shí)，手拿毛面。盛裝樣品溶液以池體積的4/5為宜。使用揮發(fā)性溶液時(shí)應(yīng)加蓋。吸收池每次放入的方向要相同。使用后用溶劑或水沖洗干凈，污染不易洗凈時(shí)可用硫酸-發(fā)煙硝酸（3：1）浸泡。2、含有雜原子的有機(jī)溶劑，通過有很強(qiáng)的末端吸收，用作溶劑時(shí)，測定波長均不能小于溶劑的截止波長。3、稀釋時(shí)，所取溶液體積不得少于5ml。含量測定時(shí)，常取3份，平行操作。4、除另有規(guī)定外，供試品溶液的吸光度在0.2-0.7之間為宜。5、狹縫寬度的選擇就以減小狹縫寬度時(shí)供試品的吸光度不再增加為準(zhǔn)?！?.應(yīng)用實(shí)例

吸收光譜比較簡單，特征性不強(qiáng)，并且大多數(shù)簡單官能團(tuán)在近紫外光區(qū)只有微弱吸收或無吸收，所以應(yīng)用有一定局限性。但可用于鑒定共軛生色團(tuán)，以此推斷未知物的結(jié)構(gòu)骨架，在配合其它結(jié)構(gòu)分析方法時(shí)，是有用的輔助方法。一、定性鑒別定性方法對比法 形狀、峰數(shù)、

max位置、強(qiáng)度與相應(yīng)的

同一物質(zhì)圖譜相同，但圖譜相同的不一定是同一物質(zhì)1.測定

max與不同波長處A的比值

2.測定一定波長下的E3.對比不同吸收峰（谷）的A或E的比值可以消除c、l的影響4.對比吸收光譜的一致性P14二、純度檢查雜質(zhì)檢查

化合物無吸收，雜質(zhì)有強(qiáng)吸收，如乙醇中的苯；化合物有吸收，雜質(zhì)可使化合物的吸光系數(shù)增大或減小；雜質(zhì)使吸收光譜變形。依據(jù)：Lambert-Beer定律，A=Ecl波長：max，提高靈