第一章 紫外-可見(jiàn)分光光度法

第一篇光學(xué)儀器分析技術(shù)

根據(jù)物質(zhì)發(fā)射的電磁波或物質(zhì)與電磁波的相互作用建立起來(lái)的分析方法統(tǒng)稱(chēng)為光學(xué)分析法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、選擇性好、用途廣；一般光學(xué)分析方法：折光、旋光、濁度法、圓二色譜法

光譜法：紫外可見(jiàn)、紅外、熒光、原子吸收、核磁共振第一章紫外-可見(jiàn)分光光度法

ultraviolet-visiblespectrophotometry遠(yuǎn)紫外（真空紫外）（10-200nm）*近紫外（200-400nm）*可見(jiàn)光（400-760nm）紫外－可見(jiàn)分光光度法根據(jù)物質(zhì)分子中價(jià)電子對(duì)波長(zhǎng)為200~760nm的電磁輻射的吸收特性建立起來(lái)的定性、定量和結(jié)構(gòu)分析的方法。屬于電子光譜。特點(diǎn)：規(guī)律性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、靈敏度高。10-6~10-4g/ml，部分可達(dá)10-7g/ml應(yīng)用：①定性②定量③推斷結(jié)構(gòu)一紫外-可見(jiàn)分光光度法的基本原理和概念二紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)三應(yīng)用實(shí)例§1.紫外-可見(jiàn)分光光度法的基本原理和概念一、分子吸收光譜電子躍遷類(lèi)型二、紫外－可見(jiàn)吸收光譜中的常用術(shù)語(yǔ)

三、吸收光譜

四、Lambert-Beer定律五、偏離L-B定律的因素分子吸收光譜的形成過(guò)程：運(yùn)動(dòng)的分子外層電子--------吸收外來(lái)輻射------產(chǎn)生電子能級(jí)躍遷-----分子吸收光譜。能級(jí)組成：除了電子能級(jí)(Electronenergylevel)的躍遷外，分子吸收能量將伴隨著分子的振動(dòng)(Vibration)和轉(zhuǎn)動(dòng)(Rotation)能級(jí)的躍遷！分子的能量變化

E為各種形式能量變化的總和：不同物質(zhì)將選擇性地吸收不同波長(zhǎng)或能量的外來(lái)輻射，這是UV-Vis定性分析的基礎(chǔ)。定性分析具體做法根據(jù)吸收曲線的特性(峰強(qiáng)度、位置及數(shù)目等)研究分子結(jié)構(gòu)。分子中的價(jià)電子：

電子、電子和n電子軌道：幾率分布成鍵軌道、；反鍵軌道

*、*非鍵軌道n

當(dāng)兩個(gè)原子靠近結(jié)合成分子時(shí)，兩個(gè)原子的原子軌道以線性組合而生成的兩個(gè)分子軌道。紫外-可見(jiàn)吸收光譜就是分子中的價(jià)電子在不同的分子軌道之間躍遷而產(chǎn)生的一、分子吸收光譜的電子躍遷類(lèi)型各軌道能級(jí)高低順序：

n

*

*；H2的成鍵和反鍵軌道在紫外-可見(jiàn)光區(qū)范圍內(nèi)，有機(jī)化合物的吸收光譜主要有

-

*；n-*；-

*；n-*及電荷遷移躍遷產(chǎn)生；

*>n

*>

*>n

*

*躍遷：分子中的成鍵

電子躍遷到

*反鍵軌道上去，這是一切飽和有機(jī)化合物都可能產(chǎn)生的電子躍遷類(lèi)型。n

*躍遷：分子中未成鍵的n電子激發(fā)到

*軌道上去，所有含有雜原子（O、N、S、P、鹵素等）的飽和烴衍生物都可發(fā)生這種躍遷。含有

*、n

*躍遷的化合物，如：飽和烷烴、鹵代烷烴、醇、醚等是紫外可見(jiàn)吸收光譜測(cè)定時(shí)的良好溶劑。電子躍遷類(lèi)型

*躍遷：可以發(fā)生在任何具有不飽和鍵的有機(jī)化合物分子中，其最大摩爾吸光系數(shù)

max很大。n

*躍遷：發(fā)生在含有雜原子（O、N、S、P、鹵素等）的不飽和化合物中，其最大摩爾吸光系數(shù)

max

比較小。二、常用術(shù)語(yǔ)*生色團(tuán)：分子中可以吸收光子產(chǎn)生電子躍遷的基團(tuán)。含有

鍵的不飽和基團(tuán)*助色團(tuán)：有些基團(tuán)本身沒(méi)有生色作用，但卻能增強(qiáng)生色團(tuán)的生色能力，即它們與生色團(tuán)相連時(shí)，會(huì)使其吸收帶最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移，并且增加其強(qiáng)度。通常是帶有非鍵電子對(duì)的雜原子的飽和基團(tuán)，如-OH、-NH2、-OR、-SH、-SR、-Cl、-Br、-I等。*紅移和紫移：吸收帶的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生移動(dòng)，向長(zhǎng)波方向移動(dòng)稱(chēng)為紅移，向短波方向移動(dòng)稱(chēng)為紫移。

用不同波長(zhǎng)的光依次透過(guò)待測(cè)物質(zhì)，并測(cè)量物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光的吸收程度（吸光度A或透光率T），以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸收強(qiáng)度參數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，就可以得到該物質(zhì)在測(cè)量波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收曲線。這種曲線體現(xiàn)了物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光的吸收能力，也稱(chēng)為吸收光譜。三、吸收光譜只有具備共軛基團(tuán)的物質(zhì)才能在紫外-可見(jiàn)區(qū)產(chǎn)生吸收，但是吸收曲線并不反映非共軛部分的結(jié)構(gòu)。吸收峰：曲線上吸光度最大的地方，它對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱(chēng)最大吸收波長(zhǎng)（

max）吸收谷：峰與峰之間吸光度最小的部位，該處的波長(zhǎng)稱(chēng)最小吸收波長(zhǎng)（

min）肩峰：在一個(gè)吸收峰旁邊產(chǎn)生的一個(gè)曲折末端吸收：只在圖譜短波端呈現(xiàn)強(qiáng)吸收而不成峰形的部分吸收曲線的形狀，最大吸收波長(zhǎng)

max的位置及吸收強(qiáng)度與分子的結(jié)構(gòu)有關(guān)，可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。**五、朗伯—比爾定律

光吸收的基本定律和定量測(cè)定的依據(jù)。**物理意義:當(dāng)一束平行單色光垂直通過(guò)某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí),其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度c及吸收層厚度b成正比.用數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

A=lgI0/I=-lgT=ECl吸光系數(shù)(E)：物理意義：吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí)的A。在一定條件下（單色光、溶劑和溫度等），E是物質(zhì)的特性常數(shù)，表明物質(zhì)對(duì)某一波長(zhǎng)光的吸收能力。不同物質(zhì)對(duì)同一波長(zhǎng)的單色光可有不同的E。E越大，表明該物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng)。測(cè)定的靈敏度越高。E值及單位與c的單位有關(guān)

當(dāng)l以cm，c：g/L，E稱(chēng)為吸光系數(shù)，用a表示，即：A=aclc：mol/L，E稱(chēng)為摩爾吸光系數(shù)，用

表示，它比a更為常用，

的單位為L(zhǎng)mol-1cm-1，即：A=

clc：百分質(zhì)量濃度g/100mL，E稱(chēng)為比吸光系數(shù)或百分吸光系數(shù)，用E1cm1%表示

=0.1M

E1cm1%例：M（氯霉素）=323.15g/mol，質(zhì)量濃度為

2mg/100ml，l=1cm，T=24.3%，求？

吸光度具有加和性：則A總=Aa+Ab+Ac+…。每個(gè)組分的吸光度由ci和

i決定。吸光度的加和性是計(jì)算分光光度法測(cè)定混合組分的依據(jù)。透光率T與吸光度A的關(guān)系

透光率T描述入射光透過(guò)溶液的程度T=I/I0

A=lg(I0/I)=lg(1/T)=-lgT

T=10-A=10-ECl

樣品吸光度A與c是成正比，A與c的關(guān)系是通過(guò)原點(diǎn)的一直線。但事實(shí)上，A與c并不總是成正比，即偏離L-B定律。這種偏離有化學(xué)方面和光學(xué)方面的因素。*六、偏離L-B定律

負(fù)偏離正偏離CA（一）化學(xué)因素：溶液中溶質(zhì)可因濃度改變而有離解、締合、與溶劑間的相互作用等原因而發(fā)生偏離Beer定律的現(xiàn)象；偏離朗伯－比爾定律的因素

1.非單色光

Beer定律的一個(gè)重要前提是入射光是單色光，但事實(shí)上用單色器分離出來(lái)的光是具有一定波長(zhǎng)范圍的光。（二）光學(xué)因素

當(dāng)E1

E2時(shí)，則吸光度與濃度是非線性的。二者差別越大，則偏離L-B越大；

當(dāng)E1>E2，測(cè)得的吸光度比在“單色光”

1處測(cè)得的低，產(chǎn)生負(fù)偏離；反之，當(dāng)E1<E2，則產(chǎn)生正偏離。這種影響的程度還與兩種光的強(qiáng)度比和檢測(cè)器對(duì)兩種光靈敏度的差異等因素有關(guān)。所以入射光的譜帶寬度將嚴(yán)重影響物質(zhì)的吸光系數(shù)值和吸收光譜形狀。分析譜帶的選擇在所使用的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，吸光物質(zhì)的吸光系數(shù)變化越大，這種偏離就顯著。所以通常選擇吸光物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)作為分析波長(zhǎng)。這樣不僅能夠保證測(cè)定有較高的靈敏度，而且此處曲線較為平坦，吸光系數(shù)變化不大，對(duì)Beer定律的偏離程度就比較小。2.雜散光

從單色器得到的單色光中與所需波長(zhǎng)相隔較遠(yuǎn)的光。3.散射光與反射光使透光強(qiáng)度減弱，吸光度值偏高。4.非平行光使l增大影響測(cè)量值由于光源不穩(wěn)定性、讀數(shù)不準(zhǔn)等帶來(lái)的誤差。由L-B定律微分后得：微分后除以上式可得：

透射光測(cè)量誤差ΔT是測(cè)量中的隨機(jī)誤差，來(lái)自?xún)x器的噪音：1暗噪音：檢測(cè)器與放大電路等各部件不確定性引起。2訊號(hào)噪音：亦稱(chēng)訊號(hào)散粒噪音電子躍遷的不相等性測(cè)量光強(qiáng)的不確定性

（三）透光率測(cè)量誤差T當(dāng)相對(duì)誤差

c/c

最小時(shí)，求得T=0.368或A=0.4343。即當(dāng)A=0.4343時(shí)，誤差最??！通?？赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)溶液濃度或改變光程l來(lái)控制A

的讀數(shù)在0.2~0.7范圍內(nèi)?！?.紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)的

基本結(jié)構(gòu)

一、主要部件二、分光光度計(jì)的類(lèi)型和光學(xué)性能在UV-vis區(qū)可任意選擇不同波長(zhǎng)的光測(cè)定吸光度的儀器光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示和處理功能：提供能量激發(fā)被測(cè)物質(zhì)分子，使之產(chǎn)生電子光譜譜帶（提供寬帶輻射）。發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的使用壽命且發(fā)光面較小的光源。連續(xù)光源： 紫外光區(qū)

氘燈、氫燈（氣體放電光源)） 可見(jiàn)光區(qū) 鎢燈、碘鎢燈（熱輻射光源）一、主要部件1.光源

功能：將光源發(fā)射的復(fù)合光（連續(xù)光譜）按波長(zhǎng)順序色散，并從中分離出一定寬度的譜帶。

①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；

②準(zhǔn)光裝置：透鏡或反射鏡使入射光成為平行光束；

③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。

狹縫寬度要適當(dāng)。2.單色器功能：盛放樣品溶液石英（氧化硅）：紫外光區(qū)、可見(jiàn)光區(qū)玻璃池：可見(jiàn)光區(qū)盛空白溶液的吸收池和盛試樣溶液的吸收池也應(yīng)相互匹配，即有相同的厚度和透光性。3.吸收池4.檢測(cè)器功能：將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)類(lèi)型：（1）光電池：硒光電池（可見(jiàn)） 硅光電池（紫外可見(jiàn)）（2）光電管：

紫（藍(lán)）敏光電管銫陰極

紅敏光電管銀和氧化銫陰極（3）光電倍增管：放大倍數(shù)106～107。（4）光二極管陣列檢測(cè)器：顯示方式：T、AC、E5.顯示系統(tǒng)二、紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)的類(lèi)型

(1)單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)固定波長(zhǎng)，分別測(cè)量樣品、空白對(duì)照的T或A，要求光源和檢測(cè)器供電電壓穩(wěn)定性高缺點(diǎn)：受電源波動(dòng)的影響較大，誤差較大。（2）單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)

優(yōu)點(diǎn)：消除光源強(qiáng)度不穩(wěn)帶來(lái)的影響，操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)記錄，快速全波段掃描，不需移動(dòng)吸收池。仍宜用固定波長(zhǎng)測(cè)量方式單色光能在很短的時(shí)間內(nèi)交替通過(guò)空白和樣品溶液（3）雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)通過(guò)切光器使兩束不同波長(zhǎng)的光交替通過(guò)吸收池，測(cè)得吸光度差

A。試樣溶液濃度與A成正比。優(yōu)點(diǎn)：可測(cè)多組份試樣、混濁試樣、而且可作成導(dǎo)數(shù)光譜、不需參比液(消除了由于參比池的不同和制備空白溶液等產(chǎn)生的誤差)、克服了電源不穩(wěn)而產(chǎn)生的誤差，靈敏度高。具有快速掃描的特點(diǎn)（4）光多道二極管陣列檢測(cè)分光光度計(jì)可在0.1秒內(nèi)獲得190～820nm范圍的全光光譜。用于追蹤化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究。操作簡(jiǎn)單，只需將樣品放入無(wú)蓋開(kāi)放式樣品室，并點(diǎn)擊“開(kāi)始”即可。MultiSpec-1500型紫外可見(jiàn)光電二極管陣列分光光度計(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)1、取吸收池時(shí)，手拿毛面。盛裝樣品溶液以池體積的4/5為宜。使用揮發(fā)性溶液時(shí)應(yīng)加蓋。吸收池每次放入的方向要相同。使用后用溶劑或水沖洗干凈，污染不易洗凈時(shí)可用硫酸-發(fā)煙硝酸（3：1）浸泡。2、含有雜原子的有機(jī)溶劑，通過(guò)有很強(qiáng)的末端吸收，用作溶劑時(shí)，測(cè)定波長(zhǎng)均不能小于溶劑的截止波長(zhǎng)。3、稀釋時(shí)，所取溶液體積不得少于5ml。含量測(cè)定時(shí)，常取3份，平行操作。4、除另有規(guī)定外，供試品溶液的吸光度在0.2-0.7之間為宜。5、狹縫寬度的選擇就以減小狹縫寬度時(shí)供試品的吸光度不再增加為準(zhǔn)?！?.應(yīng)用實(shí)例

吸收光譜比較簡(jiǎn)單，特征性不強(qiáng)，并且大多數(shù)簡(jiǎn)單官能團(tuán)在近紫外光區(qū)只有微弱吸收或無(wú)吸收，所以應(yīng)用有一定局限性。但可用于鑒定共軛生色團(tuán)，以此推斷未知物的結(jié)構(gòu)骨架，在配合其它結(jié)構(gòu)分析方法時(shí)，是有用的輔助方法。一、定性鑒別定性方法對(duì)比法 形狀、峰數(shù)、

max位置、強(qiáng)度與相應(yīng)的

同一物質(zhì)圖譜相同，但圖譜相同的不一定是同一物質(zhì)1.測(cè)定

max與不同波長(zhǎng)處A的比值

2.測(cè)定一定波長(zhǎng)下的E3.對(duì)比不同吸收峰（谷）的A或E的比值可以消除c、l的影響4.對(duì)比吸收光譜的一致性P14二、純度檢查雜質(zhì)檢查

化合物無(wú)吸收，雜質(zhì)有強(qiáng)吸收，如乙醇中的苯；化合物有吸收，雜質(zhì)可使化合物的吸光系數(shù)增大或減??；雜質(zhì)使吸收光譜變形。依據(jù)：Lambert-Beer定律，A=Ecl波長(zhǎng)：max，提高靈