第二章 蛋白質(zhì)2

第六節(jié)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)分子的多肽鏈按一定方式折疊、盤繞或組裝成特有的空間結(jié)構(gòu)，亦稱高級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)即蛋白質(zhì)的構(gòu)象。

構(gòu)象是指相同構(gòu)型的化合物中，與碳原子相連的各原子或取代基團(tuán)在單鍵旋轉(zhuǎn)時(shí)形成的相對(duì)空間排布。構(gòu)象的改變不需要共價(jià)鍵的斷裂和重新形成，只需單鍵的旋轉(zhuǎn)即可形成新的構(gòu)象。酰胺平面與α-碳原子的二面角（φ和ψ）

二面角

兩相鄰酰胺平面之間，能以共同的Cα為定點(diǎn)而旋轉(zhuǎn)，繞Cα-N鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱φ角，繞C-Cα鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱ψ角。φ和ψ稱作二面角，亦稱構(gòu)象角。肽鏈的主鏈可看成是由被Ca隔開的許多平面組成的。N端C端RHHOCCaNCaCRONOCNCaCRONCaHHHHCaH事實(shí)上，一個(gè)天然蛋白質(zhì)多態(tài)鏈在一定條件下只有一種或很少幾種構(gòu)象，而且相當(dāng)穩(wěn)定。維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的作用力

離子鍵氫鍵范德華力疏水相互作用力一、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)

（一）二級(jí)結(jié)構(gòu)的概念蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對(duì)空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象

。主要的化學(xué)鍵：

氫鍵

1.

a-螺旋(a-helix)

2.

b-折疊(b-pleatedsheet)

3.

b-轉(zhuǎn)角(b-turn)

4.無(wú)規(guī)卷曲(nonregularcoil)（二）二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的種類1）絕大多數(shù)天然蛋白質(zhì)都是右手螺旋。2）每隔3.6個(gè)氨基酸殘基螺旋上升一圈；每圈間距0.54nm，即每個(gè)氨基酸殘基沿螺旋中心軸上升0.15nm，旋轉(zhuǎn)100°。α-螺旋結(jié)構(gòu)的主要特點(diǎn)：1.α-螺旋(α-helix)3）每個(gè)氨基酸殘基的N-H都與前面（C端）第四個(gè)殘基C=O形成氫鍵。

4)螺旋體中所有氨基酸殘基側(cè)鏈都伸向外側(cè)；鏈中的全部C=O和N-H幾乎都平行于螺旋軸,氫鍵幾乎平行于中心軸;

*R為Gly時(shí)，由于Ca上有2個(gè)氫，使Ca-C、Ca-N的轉(zhuǎn)動(dòng)的自由度很大，即剛性很小，所以使螺旋的穩(wěn)定性大大降低。R基大(如Ile)也不易形成α-螺旋。*α-螺旋遇到Pro就會(huì)被中斷而拐彎，因?yàn)楦彼崾莵啺被崆矣袆傂缘沫h(huán)狀結(jié)構(gòu)。*帶相同電荷的氨基酸殘基連續(xù)出現(xiàn)在肽鏈上時(shí)，螺旋的穩(wěn)定性降低。側(cè)鏈在a-螺旋結(jié)構(gòu)的影響：*R基較小,且不帶電荷的氨基酸利于α-螺旋的形成,如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自發(fā)卷曲成α-螺旋。2.β-折疊(β-pleatedsheet)

β-折疊是由兩條或多條伸展的多肽鏈靠氫鍵聯(lián)結(jié)而成的鋸齒狀片狀結(jié)構(gòu)。①在

-折疊中，-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團(tuán)處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個(gè)氨基酸之間的軸心距為0.35nm。0.7nm

②-折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長(zhǎng)軸接近垂直。（a）平行式（b）反平行式③

-折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。后者更為穩(wěn)定。3.β-轉(zhuǎn)角（β-turn）

也稱β-回折，存在于球狀蛋白中。其特點(diǎn)是肽鏈回折180°，使得氨基酸殘基的C=O與第四個(gè)殘基的N-H形成氫鍵。第二個(gè)氨基酸通常是pro。

β-轉(zhuǎn)角都在蛋白質(zhì)分子的表面，多數(shù)為親水氨基酸組成。4.無(wú)規(guī)則卷曲（non-regularcoil）

又稱自由卷曲，是指沒(méi)有一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)，但是其結(jié)構(gòu)是明確而穩(wěn)定的，常常構(gòu)成酶的功能部位。

無(wú)規(guī)卷曲常出現(xiàn)在a-螺旋與a-螺旋、a-螺旋與β-折疊、β-折疊與β-折疊之間。它是形成蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)所必需的。二、蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)

（一）超二級(jí)結(jié)構(gòu)的概念指蛋白質(zhì)中相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單位(即單個(gè)-螺旋或-轉(zhuǎn)角)組合在一起，形成有規(guī)則的在空間上能辯認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體?！锍?jí)結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)層次上高于二級(jí)結(jié)構(gòu)，但沒(méi)有聚集成具有功能的結(jié)構(gòu)域。：由兩股或三股右手螺旋繚繞而成的左手螺旋：由兩股折疊片，中間加入螺旋而形成的片層結(jié)構(gòu)：由三條或更多的反平行式-鏈通過(guò)-轉(zhuǎn)角或其它的肽段連接而成的結(jié)構(gòu)（二）超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本形式超二級(jí)結(jié)構(gòu)類型βββααβαβ12345

指多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)或超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成三級(jí)結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū)，它是相對(duì)獨(dú)立的緊密球狀實(shí)體，稱為結(jié)構(gòu)域（domain）。

酵母己糖激酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域之間有一段柔性的肽鏈相連—鉸鏈區(qū)，使結(jié)構(gòu)域之間可以發(fā)生相對(duì)移動(dòng)；結(jié)構(gòu)域承擔(dān)一定的生物學(xué)功能，幾個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用可體現(xiàn)出蛋白質(zhì)的總體功能；結(jié)構(gòu)域間的裂縫常為酶的活性部位，也是反應(yīng)物的出入口。三、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域α+β結(jié)構(gòu)域乳酸脫氫酶結(jié)構(gòu)域1α/β結(jié)構(gòu)域

丙酮酸激酶結(jié)構(gòu)域43-P-甘油醛脫氫酶結(jié)構(gòu)域2木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)域1木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)域2無(wú)規(guī)則卷曲+α-螺旋結(jié)構(gòu)域無(wú)規(guī)則卷曲+β-回折結(jié)構(gòu)域

三級(jí)結(jié)構(gòu)（tertiarystructure）：指的是多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈構(gòu)象相互作用，進(jìn)一步盤曲折疊形成球狀分子結(jié)構(gòu)。四、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)

（一）三級(jí)結(jié)構(gòu)的概念（二）球狀蛋白的三級(jí)的結(jié)構(gòu)特征含有多種二級(jí)結(jié)構(gòu)單元。分子表面往往有一個(gè)內(nèi)陷的空隙，它常常是蛋白質(zhì)的活性中心。

大多數(shù)非極性側(cè)鏈埋在分子內(nèi)部，形成疏水核；而極性側(cè)鏈在分子表面，形成親水面。

蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)具有明顯的折疊層次。

分子呈現(xiàn)球狀或橢圓狀。（三）維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力二硫鍵

——共價(jià)鍵

疏水作用非共價(jià)鍵（次級(jí)鍵）氫鍵離子鍵范德華力四級(jí)結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）：由兩條或兩條以上具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈聚合而成、有特定三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)構(gòu)象。每條多肽鏈又稱為亞基(subunit)

。五、蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)

例如，血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)（一）四級(jí)結(jié)構(gòu)的概念（二）蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)1）有多個(gè)亞基2）穩(wěn)定性主要靠亞基間的疏水作用維持3）亞基單獨(dú)存在時(shí)無(wú)生物活性或活性很小，只有通過(guò)亞基相互聚合成四級(jí)結(jié)構(gòu)后，蛋白質(zhì)才具有完整的生物活性。4）亞基見具有協(xié)同性和別構(gòu)效應(yīng)。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)

二級(jí)結(jié)構(gòu)超二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)六、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）肌紅蛋白與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)Hb與Mb一樣能可逆地與O2結(jié)合，Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分?jǐn)?shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。（二）血紅蛋白的構(gòu)象變化與結(jié)合氧肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線1.協(xié)同效應(yīng)(cooperativity)一個(gè)寡聚體蛋白質(zhì)的一個(gè)亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個(gè)亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應(yīng)。如果是促進(jìn)作用則稱為正協(xié)同效應(yīng)(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)

(negativecooperativity)O2血紅素與氧結(jié)合后，鐵原子半徑變小，就能進(jìn)入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動(dòng)。變構(gòu)效應(yīng)(allostericeffect)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變伴隨其功能的變化，稱為變構(gòu)效應(yīng)。2.波爾效應(yīng)（Bohr）1904年，ChristianBohr發(fā)現(xiàn)：增加CO2濃度、降低pH能顯著降低血紅蛋白與O2的結(jié)合。？生理意義：波爾效應(yīng)使血紅蛋白運(yùn)輸O2的效率提高。2，3—二磷酸甘油酸（BPG）通過(guò)與血紅蛋白的兩個(gè)β亞基形成鹽鍵穩(wěn)定了血紅蛋白的脫氧態(tài)構(gòu)象，因而降低了血紅蛋白的氧親合力。3.BPG的別構(gòu)效應(yīng)（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病蛋白質(zhì)構(gòu)象疾?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生錯(cuò)誤，盡管其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致疾病發(fā)生。蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機(jī)理：有些蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動(dòng)物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病第七節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（一）蛋白質(zhì)的兩性電離蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。*蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。蛋白質(zhì)的等離子點(diǎn)（特征常數(shù)）：指在純水中（即沒(méi)有其它鹽類存在）蛋白質(zhì)的正離子數(shù)等于負(fù)離子數(shù)的pH值。因蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不是一成不變的，它隨溶劑性質(zhì)、離子強(qiáng)變等因素而改變。二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的顆粒，因而具有膠體溶液的特征（布郎運(yùn)動(dòng)、丁道爾現(xiàn)象、不能透過(guò)半透膜）。1.蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素①可溶性蛋白質(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對(duì)水有很高的親和性，通過(guò)水合作用在蛋白質(zhì)顆粒表面形成水化層，其可防止分子互碰而聚集；②蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)狀態(tài)時(shí)帶同種電荷，在顆粒表面形成電荷層，同性電荷互斥，使分子不能聚集。+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化層++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用

蛋白質(zhì)的聚沉蛋白質(zhì)膠體溶液沉淀作用示意圖

2.蛋白質(zhì)的沉淀作用

如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點(diǎn)狀態(tài)或失去水化層（消除相同電荷，除去水膜），蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。沉淀方法類別:①高濃度中性鹽（鹽析）②等電點(diǎn)沉淀③有機(jī)溶劑沉淀④重金屬鹽類沉淀⑤生物堿試劑和某些酸類沉淀⑥加熱變性沉淀

鹽析(saltprecipitation)是將高濃度硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。*分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。例如：血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。3.沉淀類型A.可逆沉淀

在發(fā)生沉淀反應(yīng)時(shí)，蛋白質(zhì)雖已沉淀析出，但它的分子內(nèi)部、空間結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化，基本上保持原有的性質(zhì)，沉淀因素除去后，能再溶于水溶液中。這種作用稱為可逆沉淀反應(yīng)。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)以及利用等電點(diǎn)的沉淀，提純蛋白質(zhì)時(shí)，常利用此類反應(yīng)。B.不可逆沉淀/變性沉淀在發(fā)生沉淀反應(yīng)時(shí)，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象遭到破壞，失去原來(lái)的天然性質(zhì)，這時(shí)蛋白質(zhì)已發(fā)生變性。這種變性蛋白質(zhì)的沉淀不能再溶解于原來(lái)溶劑或水溶液中的作用稱為不可逆沉淀反應(yīng)或變性沉淀。重金屬鹽、生物堿試劑，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、加熱、震蕩、超聲波、有機(jī)溶劑等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀反應(yīng)。

蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在而并不析出，例如：在強(qiáng)酸堿中變性的蛋白質(zhì)在強(qiáng)酸堿溶液中仍存在電荷效應(yīng)，所以不表現(xiàn)為沉淀現(xiàn)象。相對(duì)地，沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。*蛋白質(zhì)的凝固作用(proteincoagulation)蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅(jiān)固的凝塊，此凝塊不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中。

（三）蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性蛋白質(zhì)在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無(wú)序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。1.蛋白質(zhì)變性的概念2.變性的本質(zhì)——破壞非共價(jià)鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。3.變性的因素

加熱、有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、表面活性劑（如十二烷基硫酸鈉即SDS）、還原性試劑（尿素、鹽酸胍）、紫外線、機(jī)械力等。

4.變性蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變

①生物學(xué)功能的喪失（主要標(biāo)志）；

②分子形狀改變，肽鏈松散，反應(yīng)基團(tuán)增加，易被酶消化；

③疏水基團(tuán)外露，水化層被破壞，溶解度降低，易形成沉淀析出，粘性增加，紫外吸收改變等；

④喪失結(jié)晶能力。應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來(lái)消毒及滅菌。此外,防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。

5.蛋白質(zhì)的復(fù)性若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來(lái)的構(gòu)象，恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性(renaturation)，這種變性也稱為可逆變性?？赡孀冃宰饔玫鞍踪|(zhì)復(fù)性（尿素、β-巰基乙醇）（去除尿素、β-巰基乙醇）非折疊狀態(tài)，無(wú)活性天然狀態(tài)，有催化活性（四）蛋白質(zhì)的分子大小蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子，相對(duì)分子質(zhì)量大于6000，最高可達(dá)40000000（煙草花葉病毒）。目前常用的方法包括：擴(kuò)散系數(shù)、沉降超離心、凝膠過(guò)濾、滲透壓、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。1.根據(jù)化學(xué)成分測(cè)定最小相對(duì)分子質(zhì)量

利用化學(xué)分析定量測(cè)定蛋白質(zhì)中某一特殊元素的含量，并假定蛋白質(zhì)分子中含1個(gè)這種元素，即可測(cè)算最低Mr。如：用化學(xué)分析法測(cè)定血紅蛋白質(zhì)中含F(xiàn)e0.34％，則最低Mr=55.84×100/0.34=16700；用其它方法測(cè)定，其實(shí)際Mr為16700的4倍，由此可知，血紅蛋白含有4個(gè)Fe的原子，而不是1個(gè)Fe。2.

超離心法在60000～80000r/min的高速離心力作用下，蛋白質(zhì)分子會(huì)沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動(dòng)。超離心法最為準(zhǔn)確，但需昂貴的超速離心機(jī)。用光學(xué)方法測(cè)定界面移動(dòng)的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降速度。蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān)，因?yàn)槌两迪禂?shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，但對(duì)分子形狀高度不對(duì)稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用。離心機(jī)結(jié)構(gòu)示意圖轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)頭腔沉降樣品驅(qū)動(dòng)馬達(dá)真空冷凍沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場(chǎng)中的沉降速度，用S表示。一個(gè)S單位，為1×10-13秒。相對(duì)分子質(zhì)量越大，S值越大。蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：1～200S。超速離心法既可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量也可以用作分離純化蛋白質(zhì)。

s=————vω2x

v=沉降速度（dx/dt）ω=離心機(jī)轉(zhuǎn)子角速度（弧度/s）x=蛋白質(zhì)界面中點(diǎn)與轉(zhuǎn)子中心的距離（cm）由沉降系數(shù)S可根據(jù)斯維得貝格〔Svedberg〕方程計(jì)算蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量：M=RST/D〔1－iρ〕R：氣體常數(shù)T：絕對(duì)溫度D：擴(kuò)散系數(shù)ρ：溶劑的密度3.凝膠過(guò)濾法凝膠過(guò)濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。一定型號(hào)的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外。洗脫時(shí)大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來(lái)，洗脫液體積??；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來(lái)穿去，歷程長(zhǎng)，后洗脫下來(lái)，洗脫體積大。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex洗脫體積：自加入樣品開始到該組分的洗脫峰峰頂（即收集液中該組分濃度最大時(shí)）出現(xiàn)時(shí)所流出的洗脫液體積。測(cè)定樣品蛋白質(zhì)分子量的方法：

①測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積〔Ve〕；

②以相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)（logM）對(duì)Ve作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線；

③再測(cè)出未知樣品洗脫體積〔Ve〕；

④從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠：?jiǎn)误w—丙烯酰胺（acrylamide,簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑—N,N-甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide,簡(jiǎn)稱Bis）在加速劑和催化劑的作用下聚合而成的高分子物質(zhì)，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和分子篩性質(zhì)。以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,簡(jiǎn)稱PAGE）。SDS:十二烷基硫酸鈉，變性劑普通蛋白質(zhì)電泳的泳動(dòng)速率取決于荷質(zhì)比（凈電荷、大小、形狀）★此方法只能測(cè)得亞基肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量方法：①用SDS和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與SDS結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使得不同蛋白質(zhì)分子均帶負(fù)電（SDS帶負(fù)電），且荷質(zhì)比相同（蛋白質(zhì)分子大，結(jié)合SDS多；分子小，結(jié)合SDS少）；不同蛋白質(zhì)分子具有相似的構(gòu)象。②用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值對(duì)它們的遷移率作圖③測(cè)出待測(cè)樣品的遷移率④從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的相對(duì)分子質(zhì)量二、蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)分離純化的一般原則提純的目標(biāo)：盡量提高蛋白質(zhì)的純度或比活性，設(shè)法除去變性的和不需要的蛋白質(zhì)，盡可能提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)加以選擇，如分子大小，溶解度、電荷、吸附性質(zhì)及生物親和力等。一般程序：

1、從組織細(xì)胞中溶解放出蛋白質(zhì)，并保持天然狀態(tài)，常用低溫