第二章 生物制藥工藝基礎(chǔ)2010

第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

Basisofbiopharmaceuticaltechnology

一、生物材料的選擇：

1．生物活性物質(zhì)存在部位：胞內(nèi)、胞外、胞漿、質(zhì)膜、器膜等。

2．生物材料的采集與質(zhì)控

（1）品種鑒定；（2）防止污染與感染；（3）選擇富集目的物材料；（4）冷凍保存。

第一節(jié)生物藥物提取、分離、純化技術(shù)基礎(chǔ)

二、生物活性物質(zhì)常用的提取方法與優(yōu)化

（一）幾種常用提取方法

1．酸、堿、鹽水溶液提取方法2．表面活性劑提取方法與反膠束提取方法

3．有機(jī)溶劑提取4.雙水相萃取法5．超臨界流體萃取法

（二）提取方法與優(yōu)化

1.溶劑選擇

2.選擇添加劑①保護(hù)劑；②酶抑制劑。

3.提取條件①溫度；②pH；③鹽；④表面活性劑。三．濃縮與干燥

1.濃縮方法：①鹽析；②有機(jī)溶劑沉淀；③高分子脫水；④超濾；⑤真空濃縮或薄膜濃縮。

世界上最大的具有80m2蒸發(fā)面積的薄膜蒸發(fā)器。薄膜蒸發(fā)器

2.干燥：

①低溫真空干燥；②噴霧干燥；③冷凍干燥

干燥

使物質(zhì)從固體或半固體狀經(jīng)除去存在的水分或它種溶劑，從而獲得干燥物品的過程。

干燥的目的：a.提高穩(wěn)定性，便于貯存、運(yùn)輸；b.有一定的規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)；c.便于進(jìn)一步處理。

冷凍干燥機(jī)

四、分離純化1.生化制藥工藝中分離純化特點(diǎn):

(1)生物材料組成復(fù)雜(2)目的物含量低(3)易變性、失活(4)分離方法有很大經(jīng)驗(yàn)成分(5)步驟多，逐級分離(6)產(chǎn)品驗(yàn)證與化學(xué)上純度概念不完全相同2.分離純化原理

(1)根據(jù)分子形狀與分子大小(2)根據(jù)電荷差異(3)根據(jù)分子極性與溶解度大小(4)根據(jù)吸附特性(5)根據(jù)生物配基特性3.選擇原則（1）粗品分離：大處理量,相對低分辨率。鹽析，分級沉淀，萃取，超濾。（2）精制：高分辨率。多種色譜層析法,親和層析，HPLC，F(xiàn)PLC（快速蛋白液相色譜），電泳或等電聚焦。

第二節(jié)微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

一、菌種的選育與保藏1．自然選育依據(jù)自發(fā)突變原理，通過不斷分離篩選，除去衰變菌落，選擇高產(chǎn)菌，達(dá)到強(qiáng)化、復(fù)壯、穩(wěn)定生產(chǎn)目的（p41）。方法：（1）平板劃線法（2）稀釋平板法（1）平板劃線法是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線”稀釋而達(dá)到分離的目的。固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法步驟：

步驟一：接種針先以火焰滅菌法滅菌。

步驟二：輕觸營養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻。

步驟三：以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。

步驟四：更換一個(gè)新的無菌營養(yǎng)平板。

步驟五：將接種針上的細(xì)菌劃于一個(gè)新的營養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū)。

步驟六：重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。

步驟七：由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二區(qū)，如上圖。

步驟八：重復(fù)第六及第七步驟，由第七步驟的第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如上圖。

步驟九：重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后的營養(yǎng)平板，如上圖。

步驟十：在營養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽，標(biāo)示好接種日期、菌種學(xué)名以及培養(yǎng)基名稱。（2）稀釋平板法

是將樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后將稀釋液涂布于培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，待長出獨(dú)立的單個(gè)菌落，進(jìn)行挑選分離。2．誘變育種（p43-p48）指有意識(shí)地將生物體暴露于物理的、化學(xué)的或生物的一種或多種誘變因子，促使生物體發(fā)生突變，進(jìn)而從突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程。（1）出發(fā)菌株的選擇①純種菌株②具備優(yōu)良性狀的菌株③對誘變劑敏感④選擇幾株不同的優(yōu)良菌株（2）誘變處理:①化學(xué)誘變②物理誘變③生物誘變④新型誘變劑（3）篩選：①隨機(jī)篩選；②理性化篩選①隨機(jī)篩選：菌種經(jīng)誘變處理后，進(jìn)行平板分離，經(jīng)培養(yǎng)后隨機(jī)挑選單菌落，從中篩選出具有優(yōu)良性狀的菌株。（p52）搖瓶篩選法瓊脂塊篩選法篩選自動(dòng)化和篩選工具微型化②理性化篩選：是應(yīng)用遺傳學(xué)和生物化學(xué)的原理，根據(jù)已知或可能的目的產(chǎn)物生物合成途徑的調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)篩選方法，定向選出有效的性狀突變株。

根據(jù)微生物代謝產(chǎn)物的不同，其理化篩選的方法也不同。初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選方法（p54）次級代謝產(chǎn)物（主要是抗生素）高產(chǎn)菌株的篩選方法（p57）3、現(xiàn)代菌種選育技術(shù)（p61-）

①雜交育種②原生質(zhì)體融合③基因工程技術(shù)

雜交育種將兩個(gè)基因型不同的菌株經(jīng)吻合（或接合）使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選出具有新性狀菌株的過程。獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：1、遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換和重新組合，改變親株的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)、擴(kuò)大變異范圍，獲得新品種。2、獲得新遺傳特性的重組體，可克服因長期誘變造成的生活力下降、代謝緩慢等缺陷，還可提高對誘變劑的敏感性。原生質(zhì)體融合育種

原生質(zhì)體融合菌種保藏（p56、110）（1）保存目的：防止退化（2）菌種退化檢查方法（3）菌種退化防止方法①防止基因突變：如低溫保藏②采用雙重缺陷型③制作平行的菌種斜面，少傳代④分離單菌落，自然篩選⑤選擇培養(yǎng)條件（4）菌種保藏方法：①斜面保藏法②液體石蠟保藏法③沙土管保藏法④麩皮保藏法⑤冷凍干燥保藏法⑥液氮超低溫保藏法

⑦甘油保藏法⑧孢子濾紙保藏法

第三節(jié)生物技術(shù)藥物制造技術(shù)基礎(chǔ)

一、重組DNA技術(shù)原理1．基因工程操作過程：

（1）獲得目的基因；（2）構(gòu)建DNA重組體；（3）將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；（4）工程菌的克隆與鑒定；（5）目的基因擴(kuò)增與蛋白表達(dá)。

2．基因工程藥物制造過程二、基因工程主要操作技術(shù)1．目的基因的獲得基因組文庫中獲得cDNA文庫中獲得PCR擴(kuò)增法化學(xué)合成方法中獲得（1）cDNA文庫

純化目的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA①mRNA的分離②cDNA第一鏈的合成③cDNA第二鏈的合成④cDNA與載體連接⑤轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化⑥篩選目的克隆目的基因的獲得：cDNA文庫（2）PCR法或逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）

典型PCR反應(yīng)包括:①模板變性94℃以上（1～2′）②退火50～55℃（1～2′）③延伸72℃（1～2′）在高溫聚合酶作用下，以DNA單鏈為模板，由引物起始從5′→3′延伸。No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量（3）化學(xué)合成法

在已知DNA序列或多肽的一般結(jié)構(gòu)時(shí)，如鏈長在60bp～100bp可用化學(xué)合成法直接合成DNA。2．DNA重組體的構(gòu)建根據(jù)宿主菌不同，選擇基因載體（Vector）（1）E.coli：質(zhì)粒非表達(dá)型pBR322，表達(dá)型pUC，實(shí)用型pBV220，PET系統(tǒng)，λ噬菌體DNA作為載體，非表達(dá)型λgt10，表達(dá)型λgt11。（2）芽孢桿菌：pUB110pE194和pC194（3）鏈霉菌：pIJ101pSG5cDNA與載體連接方法①同聚尾連接法②人工接頭連接法質(zhì)粒載體PBR322頭部尾尾部纖維

蛋白衣殼λ噬菌體3．重組體的表達(dá)系統(tǒng)（1）原核表達(dá)系統(tǒng)

①E.coli；②芽孢桿菌Bacillus；③鏈霉菌Streptomyces

優(yōu)點(diǎn)：易大量生產(chǎn)，成本低，周期短

缺點(diǎn)：多為胞內(nèi)表達(dá)、提取困難，易生成包含體、含起始密碼Met（AUG），有內(nèi)毒素毒性。大腸桿菌枯草芽孢鏈霉菌（2）真核表達(dá)系統(tǒng)

①酵母表達(dá)畢赤酵母（pichiapsatoris）受甲醇誘導(dǎo)。優(yōu)點(diǎn)：易培養(yǎng)無毒性，易高密度發(fā)酵（100g/L），高表達(dá)，成本低，產(chǎn)物可糖基化，有分泌表達(dá)。

②動(dòng)物細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞——CHO（倉鼠細(xì)胞）昆蟲細(xì)胞——家蠶細(xì)胞酵母細(xì)胞4．表達(dá)產(chǎn)物的純化包含體inclusionbodies:大部分是表達(dá)產(chǎn)物，（還有細(xì)胞蛋白和膜蛋白）一級結(jié)構(gòu)正確、無活性，不溶于水，可用變?nèi)軇㏒DS尿素，鹽酸胍溶解，再稀釋透析除去變性劑，使其復(fù)性。

為防止或減少包含體的形成常用方法：

（1）降低培養(yǎng)溫度：從37℃降到30℃可顯著降低包含體形成率。（2）以硫氧還原蛋白為載體進(jìn)行融合表達(dá)。硫氧還原蛋白是E.coil的一種同源蛋白，定位于粘附區(qū)，富含-SH,可保目的蛋白不發(fā)生分子錯(cuò)誤折疊，是一種熱穩(wěn)定蛋白，表達(dá)產(chǎn)物聚集于粘附區(qū)，通過振擾提取使產(chǎn)物進(jìn)入介質(zhì)中，再酶解就得到目的蛋白。三、酶工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)1、酶工程(enzymeengineering)

研究內(nèi)容（1）酶的發(fā)現(xiàn)、分離純化與生產(chǎn)應(yīng)用。（2）酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)與酶反應(yīng)器。（3）生物酶工程：以基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究酶工程。（4）抗體酶、模擬酶、合成酶及酶的人工設(shè)計(jì)。（書P102）2、固定化酶(immobilizedenzyme)（1）固定化穩(wěn)定性提高（2）可重復(fù)使用、提高使用效率、降低成本（3）提高強(qiáng)度，便于連續(xù)、自動(dòng)、規(guī)?；a(chǎn)（4）便于產(chǎn)物的分離、純化固定化酶反應(yīng)器共價(jià)鍵結(jié)合酶固定化間