菠菜中提取葉綠素

實驗菠菜色素的提取和色素分離extractionofpigmentsfromspinachandchromagraphicisolation）【實驗目的】（1）通過綠色植物色素的提取和分離，了解天然物質(zhì)分離提純方法；（2）通過薄層色譜分離操作，加深了解微量有機物色譜分離鑒定的原理；（3）從菠菜中提取出葉綠素、胡蘿卜素、葉黃素等色素并加以分離。【實驗原理】色譜法利用混合物中各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它親和作用性能的差異，使混合物的溶液流經(jīng)該種物質(zhì)，進行反復的吸附或分配等作用，從而將各組分分開薄層色譜法是其中一種微量快速的分析分離方法。它具有靈敏、快速準確等優(yōu)點。薄層色譜屬于固-液吸附層析的類型。通常是把吸附劑放在玻璃板上成為一個薄層，作為固定相，以有機溶劑作為流動相。實驗時，把要分離的混合物滴在薄層板的一端，用適當?shù)娜軇┱归_。當溶劑流經(jīng)吸附劑時，由于各物質(zhì)被吸附的強弱不同，就以不同的速率隨著溶劑移動。展開一定時間后讓溶劑停止流動，混合物中各組分就停留在薄層板上顯示出一個個色斑的色譜圖。若各組分無色，可噴灑一定的顯色劑使之顯色（如圖）?；旌衔镏懈魑镔|(zhì)在薄板上隨溶劑移動的相對距離稱為比移值（Rf值）。溶質(zhì)的最高濃度中心至原點中心的距離

溶劑前沿至原點中心的距離如下圖中：Rf如下圖中：Rf（化合物山瓷=°-25R￡（化合物2）=8^=°.7°f 12cm洛擠前沿分離的組份（b）已展開層析板洛擠前沿分離的組份（b）已展開層析板（a）原板圖薄層色譜裝置圖圖薄層色譜效果圖圖薄層色譜裝置圖圖薄層色譜效果圖在一定條件下，各物質(zhì)具有一定的Rf值。不同物質(zhì)在相同條件下，具有不同的Rf值。因此，可利用Rf值對物質(zhì)進行定性鑒定。但物質(zhì)的Rf值常因吸附劑的種類和活性、薄層的厚度、展開劑及溫度等的不同而異。所以在鑒定樣品時，常用已知成分作對照試驗，在同一個薄層板上進行層析，然后通過Rf值的比較，對物質(zhì)作定性鑒定。根據(jù)斑點的面積大小和顏色的深淺的標準物的對照下還可進行定量?；衔锏奈叫耘c其極性成正比，化合物分子中含有極性較大的基團時吸附性也較強。展開劑（溶劑）的極性越大，則對化合物的洗脫力越大，貝VRf越大（如果樣品在溶劑中有一定的溶解度）。綠色植物如菠菜葉中含有葉綠素（綠）、胡蘿卜素（橙）和葉黃素（黃）等多種天然色素。本實驗從菠菜中提取上述幾各色素，并通過薄層層析進行分離。葉綠素存在兩種結(jié)構(gòu)相似的形式——葉綠素a（C55H72O5N4Mg）以及葉綠素b（C55H70O6N4Mg）,其差別僅是a中一個甲基被b中的甲?；〈?。它們都是吡咯衍生物與金屬鎂的絡合物，是植物進行光合作用所必需的催化劑。植物中葉綠素a的含量通常是b的3倍。盡管葉綠素分子中含有一些極性基團，但大的烴基結(jié)構(gòu)使它易溶于醚、石油醚等一些非極性的溶劑。胡蘿卜素（C40H56）是具有長鏈結(jié)構(gòu)的共軛多烯。它有三種異構(gòu)體，即a-，B-和Y-胡蘿卜素，其中B-異構(gòu)體含量最多，也最重要。在生物體內(nèi)，B-體受酶催化氧化即形成維生素A。目前B-胡蘿卜素已可進行工業(yè)生產(chǎn)，可作為維生素A使用，也可作為食品工業(yè)中的色素。葉黃素（c40h56o丿是胡蘿卜素的羥基衍生物，它在綠葉中的含量通常是胡蘿卜素的兩倍。與40562胡蘿卜素相比，葉黃素較易溶于醇而在石油醚中溶解度較小。CH2【實驗試劑】20g菠菜葉，20mL甲醇，40mL石油醚（60?90°C）—甲醇（3:2）溶液，硅膠G，0.5%羧甲基纖維素鈉，無水硫酸鈉，石油醚－丙酮（8:2），石油醚－乙酸乙酯（6:4）【實驗步驟】1、薄層板的制備取四塊顯微載玻片，洗凈晾干。在小燒杯中，放置3.0g硅膠，逐漸加入0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液6~7mL，調(diào)成均勻的糊狀，其稀稠為在震動下可流動，倒在潔凈的載玻片上，用食指和拇指拿住玻璃板，前后左右振搖、擺動并不時轉(zhuǎn)動方向，制成薄厚均勻、表面光潔平整、無氣泡的薄層板，厚度為0.25?1.0mm。涂好后的硅膠G薄層板置于水平的玻璃板上，在室溫下放置0.5h后（注意：室溫放置必須使玻板干透，否則會出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象），放入烘箱中緩慢升溫至110C，恒溫0.5~1h后取出，稍冷備用。2菠菜色素的提取稱取20g洗凈用濾紙吸干的的新鮮（或冷凍）的菠菜葉，用剪刀剪碎并與20mL甲醇拌勻，在研缽中研磨約5min然后用布氏漏斗抽濾菠菜汁，棄去濾液。將菠菜汁放回研缽，每次用20mL3:2（體積比）的石油醚-甲醇混合液萃取兩次，每次需加以研磨充分并且抽濾。

注意：因石油醚易揮發(fā)，抽濾時先倒少許清液浸潤濾紙，抽濾時真空度不要太大！合并濾液，用吸管取上層深綠色萃取液，轉(zhuǎn)入分液漏斗，每次用10mL水洗滌兩次，以除去萃取液中的甲醇。洗滌時要輕輕旋蕩，以防止產(chǎn)生乳化。棄去水一甲醇層，石油醚層用無水硫酸鈉干燥30min后，濾入圓底燒瓶（勿將干燥劑濾入）在水浴上蒸去大部分石油醚至體積約為1mL為止。石油醚回收。3、點樣取活化后的層析板，分別在距一端1cm處用鉛筆輕輕劃一橫線作為起始線。另一端距約1cm處也劃一橫線作為終止線。取毛細管（直徑0.5mm）插入樣品溶液中，在一塊板的起點線上點兩個點。樣點間相距1?1.5cm。樣點直徑不應超過2mm。注意：點樣時手指捏住毛細管下端，垂直點樣，輕觸薄層板后立即抬起。點樣要輕，不可刺破薄層。因溶液太稀或樣點太小，可重復點樣。但應在前次點樣的溶劑揮發(fā)后，方可重點，以防樣點被溶解掉。薄層色譜中樣品的用量對物質(zhì)的分離效果有很大在影響，所需樣品的量與顯色劑的靈敏度、吸附劑的種類、薄層厚度均有關系。樣品太少時，斑點不清楚，難以觀察，但樣品量太多時往往出現(xiàn)斑點太大，造成拖尾，擴散等現(xiàn)象，影響分離效果。4、層析展開薄層色譜展開劑的選擇主要根據(jù)樣品的極性、溶解度和吸附劑的活性等因素。溶劑的極性越大，則對化合物的解吸能力越強，即Rf值也越大。如Rf值較大，可考慮換用一種極性較小的溶劑，或在原用展開劑中加入適量極性較小的溶劑。相反，如原用展開劑使樣品各組分的Rf值較小，則可加入適量極性較大的溶劑，如氯仿中加入適量的乙醇。常用展開劑的極性大小如下：水〉乙醇〉乙酸乙酯氯仿＞苯＞環(huán)己烷〉石油醚本次實驗采用的以下展開劑：（a）石油醚-丙酮=8:2（體積比） 點三塊板（b） 石油醚-乙酸乙酯=6:4（體積比）點一塊板薄層色譜的展開，須在密閉容器中進行（如圖5-11）。在容器中加入一定體積的展開劑，內(nèi)壁貼一張高5cm，繞周長約4/5的濾紙（目的是為了使展開劑蒸汽在燒杯內(nèi)迅速達到平衡），下部浸入展開劑中，蓋好表面皿。點樣后的薄層板小心放入預先加入選定展開劑的