生長相關蛋白43的研究進展

生長相關蛋白43的研究進展

相關蛋白質(zhì)43（growingasykot43，簽名-43）是與神經(jīng)發(fā)育、突變形成和可塑性密切相關的磷酸細胞蛋白。周圍神經(jīng)損傷后,其含量可增加20~100倍。因其是神經(jīng)元生長發(fā)育的標志性蛋白質(zhì),并在神經(jīng)損傷后修復及再生過程中作用關鍵,對其研究日漸增加,本文就GAP-43的研究進展及其與周圍神經(jīng)再生的關系作一綜述。1與軸突生長相關的蛋白質(zhì)的描述荷蘭科學家A.B.Oestreicher等在研究腦內(nèi)磷酸肌醇代謝時發(fā)現(xiàn)了一種蛋白激酶C(PKC)的底物蛋白,命名為B-50;美國的1個實驗室用GAP-43描述1種與軸突生長相關的蛋白質(zhì);另有許多學者在不同研究中分別用不同的代號表示1種新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白質(zhì),如F1為海馬神經(jīng)元持久突觸后電位相關的磷蛋白、PP46為一種神經(jīng)元生長錐膜的主要磷酸化蛋白質(zhì)、P57為神經(jīng)元特異性的鈣調(diào)素蛋白,而L.I.Benowitz等通過對這些蛋白質(zhì)氨基酸順序及其生化及免疫特性的分析,證明這些命名不同的蛋白質(zhì)實際上是同一種物質(zhì),即神經(jīng)系統(tǒng)特有的膜磷酸蛋白———GAP-43,后來被統(tǒng)一稱為GAP-43或B-50。2分子質(zhì)量酶根據(jù)已經(jīng)克隆到的幾種動物(如大鼠、小鼠、牛)和人的cDNA序列,不同物種間GAP-43的一級結構具有高度的同源性。大鼠的GAP-43由226個氨基酸殘基組成,而人的GAP-43由238個氨基酸殘基組成,其中酸性氨基酸殘基占32%,等電點為4.3~4.5,相對分子量為43000。它只含有1個芳香族氨基酸殘基,而Ala、Glu、Lys和Pro的含量極其豐富,二級結構以無規(guī)則卷曲為主,整個分子呈棒狀,具有很強的柔韌性。氨基酸序列極富親水性,而疏水性氨基酸極少,且缺乏膜結合位點,然而它卻以可溶性和膜結合的形態(tài)存在。從細胞水平看,它在軸突生長錐的動態(tài)結構中含量極高,而在胞漿中含量較低。GAP-43依靠其分子氮末端的1個疏水基與質(zhì)膜上的脂肪鏈形成共價鍵而結合在質(zhì)膜的內(nèi)表面疏水端。它是蛋白激酶C的主要作用底物,經(jīng)其作用后被磷酸化,其第41位氨基酸殘基是整個分子中唯一的蛋白磷酸化酶作用位點;其第42位的苯丙氨酸殘基與鈣調(diào)蛋白(鈣調(diào)素)有高度的親和力(以共價鍵結合)。在缺少鈣的情況下,可優(yōu)先與鈣調(diào)素結合。另外,GAP-43的磷酸化使其與鈣調(diào)素解聚,并且它還是磷酸肌醇代謝的調(diào)節(jié)物。3神經(jīng)纖維在腦或髓劍化的表達GAP-43是一種神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白質(zhì),廣泛分布于大腦、小腦、海馬以及脊髓、背根神經(jīng)節(jié)和自主神經(jīng)系統(tǒng)。近年來有學者發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、雪旺細胞均能表達GAP-43。發(fā)育中的脊髓和神經(jīng)節(jié)GAP-43的分布及其含量可較成熟神經(jīng)元高10~20倍,且主要位于生長錐膜。人早期受孕6周胚胎所有發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)均有GAP-43mRNA的表達,最高表達存在于分化神經(jīng)元的區(qū)域,如皮層板內(nèi);出生后1周內(nèi)達到高峰,隨后在大部分腦區(qū)內(nèi)迅速下降到成年的低水平。成年時只有少數(shù)“活躍”腦區(qū)仍保持較高的表達,這些區(qū)域有:大腦皮層、海馬CA3區(qū)、嗅球、藍斑、中縫核、迷走神經(jīng)背核等,其中海馬CA3區(qū)、嗅球終身都在分化。另外,在腦或脊髓,GAP-43的分布有與神經(jīng)纖維髓鞘化呈反比的趨勢。在無髓或低髓鞘化的區(qū)域,GAP-43的表達水平高,而在髓鞘化水平高的區(qū)域如脊髓白質(zhì)及神經(jīng)纖維則不表達。此外,從發(fā)育過程中也可見GAP-43的表達,如新生第5天的大鼠,脊髓髓鞘化剛開始在脊髓白質(zhì)內(nèi)可見有強烈而均勻的GAP-43mRNA信號;在出生后第12天,髓鞘化接近成年狀態(tài),表達就明顯降低;在出生后第28天,髓鞘化已完成時,則降至成年水平。4q基序?qū)a2+和鈣調(diào)素的調(diào)節(jié)作用GAP-43與膜骨架的關系及膜連接的作用。GAP-43最初在高爾基器內(nèi)與神經(jīng)元膜成分結合,以膜泡形式沿軸突以400mm·d-1的速度快速轉(zhuǎn)運,最后多聚集于軸突突觸前終末,然后通過其N端的疏水性片段緊密連接在神經(jīng)終末質(zhì)膜胞質(zhì)面,其中第3、4位的半胱氨酸與生長錐膜進行的可逆性結合可能起了重要的作用,作為一種高度親水性蛋白,GAP-43與膜結合的假想模型是其在與胞質(zhì)蛋白和細胞骨架蛋白相互作用及與膜結合這2種形式間相互轉(zhuǎn)換。質(zhì)膜內(nèi)表面的蛋白網(wǎng)狀結構可決定軸突終末的形狀、活動性和通路引導。在生長錐,GAP-43通過與組成網(wǎng)狀結構的膜骨架蛋白如肌動蛋白、胞影蛋白等結合而影響突觸前終末的生長狀態(tài)。另外,它可促進F-肌動蛋白在生長錐的聚集,使生長錐在形態(tài)上更具活力,并抵抗其回縮。GAP-43與鈣調(diào)素的關系。GAP-43是鈣激活蛋白家族的一員,這類分子與鈣調(diào)素的結合域是同源的,含有一“IQ”基序,可調(diào)節(jié)Ca2+流量及鈣調(diào)素的效力。鈣調(diào)素與GAP-43的“IQ”區(qū)相結合,而GAP-43的PKC磷酸化位點Ser41也在該區(qū)內(nèi),因此磷酸化GAP-43將破壞其與鈣調(diào)素的結合。相反,GAP-43與鈣調(diào)素結合時將抑制PKC在該位點的磷酸化。GAP-43與鈣調(diào)素的親和性是非Ca2+濃度依賴的:當Ca2+低水平時,GAP-43與鈣調(diào)素緊密結合;當Ca2+進入細胞后水平增高時便釋放鈣調(diào)素。GAP-43作為鈣調(diào)素的貯存庫,在第二信使作用下釋放鈣調(diào)素,同時GAP-43磷酸化。鈣調(diào)素的釋放引起神經(jīng)末端局部位點鈣調(diào)素依賴的級聯(lián)蛋白的快速激活,如激活鈣調(diào)素激酶引起突觸素等蛋白的磷酸化,激活鈣調(diào)磷酸酶可引起GAP-43的去磷酸化和與鈣調(diào)素的重新結合,從而形成1個反饋環(huán)?；罨腉AP-43進一步與細胞骨架成分相互作用,調(diào)節(jié)神經(jīng)末端的活力,進而改變細胞形態(tài)。GAP-43與磷酸化和去磷酸化的關系。盡管早已知道GAP-43是PKC在神經(jīng)元內(nèi)的一種重要底物,但GAP-43磷酸化與神經(jīng)生長的作用到近年才漸趨明了。轉(zhuǎn)基因鼠過表達假磷酸化蛋白能誘導偽足生長、細胞黏附和肌動蛋白重組,使海馬中產(chǎn)生大量投射纖維;反之,過表達去磷酸化GAP-43的轉(zhuǎn)基因鼠的細胞出芽就大為減少,表明PKC引起的GAP-43在Ser41的磷酸化促進細胞的生長和出芽。另外,磷酸化的Ser41能被連接于膜上的非Ca2+依賴性磷酸激酶,可溶性Ca2+/鈣調(diào)素依賴性磷酸激酶和鈣調(diào)磷酸酶去磷酸化,GAP-43磷酸化和去磷酸化共同參與對GAP-43活性的調(diào)節(jié)。此外,磷脂代謝與膜受體介導的跨膜信號傳遞等過程有關,GAP-43的磷酸化和去磷酸化可能對這些過程有重要的調(diào)節(jié)作用。有學者認為,NGF可能促使GAP-43在生長錐中磷酸化,轉(zhuǎn)染人GAP-43cDNA的PC12細胞對NGF的敏感性增加10倍,突起再生作用顯著提高。GAP-43在信號傳遞中的作用。鈣調(diào)素和PKC均參與了第二信使過程,GAP-43在磷脂代謝和Ca2+信號傳遞中也起了重要的作用。在第二信使系統(tǒng)中,受體介導PIP2水解,產(chǎn)生DAG和IP3。DAG的主要作用是激活PKC,而IP3能誘發(fā)Ca2+由胞內(nèi)Ca2+自鈣儲池釋放,提高胞漿中游離Ca2+的濃度。磷酸GAP-43能抑制純化PIP-PIP2激酶的活性,從而抑制PIP2產(chǎn)生,成為PKC和Ca2+代謝的反饋抑制劑。另外,PKC可由非PIP2途徑激活,并使GAP-43磷酸化而抑制IP3依賴的Ca2+代謝,使胞內(nèi)Ca2+處于低濃度水平,這對Ca2+起第二信使作用至關重要。此外,G蛋白三聚體Go和Gi在生長錐膜濃聚,并受神經(jīng)遞質(zhì)、細胞-細胞連接和藥物的激活而影響生長錐的活性。體外實驗證明:GAP-43通過N末端的氨基酸作用于Go和Gi蛋白的α亞基而刺激GDP-GTP轉(zhuǎn)換。5病理組織學檢測GAP-43可促進神經(jīng)元的生長、發(fā)育、神經(jīng)再生及突觸重建。在生長錐,GAP-43可促進F-肌動蛋白的聚集,使生長錐在形態(tài)上更具活力,并抵抗其回縮。大多數(shù)學者認為,發(fā)育初期GAP-43分布于胞體,隨著突起的延長,其分布也趨向于突起,最后濃縮于生長錐,胞體內(nèi)GAP-43水平較低。當生長錐延長相互接觸時,GAP-43表達受到抑制,GAP-43的表達與軸突的生長變化一致;在胚胎時期,GAP-43的作用是促進神經(jīng)元的生長、發(fā)育和分化;在成年則能促進損傷神經(jīng)的再生及觸突重建。另外,在生長中的神經(jīng)軸突末端,特別是生長錐質(zhì)膜處,GAP-43分布極為豐富,可占質(zhì)膜總蛋白的1%,是含量最高的蛋白質(zhì)之一,并在生長錐內(nèi)一直保持高水平。運用反義寡核苷酸探針阻斷GAP-43的表達,或運用抗體抑制GAP-43,均可阻礙軸突生長。敲除GAP-43基因的小鼠,軸突定向生長出現(xiàn)障礙,而GAP-43過度表達則促進軸突迅速生長、分化,且GAP-43可迅速隨著神經(jīng)纖維與靶器官的聯(lián)系建立而逆轉(zhuǎn),即表達增加。單純用藥物阻斷軸漿流動也可以造成GAP-43表達增加,提示GAP-43的表達升高不單可由損傷引起,推測GAP-43的表達受某種逆行信號的調(diào)控,對完整的成熟神經(jīng)元逆行信號的作用是抑制其表達,而對發(fā)育中和受損的神經(jīng)元來說,另一種逆行信號可誘導其表達,顯然逆行信號的本質(zhì)、組織來源和作用方式都是不同的。前者的信號可能是由效應器產(chǎn)生,通過逆行軸漿流動至胞體,而后者是在發(fā)育中的軸突或損傷斷裂的軸突尚未與靶器官建立聯(lián)系前,由損傷局部產(chǎn)生或由胞體產(chǎn)生后又返回胞體的信號刺激GAP-43的表達。哺乳動物周圍神經(jīng)成熟神經(jīng)元的軸突受損后,軸突的延長和重建可被重新誘導,表現(xiàn)出與發(fā)育過程類似的反應,即軸突的再生與神經(jīng)的修復。起初GAP-43仍位于胞體,隨著細胞突起的延長而逐漸趨向外周,最后集中在生長錐。當神經(jīng)元突起相互接觸時,GAP-43的表達抑制;當周圍神經(jīng)受損后,神經(jīng)元蛋白合成的變化是軸突再生所必須的。軸突生長所需的蛋白必須由胞體運送至軸突,分為快速和慢速軸運蛋白,而快速轉(zhuǎn)運蛋白中有一種在神經(jīng)受損后,其含量呈直線增加,即GAP-43。壓榨大鼠坐骨神經(jīng)后24h即能測出標記的GAP-43,14d后GAP-43的水平比正常高60倍,114d恢復到正常水平,而GAP-43mRNA于傷后16h便開始升高,24h升高2.5倍,48h升高10倍,37d降至正常。相應的蛋白質(zhì)表達在受損后40h開始增加,6~20d達高峰,60d時仍維持在較高水平,以后逐步下降,10個月后恢復至正常水平。神經(jīng)損傷后,背根節(jié)中GAP-43與mRNA的變化不一致。從量上看,蛋白低,mRNA高;從持續(xù)時間看,蛋白持續(xù)時間長,mRNA持續(xù)時間短。前者是因mRNA存在于胞體,蛋白在胞體合成后很快被轉(zhuǎn)運到軸突所致;后者說明GAP-43mRNA的表達不僅受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),而且受蛋白質(zhì)半衰期因素的影響。