《細(xì)胞生物學(xué)》-細(xì)胞13章 細(xì)胞死亡與細(xì)胞衰老1

Chapter13

CellDeathandCellaging

蝌蚪發(fā)育過(guò)程中尾巴的退化涉及細(xì)胞的編程性死亡和細(xì)胞壞死過(guò)程正確錯(cuò)誤AB提交單選題10分細(xì)胞凋亡是（）細(xì)胞受到某些外界因素侵襲細(xì)胞內(nèi)含物外泄的過(guò)程細(xì)胞主動(dòng)發(fā)生自然死亡過(guò)程ABC提交單選題10分第一節(jié)、細(xì)胞死亡細(xì)胞死亡：生命現(xiàn)象不可逆的停止。Threewaysofanimalcelldeath:Apoptosis:細(xì)胞凋亡（希臘意思是droppingoff像花瓣或樹(shù)葉落下）；Necrosis:細(xì)胞壞死（希臘意思是makedeath使之死亡）；Autophagy:細(xì)胞自噬細(xì)胞死亡的鑒定：中性紅和臺(tái)盼藍(lán)染色（一）、細(xì)胞凋亡的概念及特征程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath,PCD)又稱細(xì)胞凋亡（apoptosis）。細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，是一個(gè)由基因決定的主動(dòng)結(jié)束生命的過(guò)程。1965年澳大利亞科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎鼠門(mén)靜脈后，電鏡觀察到肝實(shí)質(zhì)組織中有一些散在的死亡細(xì)胞這些的溶酶體并未被破壞，顯然不同于細(xì)胞壞死。這些細(xì)胞體積收縮、染色質(zhì)凝集從其周圍的組織中脫落并被吞噬,機(jī)體無(wú)炎癥反應(yīng)。一、細(xì)胞凋亡1972年Kerr等三位科學(xué)家首次提出了細(xì)胞凋亡的概念，宣告了對(duì)細(xì)胞凋亡的真正探索的開(kāi)始，在此之前，關(guān)于胚胎發(fā)育生物學(xué)、免疫系統(tǒng)的研究，肝細(xì)胞死亡的研究都為這一概念的提出奠定了基礎(chǔ)。

1986年，Horvitz研究線蟲(chóng)突變體，使細(xì)胞凋亡概念在基因水平上闡述。2002年獲諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。凋亡的形態(tài)特征a正常T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞b凋亡細(xì)胞(掃描電鏡)c凋亡細(xì)胞(透射電鏡)左，正常胸腺細(xì)胞；右，凋亡胸腺細(xì)胞

程序性死亡細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化（1）凋亡的起始：細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細(xì)胞間接觸的消失，但細(xì)胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布。（2）凋亡小體的形成（3）吞噬：凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞吞噬并消化細(xì)胞凋亡的生化特征（參考）（1）細(xì)胞凋亡的主要特征是形成大小為180～200bp特征性的DNAladders——發(fā)生核小體間斷裂。（2）凋亡細(xì)胞tTG（組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶tissueTransglutaminase）積累并達(dá)到較高水平。tTG催化細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)交聯(lián)，聚合，有助于保持凋亡小體的完整性，防止有害物質(zhì)滲漏。－tTG活性依賴于Ca2＋，生活細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度低，故其活性低；凋亡起始時(shí)，Ca2＋濃度上升，從而活性升高。－tTG催化細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)交聯(lián)，聚合，有助于保持凋亡小體的完整性，防止有害物質(zhì)滲漏。（二）、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)1.形態(tài)學(xué)觀測(cè)：⑴染色法:（staining）臺(tái)盼藍(lán)（trypanblue）:活細(xì)胞排斥，但可使死細(xì)胞著色；DAP1：是常用的一種與DNA結(jié)合的熒光染料，用DAP1染色借助熒光顯微鏡，可以觀察到細(xì)胞核的形態(tài)變化；姬姆薩（Giemsa）：可以使染色質(zhì)著色，便于在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到染色質(zhì)固縮、凋亡小體的形成等凋亡過(guò)程。（2）透射和掃描電鏡觀察：可觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化，如染色質(zhì)固縮、凋亡小體的形成、細(xì)胞發(fā)泡等現(xiàn)象。DAP1染色顯示凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)凝集A：正常細(xì)胞核B：凋亡細(xì)胞核細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對(duì)照7．Marker

2.DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶即凋亡細(xì)胞的DNA由于在核小體間發(fā)生斷裂，產(chǎn)生200bp及其整倍數(shù)的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)出的梯狀條帶3.TUNEL測(cè)定法：即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法針對(duì)DNA分子中斷裂缺口中的3’OH進(jìn)行原位標(biāo)記，凋亡細(xì)胞的核DNA中產(chǎn)生的3’OH末端，可幫助熒光素進(jìn)行原位標(biāo)記，并用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

左：正常16體節(jié)期的斑馬魚(yú)胚胎在發(fā)育過(guò)程中有少量細(xì)胞發(fā)生凋亡；右：突變體的中樞神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生大量凋亡4.彗星電泳法（cometassay）彗星電泳法的原理是將單個(gè)細(xì)胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解處理后，再進(jìn)行短時(shí)間的電泳，并用熒光染料染色。凋亡細(xì)胞中的DNA降解片段在電泳時(shí)遷移較快，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出一種彗星式圖案，而正常細(xì)胞核則保持圓球形。5.

流式細(xì)胞分析：根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細(xì)胞儀檢出凋亡的亞二倍體細(xì)胞，同時(shí)又能觀察細(xì)胞的周期狀態(tài)。6.檢測(cè)細(xì)胞膜成份變化：細(xì)胞凋亡早期，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻（AnnexinV標(biāo)記）至細(xì)胞膜外側(cè)細(xì)胞凋亡的重要特點(diǎn)是（）DNA隨機(jī)斷裂DNA發(fā)生核小體間的斷裂70S核糖體中的rRNA斷裂80S核糖體中的rRNA斷裂ABCD提交單選題10分（三）、細(xì)胞凋亡的生理意義（1）保證個(gè)體發(fā)育，塑造器官形態(tài)；

例如：健康成人的骨髓和腸組織中，每小時(shí)約有10億個(gè)細(xì)胞凋亡，但并不引起炎癥；發(fā)育過(guò)程中手和足的成形過(guò)程；蝌蚪尾的消失；脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。程序性細(xì)胞死亡在小鼠腳趾形成中的作用蝌蚪向蛙發(fā)育的變態(tài)反應(yīng)中程序性細(xì)胞死亡的作用程序性細(xì)胞死亡對(duì)發(fā)育中神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的調(diào)節(jié)動(dòng)物細(xì)胞數(shù)量控制的途徑（2）細(xì)胞凋亡參與免疫耐受的形成；免疫細(xì)胞為什么不攻擊我們自身呢？淋巴細(xì)胞的克隆選擇過(guò)程中，凡是不能區(qū)分“自我”與“異我”抗原的淋巴細(xì)胞均發(fā)生凋亡。舉例：自身免疫性淋巴增生綜合癥（Fas配體和Fas受體均發(fā)生突變）→使得增生的T淋巴細(xì)胞無(wú)法正常凋亡。舉例：AIDS患者表現(xiàn)為過(guò)多的淋巴、非淋巴細(xì)胞凋亡，免疫力低下（3）維持生物的自穩(wěn)態(tài)；動(dòng)物成體通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和增殖的速率來(lái)維持組織器官細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定以及成體細(xì)胞的自然更新。如果用藥物苯巴比妥處理，......？

（4）去除受損的或者病變的細(xì)胞當(dāng)DNA受損的時(shí)候或者細(xì)胞發(fā)生癌變的時(shí)候，包括細(xì)胞發(fā)生其他病變，這個(gè)時(shí)候腫瘤抑制基因P53表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而從機(jī)體清除。

因此，凋亡是機(jī)體預(yù)防癌癥發(fā)生的重要手段。凋亡不足，容易導(dǎo)致細(xì)胞癌變和自身免疫疾病凋亡過(guò)度，容易導(dǎo)致神經(jīng)退行性等疾病凋亡過(guò)程必須受到嚴(yán)格的調(diào)控（四）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子物理性因子：包括射線（紫外線，γ射線等）、較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等?；瘜W(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子、Ca2+載體、激素、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑、細(xì)胞毒素和腫瘤壞死因子α（TNFα）等。（五）、程序性細(xì)胞死亡的機(jī)理2002年10月7日英國(guó)人悉尼·布雷諾爾（SydneyBrenner）、美國(guó)人羅伯·霍維茨(RobertHorvitz)和英國(guó)人約翰·蘇爾斯頓(JohnESulston)，因在器官發(fā)育的遺傳調(diào)控和細(xì)胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）方面的研究獲諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。發(fā)現(xiàn)了程序性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵基因。秀麗隱桿線蟲(chóng)（秀麗新小桿線蟲(chóng)）參與細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的基因

細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控機(jī)制最先是從線蟲(chóng)（Ｃ.

elegas）研究開(kāi)始的。線蟲(chóng)是一種細(xì)胞定數(shù)細(xì)胞，在個(gè)體發(fā)育中，成體的1090個(gè)體細(xì)胞中，有131個(gè)注定是要自然凋亡。在線蟲(chóng)中已發(fā)現(xiàn)14個(gè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因。其中研究得比較深入的有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的ced-3和ced-4基因，以及抑制細(xì)胞凋亡的ced-9基因。雌雄同體的秀麗新小桿線蟲(chóng)秀麗新小桿線蟲(chóng)(秀麗隱桿線蟲(chóng))(CaenorbabditisElegans)：1090個(gè)細(xì)胞，其中131個(gè)細(xì)胞凋亡秀麗新小桿線蟲(chóng)中參與程序性細(xì)胞死亡控制的基因●決定死亡的2個(gè)基因(影響特異細(xì)胞類型PCD的基因)，即ces-1(ces表示CE細(xì)胞存活的調(diào)控基因)和ces-2基因，以及cgl-1和her-1。●執(zhí)行死亡的4個(gè)基因：ced-3、ced-4、ced-9?！?個(gè)與死亡細(xì)胞被吞噬細(xì)胞所吞噬的基因，即ced-1、ced-2、ced-5、ced-6、ced-7、ced-8和ced-10●死亡細(xì)胞在吞噬體中被降解的基因，核酸酶基因1，即nuc-1。保守性高，在哺乳動(dòng)物中有相應(yīng)同源物：Ced-3=ICE(caspase-1),Ced-4=Apaf-1,Ced-9=Bcl-2進(jìn)一步分析表明：●ced-3、ced-4、ced-9和egl1-4個(gè)基因構(gòu)成了線蟲(chóng)執(zhí)行死亡的“死亡機(jī)器”(deathmachinery);●ced-3和ced-4是細(xì)胞殺手;●ced-9可抵消ced-3和ced-4

的作用，防止細(xì)胞被殺死，因此是存活因子;●進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)真正的細(xì)胞殺手是ced-3而不是ced-4，ced-4是轉(zhuǎn)換器。程序性細(xì)胞死亡相關(guān)基因程序性細(xì)胞死亡遺傳學(xué)相關(guān)基因：ced-1～ced-9,nuc-1,ces-1,ces-2,egl-1;促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡基因：ces-2,ced-3,ced-4,P53,c-myc,Ela,ICE,TNF-α,APO-1/fas抑制程序性細(xì)胞死亡基因:egl-1.ces-1,ced-9,bcl-2,Elb,EBV-LMP-1,BHRF-1,crmA,A-20動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)酶解級(jí)聯(lián)系統(tǒng)對(duì)程序性細(xì)胞死亡的介導(dǎo)通過(guò)自殺性蛋白水解酶家族介導(dǎo)；該蛋白酶通過(guò)自我切割而激活；自殺性蛋白酶可激活蛋白家族中的其它成員，引起蛋白酶降解的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）◆自殺性蛋白水解酶是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteineasparticacidspecificprotease),簡(jiǎn)稱caspase。ICE基因：哺乳動(dòng)物中克隆出的與線蟲(chóng)細(xì)胞凋亡基因ced-3的同源基因，即白介素-1β轉(zhuǎn)換酶。后被命名為Caspase-1。。ICE是一個(gè)半胱氨酸蛋白酶。ICE基因定位于人類染色體11q23，其cDNA全長(zhǎng)1.35kb，編碼由404個(gè)氨基酸殘基組成的45kd蛋白。迄今已發(fā)現(xiàn)了11個(gè)同源基因，1996年后這些家族成員統(tǒng)稱為Caspase，它能選擇性地切割蛋白質(zhì)使其失活或激活。caspase家族成員基本功能Caspase1Caspase11不直接參與細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)(參與炎癥)Caspase4Caspase2Caspase8參與細(xì)胞凋亡的起始(起始者)Caspase9Caspase10Caspase3Caspase6參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行（效應(yīng)者）Caspase7二、細(xì)胞壞死細(xì)胞壞死與程序性細(xì)胞死亡兩者比較原因不同：壞死由物理、化學(xué)損害因子及缺氧與營(yíng)養(yǎng)不良引起，凋亡由基因控制。過(guò)程不同：壞死細(xì)胞腫脹，質(zhì)膜滲透性增高，細(xì)胞器變形，腫大，早期核無(wú)明顯形態(tài)學(xué)變化，而程序性細(xì)胞死亡不出現(xiàn)細(xì)胞膨脹，而是收縮并被割裂成膜性小泡后被吞噬。結(jié)果不同：壞死細(xì)胞釋放內(nèi)含物，引起炎癥反應(yīng)，程序性細(xì)胞死亡沒(méi)有完全破裂，不會(huì)引起炎癥反應(yīng)。壞死與程序性細(xì)胞死亡凋亡和壞死的對(duì)比ApoptosisNecrosisDeathbyapoptosisisaneat,orderlyprocess凋亡、壞死比較細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死能量ATP不依賴ATP細(xì)胞形態(tài)皺縮腫脹細(xì)胞膜完整破裂細(xì)胞器形態(tài)完整腫脹破裂細(xì)胞核染色質(zhì)凝集斷裂固縮，核膜破裂凋亡小體有無(wú)DNA規(guī)律斷裂，梯狀條帶隨機(jī)降解分子機(jī)制多基因參與，有序調(diào)控?zé)o基因調(diào)控蛋白質(zhì)合成有無(wú)代謝反應(yīng)蛋白酶逐次參與無(wú)秩序反應(yīng)周圍組織炎性反應(yīng)無(wú)有對(duì)機(jī)體的影響生長(zhǎng)發(fā)育代謝需要有損傷破壞作用三、細(xì)胞自噬形成自噬（?。w，然后與溶酶體融后被消化?？赡転榈蛲龅奶嫜a(bǔ)途徑發(fā)生條件：營(yíng)養(yǎng)危機(jī)，胚胎發(fā)育及變態(tài)過(guò)程（昆蟲(chóng)）。自噬相關(guān)基因：Atg（autophagy-relatd）基因,絲氨酸、蘇氨酸激酶。機(jī)制：激活磷酰肌醇激酶PI3K，再激活A(yù)KT/PKB，活化蛋白激酶mTor,抑制Atg激酶活性。細(xì)胞自噬的特征及其過(guò)程下列哪項(xiàng)不屬于細(xì)胞程序性死亡方式()動(dòng)物細(xì)胞的凋亡A自噬性細(xì)胞死亡B高溫使得生物大分子瞬間發(fā)生化學(xué)改變而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡C程序性壞死D提交單選題10分下列不能作為判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的依據(jù)是()瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA梯狀條帶(DNALadders)ADAPI染色觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài)變化和染色質(zhì)凝集B電鏡下觀察細(xì)胞表面形成的凋亡小體C電鏡觀察細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡,質(zhì)膜破損,細(xì)胞內(nèi)含物釋放到胞外D提交單選題10分由基因控制的程序性死亡僅存在于動(dòng)物,植物等多細(xì)胞生物,單細(xì)胞生物不存在程序性死亡()正確A錯(cuò)誤B提交單選題10分本章概要（一）細(xì)胞死亡往往受到細(xì)胞內(nèi)某種由遺傳機(jī)制決定的“死亡程序”控制，所以被稱為細(xì)胞程序性死亡。動(dòng)物細(xì)胞典型的程序性死亡方式包括凋亡與壞死。細(xì)胞凋亡對(duì)于生物體的正常發(fā)育、自穩(wěn)平衡及多種病理過(guò)程具有極其重要的意義。其最重要特征是凋亡過(guò)程中細(xì)胞膜保持完整，細(xì)胞內(nèi)含物沒(méi)有泄漏到細(xì)胞外，不引發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。這也是細(xì)胞凋亡與壞死的主要區(qū)別。細(xì)胞凋亡的另一個(gè)重要特征是染色質(zhì)DNA在核小體間發(fā)生斷裂，形成間隔200

bp的DNA片段。在動(dòng)物細(xì)胞的凋亡過(guò)程中