食品中4種肉類(lèi)的多重pcr鑒別方法的建立與優(yōu)化

食品中4種肉類(lèi)的多重pcr鑒別方法的建立與優(yōu)化

0復(fù)合pcr檢測(cè)其他種類(lèi)豬肉中的物種[研究意義]肉與鮮肉混合是中國(guó)食品質(zhì)量控制面臨的主要挑戰(zhàn)之一。不法企業(yè)在利益的驅(qū)使下使用相對(duì)廉價(jià)的豬肉、雞肉等肉類(lèi)原料,冒充牛肉、羊肉制品進(jìn)行銷(xiāo)售,嚴(yán)重侵犯了消費(fèi)者的合法權(quán)益。然而,傳統(tǒng)的依靠感官與經(jīng)驗(yàn)的肉類(lèi)形態(tài)學(xué)鑒別手段已遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足對(duì)肉制品摻假現(xiàn)象進(jìn)行控制與監(jiān)管的需要。因此,對(duì)于中國(guó)肉制品市場(chǎng)占有率較高的豬肉、牛肉、羊肉和雞肉,建立科學(xué)、準(zhǔn)確、快速、高通量的篩選方法已十分必要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的技術(shù)已逐步成為了肉類(lèi)種屬鑒定的核心方法。許多學(xué)者根據(jù)不同物種基因序列的差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物,利用PCR反應(yīng)實(shí)現(xiàn)食品中特征基因片段的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增,繼而通過(guò)電泳檢測(cè)鑒別食品中可能的物種來(lái)源。近年來(lái),實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的飛速發(fā)展大大提高了食品中物種鑒別的效率和靈敏度,并使得肉類(lèi)含量的定量溯源成為可能。在目標(biāo)基因選擇方面,動(dòng)物線(xiàn)粒體基因組DNA序列具有高度的物種特異性,且由于拷貝數(shù)多而在食品加工過(guò)程未完全降解,因此其多態(tài)性位點(diǎn)是設(shè)計(jì)肉類(lèi)成分定性檢測(cè)的首選靶點(diǎn)。目前,根據(jù)線(xiàn)粒體基因組DNA序列差異設(shè)計(jì)物種特異性引物,所建立的PCR與實(shí)時(shí)熒光PCR方法已有大量報(bào)道,且進(jìn)入了中國(guó)權(quán)威的檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。Girish等基于線(xiàn)粒體12SrRNA基因,應(yīng)用PCR-RFLP成功鑒定了牛肉、水牛肉、綿羊肉及山羊肉。Dooley等基于線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b基因,分別建立了牛肉、豬肉、羊肉、雞肉和火雞肉的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。方法設(shè)計(jì)方面,在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物的多重PCR技術(shù)應(yīng)用于食品中動(dòng)物源性成分的鑒別,可提高檢測(cè)效率與檢測(cè)通量。Ghovvati等基于線(xiàn)粒體12SrRNA和16SrRNA基因應(yīng)用多重PCR技術(shù)對(duì)反芻動(dòng)物、家禽和豬進(jìn)行鑒。Soares等應(yīng)用雙重PCR在豬肉中成功檢測(cè)到禽肉。Fajardo等采用多重PCR技術(shù)成功鑒定出了3種鹿的亞種。在中國(guó),陳文炳等應(yīng)用單重PCR和雙重PCR能分別對(duì)食品中豬肉、牛肉、羊肉、雞肉等肉類(lèi)成分進(jìn)行鑒定?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在實(shí)際檢測(cè)中,尤其在需要對(duì)大量的食品樣本進(jìn)行肉類(lèi)摻假的篩選時(shí),提高檢測(cè)效率與通量對(duì)于及時(shí)監(jiān)管十分重要。以多重PCR為基礎(chǔ),建立多種肉類(lèi)成分同時(shí)鑒別的快速檢測(cè)技術(shù)是提高效率的有效途徑之一。然而目前,針對(duì)中國(guó)肉類(lèi)摻假現(xiàn)狀,應(yīng)用多重PCR的肉類(lèi)快速鑒別與篩選技術(shù)尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究根據(jù)動(dòng)物線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b基因的差異性位點(diǎn),利用正向引物共用、反向引物特異的策略,建立用于豬肉、牛肉、羊肉、雞肉4種肉類(lèi)DNA快速檢測(cè)的UP-M-PCR體系。1材料和方法試驗(yàn)于2010年12月—2011年4月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。1.1試驗(yàn)材料生(熟)豬肉、生(熟)牛肉、生(熟)羊肉、生(熟)雞肉、生馬肉、生驢肉、鯽魚(yú)、大豆粉等均購(gòu)于南京市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。1.2細(xì)胞、動(dòng)物組織和生化試劑PCR儀(Veritee96-well,美國(guó)ABI公司);核酸電泳儀(SUB-cellGT,美國(guó)Bio-Rad公司);凝膠成像系統(tǒng)(UniversalHoodⅡ,美國(guó)Bio-Rad公司);高速冷凍離心機(jī)(3-18K,美國(guó)Sigma公司)。血液、細(xì)胞和動(dòng)物組織的基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司;ExTaqDNA聚合酶及反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl2、DNA分子量MarkerDL1000、電泳上樣緩沖液等PCR生化反應(yīng)試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;電泳級(jí)瓊脂糖購(gòu)自南京生興生物公司;引物合成、DNA測(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。1.3測(cè)試方法1.3.1dna的提取分別使用DNeasy組織細(xì)胞DNA提取試劑盒、SDS-蛋白酶K法及CTAB-蛋白酶K法提取生鮮的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉中的總DNA。其中,DNeasyDNA提取試劑盒法按說(shuō)明書(shū)操作;SDS-蛋白酶K法參照《分子克隆》第三版;CTAB-蛋白酶K法則參照Dooley等的方法。SDS-蛋白酶K法與CTAB法均使用氛/氯仿抽提進(jìn)行核酸純化。50mg樣品的總DNA均溶解于100μLTE緩沖液中,于OD260/280測(cè)定吸光度值,計(jì)算DNA濃度和純度。1.3.2pcr引物設(shè)計(jì)引物的設(shè)計(jì)與特異性位點(diǎn)的選擇依照Matsunaga等的方法并作適當(dāng)修改。根據(jù)豬(GenBank登錄號(hào):GU135833.1)、牛(GenBank登錄號(hào):HQ184045.1)、山羊(GenBank登錄號(hào):AB044308.1)、綿羊(GenBank登錄號(hào):HM236185.1)、雞(GenBank登錄號(hào):GU261717.1)線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b基因序列,采用正向引物共用、反向引物特異的策略,設(shè)計(jì)兩套各5條多重PCR引物,第一套引物長(zhǎng)27—28bp,第二套引物長(zhǎng)18—20bp,兩套引物使用相同的種屬特異性位點(diǎn),即第二套引物由第一套引物截短而得到。兩套引物在線(xiàn)粒體基因組中的結(jié)合位置見(jiàn)圖1,引物序列、Tm值與擴(kuò)增片段大小見(jiàn)表1。1.3.4檢測(cè)特異性驗(yàn)證按照1.3.3的反應(yīng)體系及優(yōu)化的反應(yīng)條件,分別使用4種目標(biāo)肉類(lèi)DNA及其兩兩等比例混合物、魚(yú)肉、馬肉、驢肉和大豆來(lái)源的DNA對(duì)兩套引物的檢測(cè)特異性進(jìn)行驗(yàn)證與比較。1.3.5多重pcr方法的靈敏度將100ng·μL-1的4種目標(biāo)肉類(lèi)DNA10倍梯度稀釋,使用1.3.3的反應(yīng)體系及優(yōu)化的反應(yīng)條件,分別針對(duì)豬肉、牛肉、羊肉和雞肉4種肉類(lèi)考察多重PCR方法的靈敏度。1.3.6t載體組合分離主導(dǎo)型高效聚合酶鏈反應(yīng)物的合成使用優(yōu)化的多重PCR方法對(duì)豬肉、牛肉、羊肉和雞肉4種目標(biāo)肉類(lèi)DNA進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物電泳后割膠回收純化,參照《分子克隆》第三版對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行T載體連接、轉(zhuǎn)化、克隆篩選及鑒定,并委托測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank上的已知序列進(jìn)行比對(duì)。1.3.7用于市場(chǎng)領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)際檢驗(yàn)使用優(yōu)化的多重PCR方法對(duì)市售的80份各類(lèi)肉制品進(jìn)行的鑒定,驗(yàn)證方法的實(shí)用價(jià)值,并了解市場(chǎng)上肉類(lèi)摻假的真實(shí)狀況。2結(jié)果2.1不同方法對(duì)鮮食中dna提取效果的影響分別使用DNeasy試劑盒、經(jīng)典的SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法提取豬肉、牛肉、羊肉和雞肉4種肉類(lèi)的總DNA。表2列出了應(yīng)用3種方法對(duì)生鮮肉提取的結(jié)果。SDS-蛋白酶K法與DNeasy試劑盒法所提取的DNA濃度處于同一個(gè)數(shù)量級(jí),SDS-蛋白酶K法在濃度與純度方面均略?xún)?yōu)。CTAB-蛋白酶K法由于對(duì)肌肉組織消化效果較差,因此DNA提取效率顯著偏低。相比于SDS-蛋白酶K法,DNeasy試劑盒大大節(jié)省了提取時(shí)間,且無(wú)需使用苯酚、氯仿等有毒試劑,綜合考慮提取效率及試驗(yàn)安全性,后續(xù)試驗(yàn)中均采用DNeasy試劑盒提取食品中的總DNA。2.2確定豬肉和豬肉的最佳配比通過(guò)梯度PCR試驗(yàn),綜合反應(yīng)特異性與產(chǎn)物量,確定使用兩套引物的最佳退火溫度均為52℃。分別使用4種目標(biāo)肉類(lèi)DNA及其兩兩混合物、魚(yú)肉、馬肉、驢肉、大豆來(lái)源的DNA為模板,對(duì)兩套引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證及比較(圖2)。由圖2可見(jiàn),使用兩套引物針對(duì)4種目標(biāo)肉類(lèi)DNA進(jìn)行檢測(cè),均在設(shè)計(jì)位置能觀(guān)察到特異性條帶,未見(jiàn)明顯非特異性擴(kuò)增,且與魚(yú)肉、馬肉、驢肉和大豆DNA均無(wú)交叉反應(yīng)。然而,第二套引物在檢測(cè)目標(biāo)肉類(lèi)兩兩混合的DNA時(shí),當(dāng)牛肉DNA與羊肉或豬肉DNA中的一種混合,牛肉成分均未被檢出。這可能是由于第二套引物過(guò)短,與不同模板正確配對(duì)的堿基比例相差較大,在多重PCR體系中優(yōu)先與羊肉或豬肉DNA結(jié)合,從而影響了檢測(cè)的特異性與穩(wěn)定性。對(duì)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制取的4種肉類(lèi)的熟制品進(jìn)行檢測(cè),特異性試驗(yàn)結(jié)果相同。同時(shí),檢測(cè)人為制成的生鮮肉兩兩混合物提取的DNA,與DNA兩兩混合物PCR的結(jié)果相同。因此,在后續(xù)試驗(yàn)中,將僅使用第一套引物進(jìn)行引物靈敏度試驗(yàn)和樣本的實(shí)際鑒定。2.3pcr法測(cè)靈敏度將100ng·μL-1豬肉、牛肉、羊肉和雞肉來(lái)源的DNA模板原液進(jìn)行10倍梯度稀釋,使用第一套引物對(duì)之進(jìn)行檢測(cè)以考察方法的靈敏度(圖3)。由圖3可見(jiàn),目標(biāo)DNA稀釋103倍后,使用多重PCR法進(jìn)行檢測(cè),均仍可觀(guān)察到微弱的特異性擴(kuò)增。因此,檢測(cè)的靈敏度可達(dá)皮克級(jí)。對(duì)于4種目標(biāo)肉類(lèi)DNA兩兩混合物模板的檢測(cè)及熟制品檢測(cè),靈敏度試驗(yàn)結(jié)果相同。2.4同源性的確定將2.2中4種目標(biāo)肉類(lèi)的特異性條帶回收純化,純化產(chǎn)物連接入T載體并委托測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示,豬的測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表序列(GenBank登錄號(hào)分別為GU135833.1、GU135832.1、GU135798.1)、牛的測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表序列(GenBank登錄號(hào)分別為HQ184045.1、HQ184038.1、HQ184037.1)、山羊的測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表序列(GenBank登錄號(hào)分別為AB044308.1、AB004073.1、AB004069.1)、綿羊的測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表序列(GenBank登錄號(hào)分別為HM236185.1、HM236184.1、HM236177.1)、雞的測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表序列(GenBank登錄號(hào)分別為GU261717.1、GU261715.1、GU261714.1)的同源性均在99%以上,與預(yù)期基本一致,確定分別為豬肉、牛肉、羊肉和雞肉成分。2.5樣本的分類(lèi)和檢測(cè)結(jié)果使用上述多重PCR方法對(duì)市售的80份食品樣本進(jìn)行了4種肉類(lèi)的鑒定。樣本的分類(lèi)與檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,肉類(lèi)摻假普遍存在于調(diào)理生肉制品、醬鹵肉、干制品和火腿制品等各類(lèi)食品中,摻假率達(dá)16.3%。3pcr檢測(cè)其他種類(lèi)豬肉的最佳條件在動(dòng)物源性成分鑒定中,多重PCR技術(shù)是較為常用的鑒定方法之一。本試驗(yàn)在參考前人研究的基礎(chǔ)上,基于物種間線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b基因的序列差異,建立了4種常見(jiàn)肉類(lèi)成分快速檢測(cè)的通用引物多重PCR方法。多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對(duì)以上引物,同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)。以多重PCR為基礎(chǔ)的肉類(lèi)成分鑒別技術(shù)具有檢測(cè)通量高、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便且檢測(cè)費(fèi)用節(jié)省的優(yōu)點(diǎn),但由于其需要在同一PCR體系里加入多對(duì)特異性引物,復(fù)雜的PCR體系易造成方法靈敏度降低以及對(duì)不同目標(biāo)序列擴(kuò)增效率不一致,從而使得相關(guān)方法的推廣與標(biāo)準(zhǔn)化受到限制。本研究采用了正向引物通用、反向引物特異的UP-M-PCR設(shè)計(jì)策略,即應(yīng)用包含5條引物的多重PCR體系實(shí)現(xiàn)4個(gè)物種的鑒別,最大限度地避免引物數(shù)量過(guò)多造成的交叉干擾。目前,通用引物多重PCR方法對(duì)食品中大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門(mén)氏菌及水中脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇B組病毒和?？刹《镜饶c道病毒的檢測(cè)已有報(bào)道,用于肉類(lèi)品種鑒定在中國(guó)尚屬首次。相比于Soares等鑒別動(dòng)物源性成分的單重與雙重PCR技術(shù),本研究應(yīng)用5條引物同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)4種肉類(lèi)成分的鑒別,大大提高了檢測(cè)效率和檢測(cè)通量。與Ghovvati等應(yīng)用多重PCR對(duì)反芻動(dòng)物、家禽和豬進(jìn)行鑒定相比,本研究主要針對(duì)中國(guó)肉類(lèi)摻假現(xiàn)狀進(jìn)行試驗(yàn)研究,具有較顯著的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值;相比于中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)SNT/2051-2008中應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR對(duì)食品、化妝品和飼料中牛、羊、豬源性成分進(jìn)行鑒別,本研究具有檢測(cè)儀器簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本節(jié)省、檢測(cè)通量較高等優(yōu)點(diǎn),更適合于對(duì)大量肉制品摻假的鑒別篩選。影響多重PCR反應(yīng)效果的因素很多,其中引物設(shè)計(jì)直接影響PCR擴(kuò)增的特異性與靈敏度;另外,PCR體系的優(yōu)化可以使多重PCR得到最佳效果。一般認(rèn)為,在一定范圍內(nèi),引物序列越長(zhǎng),PCR反應(yīng)的特異性越高、靈敏度越低。因此,在方法設(shè)計(jì)中,選擇合適長(zhǎng)度的多重PCR引物序列,從而獲得最優(yōu)化的檢測(cè)靈敏度、特異性及各目標(biāo)片段擴(kuò)增均一性將尤為關(guān)鍵。對(duì)此,本研究基于相同的特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)了長(zhǎng)度不同的兩套引物,試驗(yàn)結(jié)果顯示,使用長(zhǎng)度為27—28bp的第一套引物時(shí),在優(yōu)化的反應(yīng)條件下,對(duì)4種目標(biāo)肉類(lèi)DNA及其兩兩混合物的檢測(cè)表現(xiàn)出良好的特異性與靈敏度,靈敏度達(dá)到皮克級(jí)。當(dāng)把引物片段長(zhǎng)度降低到18—20bp時(shí),對(duì)目標(biāo)肉類(lèi)混合物的檢測(cè)表現(xiàn)出擴(kuò)增效率的差異,牛肉成分難以被檢出。在本研究所使用的肉中總DNA提取方法中,Qiagen公司的DNeasyDNA提取試劑盒是當(dāng)前組織細(xì)胞DNA提取最受肯定的商品化技術(shù)之一,而SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法均是組織中總DNA提取的經(jīng)典方法。CTAB-蛋白酶K法由于CTAB難以完全裂解肌肉組織而導(dǎo)致DNA提取效率顯著偏低;DNeasy試劑盒法與SDS-蛋白酶K法均采用含SDS的緩沖液裂,均可有效地裂解肌肉細(xì)胞,但DNeasy試劑盒法中純化柱對(duì)核酸的回收率低于酚/氯仿抽提,考慮到提取效率與安全性,本研究?jī)?yōu)先采用DNeasy試劑盒提取肉制品中的總DNA?？紤]到肉制品摻假的實(shí)際往往是使用一種廉價(jià)肉類(lèi)代替或摻入另一種價(jià)格相對(duì)較高的肉類(lèi),因此在同一多重PCR反應(yīng)體系中針對(duì)多種肉類(lèi)同時(shí)鑒定方面,本研究重點(diǎn)考察了目標(biāo)肉類(lèi)兩兩混合時(shí)的檢測(cè)特異性。進(jìn)一步的試驗(yàn)表明,本文建立的多重PCR技術(shù)對(duì)于同時(shí)鑒定目標(biāo)肉類(lèi)中的3或4種也具備良好的效果。同時(shí),鑒于山羊肉與綿羊肉的價(jià)格區(qū)別不大,市場(chǎng)上此類(lèi)摻假較少,本研究使用了山羊與綿羊的通用引物作為羊肉鑒定的特異性引物。4定量pcr檢測(cè)成本建立了靈敏、可靠的4種肉類(lèi)成分快速鑒定的多重PCR方法,相比于現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中的單重PCR技術(shù)提高了篩選通