石斛真?zhèn)螁栴}的辨治

石斛真?zhèn)螁栴}的辨治

石斛是中國古文獻中最早記載的蘭花科植物之一。據《神農本草經》記載，它是與蘭花、胡蘿卜和甘草一起被列為優(yōu)質中醫(yī)藥。其具有滋陰清熱、生津益胃和潤肺止咳的功效。研究表明,我國的石斛有近80種,其中33種在全國或局部地區(qū)作為藥用。雖然石斛的生藥學研究已有很多報道,但是由于其形態(tài)學和組織學特征具有較大的相似性,給鑒別評價工作帶來很大的難度。此外,石斛市場需求量的日益增加,多年來無節(jié)制的濫采濫挖,使鐵皮石斛的野生資源遭到毀滅性破壞;加上在自然條件下種子萌發(fā)率低、生長緩慢,導致市場上的鐵皮石斛缺口較大,產品質量良莠不齊,偽品較多。因此,石斛真?zhèn)舞b別及品種鑒別的研究日益受到重視,建立有效的鐵皮石斛鑒別體系勢在必行。筆者對石斛藥材的傳統(tǒng)形態(tài)及顯微鑒別、成分分析和分子鑒別方法進行了綜述,介紹各種方法的研究現狀,并對其優(yōu)缺點進行比較,以期為當前石斛及中草藥的分類鑒別工作提供依據。1石斛的形態(tài)結構性狀鑒別是傳統(tǒng)的中草藥鑒別方法。一些藥典和專著對石斛的形態(tài)特征作了詳細的描述,對石斛品種的鑒別、野生資源的正確利用、石斛市場的規(guī)范、以及貴稀品種的保護和人工繁殖起到規(guī)范作用。幾種常見石斛的鑒別特征見表1。由于石斛種屬間的形態(tài)特征差異很小,難以把握,所以在鑒別工作中引入了顯微鏡檢技術,借助顯微鏡對導管、篩管、內含物等組織結構進行分析鑒別。解愛華從外形及顯微鏡檢角度,對鐵皮石斛、環(huán)草石斛、黃草石斛、金釵石斛和馬鞭石斛等5種不同的石斛進行了鑒別。丁小余等通過對莖段的顯微解剖,分析比較了廣西、貴州和云南等地的鐵皮石斛居群形態(tài)結構差異,將其分為F型和H型,并對性狀特點進行了比較,對鐵皮石斛的采收、加工以及大面積人工繁殖具有重要的指導意義。此外,研究者還利用顯微鏡檢技術對石斛的孢粉結構、種子形態(tài)及細胞特點進行分類鑒別。2似性鑒別,不能控制石斛質量雖然性狀鑒別簡單易行,但市場上的石斛品種繁多,而且形態(tài)學和組織學特征具有很高的相似性,單靠性狀鑒別往往不能實現對石斛質量的全面控制。在這種形勢下,出現了在成分分析基礎上建立的指紋圖譜鑒別方法,一定程度上彌補了性狀鑒別的缺陷,常用的有高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜、氣相色譜(GC)指紋圖譜和核磁共振波譜(NMR)法等。2.1rp-hplc法殷放宙等采用梯度洗脫的方法,以Kromasil?KR100-5C18(250mm×4.6mm,5μm)為分析用色譜柱,以乙腈-濃度0.4%磷酸溶液為流動相,建立了鐵皮石斛的RP-HPLC指紋圖譜,并進行了相似度的計算,該方法可使鐵皮石斛中各成分得到較好的分離。毛幼兒等通過乙醇脫脂,沸水浸提鐵皮石斛多糖,然后以鹽酸將其水解為單糖,再加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)將其衍生化,最后采用RP-HPLC法測定多糖的甘露醇含量,建立一種通過HPLC測定甘露醇來鑒別鐵皮石斛質量的新技術。高效液相色譜法具有分離效能高、高靈敏度、重現性好及樣品易回收等優(yōu)點,而且還能提供大量的化學成分信息;缺點是有“柱外效應”,即在從樣品到檢測器(除柱子以外)之間,流動相流型的變化會顯著降低柱效。2.2研究的基本結果氣相色譜技術在石油化工、醫(yī)藥衛(wèi)生等許多領域都有廣泛用途,在中藥指紋圖譜中也有很好的應用。黃小燕等采用氣相色譜法,以FID為檢測器、OV1701石英毛細管柱、石斛堿為對照品,建立金釵石斛藥材的指紋圖譜。試驗結果表明,精密度、穩(wěn)定性、重復性均符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》要求,可以作為金釵石斛內在質量控制的標準。另外,有研究者利用裂解氣相色譜/質譜法(Py-GC/MS)對10種不同產地的鐵皮石斛進行測定,并結合系統(tǒng)聚類法對其指紋圖譜進行分析,能很好的反映鐵皮石斛的相似關系及地區(qū)差異性,適用于鐵皮石斛產地和真?zhèn)蔚膮^(qū)別分析。氣相色譜法因為是以用氣體作為流動相,樣品在氣相中傳遞速度快,各組分在流動相和固定相之間可以瞬間地達到平衡;固定相可選擇的物質很多,是一種高效快速分離分析方法,近年來高靈敏選擇性檢測器的應用,使其又具有靈敏度高、應用范圍廣等優(yōu)點。2.3環(huán)草石斛的分離與鑒定目前,核磁共振波譜的研究主要集中在1H(氫譜1H-NMR)和13C(碳譜13C-NMR)兩類原子核的波譜,國內外學者提出用核磁共振波譜法鑒別中藥材真?zhèn)?。秦海林等應用硅膠柱色譜法分離環(huán)草石斛的化學成分,鑒別單體化合物的結構并對其1H-NMR指紋圖譜進行解析,從而實現環(huán)草石斛種屬鑒別的目的。張朝鳳等采用溶劑萃取法或硅膠色譜分離法獲得3種石斛的特征提取物及其主要成分,然后測得1H-NMR特征圖譜并對特征信號進行歸屬,證明特征提取物的1H-NMR特征圖譜可作為其基源鑒別的相對標準圖譜,對石斛的鑒別工作具有重要的指導意義。核磁共振波譜法具有高效、準確的特點,但是需要專門的設備,投入較大,對操作人員技術要求較高。2.4石斛類藥材的紅外光譜中草藥成分復雜多樣,IR圖譜展現的是各成分吸收光譜的疊加,因為不同中草藥所含成分及含量不同,所以出峰時間、峰形等就存在差異,利用這種差異就能夠實現中草藥的鑒別。沈宗根等利用紅外光譜測定3種石斛和常用偽品細葉石仙桃的紅外光譜,并其親緣關系進行分析,發(fā)現細葉石仙桃與石斛的紅外光譜存在較大差異,親緣關系較遠,而石斛屬組內種間紅外光譜圖的差異則較小。呂獻康等對11種石斛進行IR特征進行分析,發(fā)現其IR特征基本相似,但廣東石斛和滇貴石斛與其他石斛的主成分存在較大差異。張氏等根據物質在一定波長下的吸收系數是常數為依據,對32個石斛樣品的每一波長通道的信息量進行計算,其結果與植物形態(tài)分類鑒定結果基本一致。陳康等對金釵石斛、環(huán)草石斛等5種石斛類藥材的二階導數光譜進行分析。試驗結果顯示,5種石斛類藥材的紫外光譜圖形比較相似,經數學處理后得到了較多的信息特征,除金釵石斛與環(huán)草石斛二階導數光譜圖極相似外,其余均有明顯的差別。說明紫外光譜法對石斛及其混淆品的鑒別有一定的應用價值。光譜鑒別分析法具有樣品需要量少、快速、高效和整體性等特點,應用范圍已從中藥植物擴展到中藥材、中成藥和中藥飲片的快速鑒定;缺點是設備投入大、費用高。3在生物樣品中的應用藥用植物傳統(tǒng)的鑒別方法為性狀鑒別,后來又發(fā)展出成分指紋圖譜分析,傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒別方法難以把握,成分指紋圖譜分析又受到諸多因素的干擾,具有很大的局限性。分子生物學的發(fā)展將藥用植物的鑒別提高到分子水平。1994年香港中文大學Cheung首次將AP-PCR方法引入西洋參、人參的鑒別研究。分子鑒別通過對保守序列的測定及同源性比對確定分類學地位,達到鑒別的目的,如ITSrDNA序列分析、DNA(RAPD)及DNA雜交技術等。3.1分子序列分析ITS序列屬于內轉錄間隔區(qū),位于核糖體rDNA的18S、5.8S以及28S之間,保守性低,進化速率高,可以鑒別到亞種,已廣泛應用于物種的分子系統(tǒng)學研究及中草藥的分類鑒別。迄今為止,蘭科已有50多個屬的ITS序列進行了分子系統(tǒng)學研究,并有研究者對一些種類的石斛進行了鑒定及系統(tǒng)進化分析。丁小余等在石斛的鑒別過程中,建立了21種楓斗類石斛的ITSrDNA全序列數據庫,運用Clustral、Mega等軟件以及該數據庫對石斛rDNA的ITS區(qū)進行序列分析,成功的實現了待檢種的鑒別。ZhangYB等將16個不同種屬石斛的ITS1-5.8S-ITS2序列固定于玻片上制作了基因芯片,用熒光標記的ITS2序列作為探針,可檢測《藥典》所載的5種石斛及中藥復方中的石斛組分。ITSrDNA序列分析是目前真核生物物種鑒定最常用的方法,具有操作簡單,快速準確、花費較少等特點,可以鑒定到亞種。3.2rapd技術RAPD是研究植物遺傳多樣性及分子鑒別的有效手段,現已廣泛應用于生物品種鑒別、系譜分析及進化關系研究。張銘等在對26種石斛進行RAPD聚類分析的基礎上,分析了鐵皮石斛某些特異性DNA片段,設計出只與基因組某一區(qū)域特異性結合的專一引物,此外復性溫度的提高,一定程度上消除外源DNA造成的干擾,大大提高了鑒別的準確度,有望成為高效準確鑒別鐵皮石斛的新方法。丁鴿等在對鐵皮石斛野生居群遺傳多樣性的RAPD分析中發(fā)現,居群間具有較豐富的遺傳多樣性;RAPD可以作為其野生居群遺傳多態(tài)性、居群親緣關系研究和分子鑒別的有效手段。RAPD技術應用廣泛,滲透于基因組研究的各個方面,該技術無需專門設計引物和預先知道基因組核苷酸序列;每個反應僅需單條引物,擴增無特異性;退火溫度低,引物與模板結合穩(wěn)定,有較強的糾錯功能;簡便快捷;所需DNA樣品量極少。3.3選擇石斛的鑒定法該方法由Diatchenko等創(chuàng)立,是一種基于PCR的差異基因表達篩選方法,最初應用于差異cDNA文庫的建立。李同祥利用該法進行石斛鑒別DNA探針的篩選,在獲得2種石斛間差減片段后,用石斛總DNA與選取的差減片段克隆雜交,進而篩選出只與同種石斛DNA雜交的克隆,作為其特異性DNA探針,實現對石斛的高效準確鑒別。該法是對整個基因組進行篩選,可得到長堿基序列探針,快速、靈敏、準確;缺點是過程比較復雜,不能同時進行數個材料的相互比較,樣品要求高。3.4dna條碼及鑒別意大利動物學家PaulHebert首先提出DNA條形碼的概念,并將其運用于脊椎動物和無脊椎動物的分類研究中。根據生物條形碼聯盟的建議,植物基因條形碼目前主要在葉綠體DNA中尋找,包括matK、ITS、rpoC1、rpoB、accD、rbcL及各基因的組合等,石斛分類鑒別中DNA條形碼的研究也逐漸成為熱點。此外,還有建立在基因組DNA微衛(wèi)星重復序列檢測基礎上的ISSR-PCR法。研究發(fā)現,石斛微衛(wèi)星重復序列多樣性及多態(tài)性較高,為石斛遺傳多樣性及親緣關系的研究提供了有利條件。4新鑒別方法的應用石斛最早是通過外觀形態(tài)特征進行鑒別,經驗因素起主要作用;顯微技術發(fā)展起來后,組織結構的顯微鑒別與傳統(tǒng)的性狀鑒別結合,對石斛的鑒別工作起到很大推動作用;而后起的分子鑒別具有傳統(tǒng)方法無法比擬的高效性及準確性,將鑒別技術提升到一個新臺階。隨著生物技術的不斷發(fā)展,必將有更好的鑒別方法推出,如有的研究者開拓思路,采用薄層色譜法,考察不同基源石斛及商品藥材中專屬性成分聯芐類化合物的薄層色譜行為,為石斛的鑒別提供了一種準確、有效的新方法。不斷涌現的新鑒別方法,對石斛有效成分和藥理作用的深入研究,質量控制標準體系的建立,以及石斛市場的規(guī)范化都起到極大的推動作用。不同的鑒別方法側重點不同,有各自的優(yōu)缺點,如性狀鑒別簡單快速,不需要特殊儀器,但是需要豐富的經驗,普通人較難把握;成分分析鑒別相對客觀,能同時了解其功效成分,但是設備昂貴,技術要求較高;分子鑒別高效、準確