基于多維氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的食用油中碳脂肪酸的檢測(cè)

基于多維氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的食用油中碳脂肪酸的檢測(cè)

正常柴油（ico），通常稱為地溝油。它是一個(gè)泛指概念,是對(duì)各類劣質(zhì)油的統(tǒng)稱,一般包括潲水油、煎炸廢油、食品及相關(guān)企業(yè)產(chǎn)生的廢棄油脂等。它主要包括三類:(1)餐廚垃圾提煉油;(2)各類肉及肉制品加工廢棄物等非食品原料提煉油;(3)廢棄油脂。這些地溝油經(jīng)過(guò)脫色、水洗、除臭等過(guò)程后,與食用油無(wú)明顯感官差異。不法商販將其摻雜到食用油中,使得地溝油類產(chǎn)品源源不斷地流入市場(chǎng),從而獲取巨額的利潤(rùn)。然而,在煉制地溝油的過(guò)程中,動(dòng)植物油經(jīng)污染后發(fā)生酸敗、氧化和分解等一系列化學(xué)變化,產(chǎn)生對(duì)人體有嚴(yán)重毒性的物質(zhì)。所以食用地溝油會(huì)帶來(lái)許多潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。例如消化不良、腹瀉,甚至引發(fā)各種癌癥。因此,加大執(zhí)法、監(jiān)管力度,進(jìn)一步規(guī)范食用油市場(chǎng)勢(shì)在必行。有效的監(jiān)管必然要求特異性、準(zhǔn)確率高的地溝油鑒定方法。因此,開(kāi)發(fā)一種用于甄別非正常食用油的方法,是我國(guó)現(xiàn)階段迫切需要解決的問(wèn)題?，F(xiàn)行的地溝油鑒別方法涉及了多種理化指標(biāo),如比重、折光率、皂化值、酸值、脂肪酸相對(duì)不飽和度、膽固醇、電導(dǎo)率、特定基因、多環(huán)芳烴。除此之外,有報(bào)道稱揮發(fā)性組分,如醛、酮、酸、酯、碳?xì)浠衔?、二烯和酰基參?shù)、脂肪酸等亦可以作為鑒定地溝油的指標(biāo)。而且,其中一些指標(biāo)分別從內(nèi)、外源成分差異出發(fā),對(duì)地溝油樣品進(jìn)行了綜合性鑒定,陽(yáng)性樣品的正確率較高。然而,這些指標(biāo)存在如下問(wèn)題:(1)有些地溝油的常規(guī)理化指標(biāo)與正常食用油無(wú)明顯差別;(2)有些指標(biāo)在正常油脂的存放過(guò)程中也會(huì)自然氧化產(chǎn)生,干擾鑒定結(jié)果;(3)有些揮發(fā)性組分以及氧化、聚合產(chǎn)物等在地溝油加工過(guò)程中容易被去除,導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果無(wú)差異性;(4)內(nèi)、外源性指示物未確定明確、有效的指標(biāo),鑒定過(guò)程和鑒定指標(biāo)復(fù)雜。簡(jiǎn)言之,現(xiàn)有的這些鑒定指標(biāo)存在較多的缺陷,其中特異性差、靈敏度低是主要的問(wèn)題,往往導(dǎo)致在檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)錯(cuò)判、漏判的現(xiàn)象。因此,確立一種準(zhǔn)確、可靠、特異性強(qiáng)的特征指示物,從而建立用于鑒別地溝油的特異性新方法,對(duì)于我國(guó)進(jìn)一步完善新技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、開(kāi)展有效的抽樣檢測(cè)、健全監(jiān)管政策具有十分重要的意義。在非正常食用油檢測(cè)方法(一)中,我們已提出采用外源性特征指示物———辣椒堿作為地溝油鑒定的有效指標(biāo)。該方法在識(shí)別陽(yáng)性樣品時(shí)出現(xiàn)了部分漏檢現(xiàn)象,因此僅僅依靠外源性特征指示物,無(wú)法全面、準(zhǔn)確地甄別地溝油。本項(xiàng)研究立足地溝油與正常食用植物油中脂肪酸的組成差異,通過(guò)脂肪酸的非靶標(biāo)/靶標(biāo)篩查,探索正常食用植物油與動(dòng)物油、加熱植物油在常規(guī)/微量脂肪酸組成的差異性,進(jìn)而篩選出具有地溝油信息的典型內(nèi)源性特征指示物———特征奇數(shù)碳脂肪酸,并借助多維氣相色譜-質(zhì)譜(MDGC-MS)建立了地溝油檢測(cè)新方法。同時(shí),通過(guò)系統(tǒng)考察特殊奇數(shù)碳脂肪酸在正常食用植物油與非正常食用植物油之間的含量分布差異,確立了地溝油判定指標(biāo)。1實(shí)驗(yàn)部分1.1其它精油的合成MDGC-GCMS-QP2010多維氣相色譜-質(zhì)譜儀(日本Shimadzu公司);7890A氣相色譜(美國(guó)AgilentTechnologies公司);VortexGenie2渦旋混合器(德國(guó)IKA公司);PCV-2400離心機(jī)(北京首選科技有限公司)。十一烷酸甲酯(純度≥99.0%)、13-甲基十四烷酸甲酯(純度≥98%)和十五烷酸甲酯(純度≥99.0%)均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。甲醇和正己烷均為色譜純(Fisher公司);氫氧化鉀和氯化鈉為分析純;壬烷(農(nóng)殘級(jí));大豆油、花生油、玉米油、葵花油、菜籽油、調(diào)和油、芝麻油、橄欖油等均為購(gòu)自地方大型超市的食用油;地溝油或摻雜地溝油的食用油由國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心提供。1.2實(shí)驗(yàn)步驟1.2.1采用ol/l堿法離心準(zhǔn)確移取80μL待測(cè)油樣,加入500μL正己烷和500μL2mol/L氫氧化鈉的甲醇溶液,充分渦旋(約3min)。離心,待溶液分層后,取上層溶液加入500μL飽和食鹽水,渦旋約1min后離心。將上層正己烷溶液定容至500μL,待多維氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定用。1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)確稱取十一烷酸甲酯、13-甲基十四烷酸甲酯、十五烷酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品各10mg,用壬烷分別溶解并定容,配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,質(zhì)量濃度均為10g/L,置于-20℃冰箱中保存。準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各10μL,用壬烷定容至1mL,配制質(zhì)量濃度均為100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,并逐級(jí)稀釋至50、25、5、1.0、0.500、0.100、0.050和0.025mg/L,置于-20℃冰箱中保存。1.2.3-甲基十五烷酸甲酯的峰面積將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入多維氣相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng),測(cè)定十一烷酸甲酯、13-甲基十四烷酸甲酯和十五烷酸甲酯的峰面積。再結(jié)合混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)分析物的已知含量,分別計(jì)算十一烷酸甲酯、13-甲基十四烷酸甲酯和十五烷酸甲酯的相對(duì)響應(yīng)因子,求其平均值。1.2.4dcg-ms分析將試樣溶液分別注入氣相色譜、多維氣相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)中,根據(jù)氣相色譜面積歸一化法測(cè)定十五烷酸甲酯的相對(duì)含量;根據(jù)MDGC-MS譜圖,分別計(jì)算十一烷酸甲酯(m/z200)、13-甲基十四烷酸甲酯(m/z256)和十五烷酸甲酯(m/z256)的峰面積比;再結(jié)合十五烷酸甲酯的相對(duì)含量,分別計(jì)算十一烷酸甲酯和13-甲基十四烷酸甲酯的含量,平行測(cè)定兩次。所得結(jié)果直接反映待測(cè)試樣中十一烷酸(C11∶0)和13-甲基十四烷酸(iso-C15-1)的含量。1.3儀器條件1.3.1氫火焰離子化檢測(cè)fid色譜柱為UF-mFFAP毛細(xì)管氣相色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm),進(jìn)樣口溫度260℃,氫火焰離子化檢測(cè)器(FID),分流進(jìn)樣(分流比20∶1),載氣流速0.6mL/min,溶劑延遲時(shí)間:3.5min。爐溫升溫程序:150℃保持8min,然后以6℃/min升至240℃,保持28min。1.3.2gc/ms色譜條件第一維色譜條件:色譜柱為UF-1MS毛細(xì)管氣相色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm),進(jìn)樣口溫度260℃,FID溫度280℃,不分流進(jìn)樣(不分流時(shí)間0.8min),載氣流速0.84mL/min,進(jìn)樣量1μL。爐溫升溫程序:60℃保持1min,然后以30℃/min升至180℃,保持1min,再以3℃/min升至280℃,保持20min。切割時(shí)間段為11.40~14.67min和18.75~21.00min。第二維色譜條件:色譜柱為UF-mFFAP毛細(xì)管氣相色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm);爐溫升溫程序:50℃保持21.5min,首先以30℃/min升至100℃,再以10℃/min升至200℃,然后以30℃/min升至220℃,保持20min。載氣流速:1.16mL/min。四極桿質(zhì)譜參數(shù):檢測(cè)方式:選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM);電離方式:電子轟擊源(EI,70eV);離子源溫度:200℃;傳輸線溫度:250℃;十一烷酸甲酯的定量離子為m/z200,定性離子為m/z169;13-甲基十四烷酸甲酯的定量離子為m/z256,定性離子為m/z225;十五烷酸甲酯的定量離子為m/z256,定性離子為m/z225。1.4a/a0的含量測(cè)試溶液中13-甲基十四烷酸甲酯(iso-C15-1)、十一烷酸甲酯(C11∶0)的含量(μg/g)按照公式(1)、(2)分別進(jìn)行計(jì)算:式中:M0為試樣中C15∶0的含量,單位為μg/g;M1為試樣中iso-C15-1的含量,單位為μg/g;M2為試樣中C11∶0的含量,單位為μg/g;F1為isoC15-1對(duì)C15∶0的相對(duì)響應(yīng)因子;F2為C11∶0對(duì)C15∶0的相對(duì)響應(yīng)因子;A1/A0為測(cè)試溶液中isoC15-1特征離子(m/z256)色譜峰與C15∶0特征離子(m/z256)色譜峰的峰面積比值;A2/A0為測(cè)試溶液中C11∶0特征離子(m/z200)色譜峰與C15∶0特征離子(m/z256)色譜峰的峰面積比值。2來(lái)源的來(lái)源從地溝油來(lái)源看,動(dòng)物油和加熱植物油是其中兩個(gè)重要的來(lái)源。因此本項(xiàng)研究先從正常植物油與加熱植物油、動(dòng)物油的常量及微量脂肪酸出發(fā),探索地溝油的內(nèi)源性特征指示物。2.1主成分分析檢測(cè)對(duì)3類油脂樣品中的常量脂肪酸(正癸酸C10∶0、十二烷酸C12∶0、十四烷酸C14∶0、十五烷酸C15∶0、棕櫚酸C16∶0、十七烷酸C17∶0、硬脂酸C18∶0、油酸C18∶1、亞油酸C18∶2、亞麻酸C18∶3、二十烷酸C20∶0、二十碳烯酸C20∶1、二十二烷酸C22∶0)的相對(duì)含量進(jìn)行主成分分析(principalcomponentanalysis,PCA,SPSS16.0)。主成分分析為無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別技術(shù),不考慮樣品的分類信息,通過(guò)對(duì)高維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理后,對(duì)樣品進(jìn)行判斷。其中,主成分分析載荷圖可顯示化合物的特征差異性,載荷圖上的點(diǎn)與原點(diǎn)的距離越遠(yuǎn),表明該成分對(duì)分類的貢獻(xiàn)越大,特征性越強(qiáng)。從圖1a可以看出,油脂樣品中常量脂肪酸大致由兩個(gè)主成分構(gòu)成,第一個(gè)主成分權(quán)重達(dá)到48.5%,第二個(gè)主成分權(quán)重為16.2%。每個(gè)脂肪酸對(duì)分類都有一定貢獻(xiàn),但其貢獻(xiàn)大小差別不明顯。另外,主成分分析的得分圖可以從整體上直觀地顯示樣品間是否存在差異。如圖1b所示,三類油脂樣本沿著第一、二主成分的軸方向分散性均不佳,即通過(guò)常量脂肪酸難以區(qū)分加熱植物油、動(dòng)物油與正常植物油,因此在常量脂肪酸中難以確定地溝油的特征指示物。2.2微量脂肪酸篩查由于天然植物油中主要含有偶數(shù)碳的脂肪酸,測(cè)定偶數(shù)碳的脂肪酸必定存在背景值高的問(wèn)題,因此鎖定奇數(shù)碳脂肪酸作為微量脂肪酸分析的目標(biāo)物。一方面,由于正常植物油在自然存放和反復(fù)煎炸過(guò)程中均容易產(chǎn)生低碳數(shù)脂肪酸,且這些脂肪酸在地溝油制造過(guò)程中容易被除去,因此低碳數(shù)脂肪酸不能作為地溝油的特征性指示物。另一方面,過(guò)高碳數(shù)的脂肪酸易受高背景偶數(shù)碳鏈的干擾,同樣不適合作為特征性指示物。因此,在微量脂肪酸篩查過(guò)程中,主要以C10~C18之間的奇數(shù)碳脂肪酸作為靶標(biāo)化合物。相對(duì)于常量脂肪酸而言,這些微量脂肪酸的含量較小。雖然采用修飾的聚乙二醇毛細(xì)管柱,通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜同樣可以實(shí)現(xiàn)微量脂肪酸的分離和檢測(cè),但相對(duì)于多維氣相色譜而言,其檢出限相對(duì)較高,靈敏度相對(duì)低。而在應(yīng)用二維氣相色譜-質(zhì)譜分析時(shí),第一維氣相色譜采用不分流模式,發(fā)揮在線富集、凈化的目的,只允許目標(biāo)化合物組分進(jìn)入二維氣相色譜進(jìn)行再次分離,不僅提高了該分析方法的靈敏度,而且可以使在第一維毛細(xì)管氣相色譜柱上難以分離的十五烷酸甲酯異構(gòu)體(13-甲基十四烷酸甲酯和12-甲基十四烷酸烷酸甲酯)在進(jìn)入第二維氣相色譜柱后,達(dá)到良好分離的效果,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)13-甲基十四烷酸的準(zhǔn)確定量(見(jiàn)圖2)。因此,本研究中以下實(shí)驗(yàn)均采用多維氣相色譜-質(zhì)譜對(duì)微量脂肪酸進(jìn)行測(cè)定。2.2.1不同動(dòng)物源性地溝油中的特征指示物食用動(dòng)物油與植物油在脂肪酸組成上具有顯著差異,其中食用植物油中偶數(shù)碳的脂肪酸占較大比重,而對(duì)于一些反芻動(dòng)物來(lái)說(shuō),如牛、羊中,奇數(shù)碳鏈脂肪酸甘油酯占有較大的比重。因此,研究正常食用植物油和動(dòng)物油中奇數(shù)碳微量脂肪酸的含量差異,對(duì)于確立區(qū)分動(dòng)物源性地溝油的特征指示物具有重要作用。從表1中可以看出,動(dòng)物油中13-甲基十四烷酸(iso-C15-1)、12-甲基十四烷酸(iso-C15-2),15-甲基十六烷酸(iso-C17-1)和14-甲基十六烷酸(iso-C17-2)4種奇數(shù)碳脂肪酸的含量是正常植物油的幾千到幾萬(wàn)倍,為研究動(dòng)物源性地溝油中特征指示物提供了理論依據(jù)。同時(shí)將幾種地溝油與食用植物油再次進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn):菜籽油中iso-C15-2的含量較高;棕櫚油中iso-C17-1的含量較高;而大多數(shù)植物油中的iso-C17-2和地溝油中的相對(duì)含量相當(dāng),甚至更高;只有iso-C15-1對(duì)于正常植物油和地溝油具有較好的區(qū)分度。因此,為了更好地實(shí)現(xiàn)動(dòng)物源性地溝油與正常植物油的良好區(qū)分,iso-C15-1被確立為動(dòng)物源性地溝油的特征性指示物。2.2.2動(dòng)物油松地溝油的特征指示物正常食用植物油經(jīng)過(guò)反復(fù)煎炸后即成為地溝油的一種,研究正常食用植物油加熱前后微量脂肪酸的含量變化,對(duì)于篩選植物源性地溝油中的特征指示物具有重要意義。從表2中可以看出,植物油加熱后,C11∶0的相對(duì)含量增大至原來(lái)的6~7倍,C13∶0相對(duì)含量增大至原來(lái)的2~6倍,只有iso-C15-1的含量基本保持不變,所以動(dòng)物油性地溝油的特征指示物不適用于考核煎炸的植物油。綜合C11∶0相對(duì)含量的變化情況以及其在正常植物油中的本底值,C11∶0被確立為植物源性地溝油的特征指示物。2.3質(zhì)量控制2.3.1空白試驗(yàn)按照相同的樣品前處理、分析流程,在不加入待測(cè)試樣的前提下,進(jìn)行方法空白操作;目標(biāo)分析物信噪比低于方法檢出限的1/10,視為未檢出。2.3.2日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差和實(shí)際樣品測(cè)定以實(shí)際待測(cè)油樣作為分析對(duì)象,經(jīng)過(guò)前處理后,在一天之內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次,所得分析結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差即為日內(nèi)精密度。同一樣品在不同天進(jìn)行分析測(cè)定,共計(jì)5天,所得分析結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差記為日間精密度。其中C11∶0的日內(nèi)、日間精密度分別為3.1%、7.2%,iso-C15-1的日內(nèi)、日間精密度分別為4.6%、5.5%。2.3.3待測(cè)油樣的檢測(cè)以棕櫚油為測(cè)定對(duì)象,按照本方法進(jìn)行前處理、儀器分析、定性和定量操作,并按照一定比例稀釋至目標(biāo)分析物信噪比為10,此時(shí)重復(fù)測(cè)定5次,計(jì)算測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差,取標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍,結(jié)果修約為1位有效數(shù)字作為方法檢出限。該方法中,C11∶0和iso-C15-1的方法檢出限分別為0.02μg/g和0.01μg/g。使用與實(shí)際操作相同的試劑,按照本方法由同一操作者對(duì)某個(gè)樣品從取樣稱量開(kāi)始,平行做5份,測(cè)定結(jié)果之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差即為方法重復(fù)性。C11∶0和iso-C15-1的方法重復(fù)性分別為10.0%和11.5%。2.4待測(cè)油樣的檢測(cè)將建立的地溝油中內(nèi)源性特征指示物的檢測(cè)方法應(yīng)用于國(guó)家食品安全與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心發(fā)放的第四、五批地溝油盲樣考核樣品,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3,圖3給出了第四批盲樣考核中18#樣品的質(zhì)量色譜圖。研究發(fā)現(xiàn),第四批盲樣考核的樣品中,3#、7#、10#、30#、31#、34#樣品所得測(cè)定結(jié)果中指標(biāo)100M1/M0明顯較大,表明具有顯著的動(dòng)物源性地溝油特征;4#、26#、28#、29#、35#樣品中指標(biāo)100M2/M0較大,表明具有顯著的植物源性地溝油特征。第五批樣品中,2#、5#、6#、11#、25#、28#、29#、30#樣品中指標(biāo)100M1/M0較高,具有顯著的動(dòng)物源性地溝油特征;9#、20#、26#則具有顯著的植物源性地溝油特征。因此該方法可以特異性地區(qū)分動(dòng)植物源性地溝油。除此之外,對(duì)于摻雜了不同比例的地溝油來(lái)說(shuō),如第五批考核樣品6#、28#和5#中地溝油摻雜比例分別為10%、20%和50%,其測(cè)定結(jié)果同樣可以反映出地溝油的摻雜比例梯度變化,從而滿足國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心提出的地溝油鑒定方法要求。2.3.4方法重復(fù)性在此基礎(chǔ)上,通過(guò)系統(tǒng)化實(shí)驗(yàn),結(jié)合正常食用植物油中100M1/M0和100M2/M0兩項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定值,制定其限值,用于判斷