豬流行性腹瀉病毒變異毒株快速r-pcr鑒別方法的建立

豬流行性腹瀉病毒變異毒株快速r-pcr鑒別方法的建立

豬腹瀉是由豬流行腹瀉病毒（ped）引起的一種高度接觸性野豬感染的豬。它的主要特點(diǎn)是嘔吐、脫水、脫水和死亡。不同年齡的豬容易受到影響，尤其是1.2周齡時(shí)的母豬。發(fā)病率為90%10%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。20世紀(jì)70年代,英國和比利時(shí)各自報(bào)道了該病的發(fā)生。隨后,該病在世界上多個(gè)主要養(yǎng)豬國家相繼暴發(fā)和流行。近年來,亞洲的一些國家如泰國、韓國、越南和中國多次報(bào)道了PED。PEDV是套式病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒亞科(Coronaviri-nae)、甲型冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)的成員,為有囊膜的單股正鏈RNA病毒。PEDV基因組全長約28kb,包括5′端非編碼區(qū)、3′端非編碼區(qū)以及至少7個(gè)開放閱讀框(ORF1a,ORF1b,ORF2~6),分別編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白[纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)、小包膜蛋白(E)]和非結(jié)構(gòu)蛋白(復(fù)制酶1a、1b、ORF3蛋白)。S蛋白對(duì)被感染宿主中和抗體的產(chǎn)生、特異性受體的結(jié)合以及細(xì)胞膜融合方面具有重要的生物學(xué)意義。此外,冠狀病毒S蛋白的變異將會(huì)導(dǎo)致其宿主范圍、組織細(xì)胞培養(yǎng)及毒力發(fā)生改變。PED從2010年底開始在我國大范圍暴發(fā)流行,臨床上主要表現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率的哺乳仔豬腹瀉(病死率達(dá)80%~100%),引起了國內(nèi)養(yǎng)殖同行及獸醫(yī)科研工作者的高度重視,很多相關(guān)單位開展了病原分析、流行病學(xué)調(diào)查等研究。經(jīng)綜合研究,初步認(rèn)定PEDV變異毒株是引起此次仔豬腹瀉暴發(fā)流行的主要病原。鄭逢梅等、劉孝珍等的研究顯示,PEDV當(dāng)前流行毒株的S、M和ORF3基因部分核苷酸及氨基酸的改變使其關(guān)鍵序列明顯不同于以往毒株,其中流行毒株的S基因N端存在15個(gè)堿基的插入、6個(gè)堿基的缺失及大量的點(diǎn)突變,從而導(dǎo)致流行毒株S蛋白的抗原位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)和跨膜螺旋均有明顯改變。我國現(xiàn)階段廣泛流行的PEDV與以往的毒株相比已經(jīng)發(fā)生了較為明顯的變異,變異毒株已成為優(yōu)勢(shì)毒株,這可能也是導(dǎo)致免疫失敗的一個(gè)重要原因。PEDV的抗原檢測(cè)診斷方法有多種,諸如病毒分離、免疫組織化學(xué)、免疫熒光試驗(yàn)等方法,但這些檢測(cè)診斷方法共同的局限性在于無法區(qū)分PEDV變異毒株與疫苗株或經(jīng)典毒株。雖然可通過基因測(cè)序方法來區(qū)分PEDV變異毒株與PEDV經(jīng)典毒株,但是比較費(fèi)時(shí)而且費(fèi)用高。因此,有必要建立一種更為簡(jiǎn)便有效的鑒別檢測(cè)診斷方法。鑒于此,本研究建立了一種可以區(qū)分PEDV變異毒株與PEDV疫苗株或經(jīng)典毒株的RT-PCR鑒別檢測(cè)診斷方法,并對(duì)采集的仔豬腹瀉糞便樣品進(jìn)行臨床檢測(cè)應(yīng)用。試驗(yàn)結(jié)果表明,所建立的RT-PCR鑒別檢測(cè)診斷方法可以達(dá)到快速、簡(jiǎn)便、有效地鑒別檢測(cè)變異PEDV的目的,為PED的流行病學(xué)及病原診斷研究提供了可供借鑒的技術(shù)手段。1材料和方法1.1病毒病毒prvi和csfv豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬嵴病毒(PKV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒、A群豬輪狀病毒(PRoVA)、豬瘟病毒(CSFV)均由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。1.2臨床綜合征123份腹瀉糞便樣品采自廣西壯族自治區(qū)南寧、柳州、桂林、貴港、玉林、崇左等地養(yǎng)豬場(chǎng)發(fā)生腹瀉的仔豬。1.3病毒病毒dna/rna快速抽提試劑pMD18-TVector、dNTPs、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、DL2000DNAMarker、2×TaqPCRMasterMix、DNA凝膠回收試劑盒(DNAGelExtractionKit)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptRTReagentKit)均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒為Axygen生物科技有限公司產(chǎn)品。質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。大腸桿菌DH5α菌種由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.4s基因回復(fù)突變?cè)囼?yàn)根據(jù)GenBank上登錄的豬流行性腹瀉病毒疫苗株CV777、經(jīng)典毒株及近些年的變異毒株的S基因序列,利用MegAlign(DNAStar7.1)和PrimerPremier7.0軟件在S基因變異性最大的區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物P1和P2。上游引物P1的序列為:5′-GAAAACCAGGGTGTCAAT-3′,下游引物P2的序列為:5′-CAGCAAGAATGACAGAGGTG-3′,預(yù)期目的基因的大小為826bp。上述引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。1.5rna抽提及保存將采集的糞便樣品用PBS(0.01mol/L,pH7.2)制成10%的懸液,渦旋振蕩后,4℃、10000r/min離心10min后收集上清,進(jìn)行RNA抽提或于-20℃保存?zhèn)溆?。按照AxyPrepBodyFluidVi-ralDNA/RNaminiprepKit使用說明書進(jìn)行RNA提取,所提取的RNA置于-20℃保存。1.6pcr擴(kuò)增條件反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:按照反轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒說明,采用10μL體系:RNA模板7μL,5×Prime-Script緩沖液2μL,RTEnzymeMix0.5μL,下游引物P20.5μL。按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):37℃20min,85℃30s,12℃保存。PCR反應(yīng)體系共25μL,其中滅菌水8.5μL,2×TaqPCRMasterMix12.5μL,上、下游引物各0.5μL,模板3.0μL。按照下列條件進(jìn)行擴(kuò)增:95℃預(yù)變性3min;94℃變性40s,52℃復(fù)性40s,72℃延伸60s,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。取擴(kuò)增產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠中電泳,并觀察結(jié)果。在此基礎(chǔ)上,梯度性地調(diào)整引物濃度、模板量、變性溫度和時(shí)間、退火溫度和時(shí)間、延伸時(shí)間以及循環(huán)參數(shù)等條件,以探索和確定P1/P2的最佳反應(yīng)條件。1.7pedvs基因序列測(cè)定PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳后,用瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化目的片段,再連接至pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化DH5α,挑取陽性克隆菌擴(kuò)大培養(yǎng),把提取的質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的豬PEDVS基因序列進(jìn)行比較分析。陽性質(zhì)粒被命名為pMD18-S。1.8實(shí)際病毒的pcr擴(kuò)增分別取豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬嵴病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、A群豬輪狀病毒、豬瘟病毒的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以及豬細(xì)小病毒、偽狂犬病病毒的DNA為模板,用建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增,以驗(yàn)證該方法的特異性。1.9敏感性檢測(cè)用紫外分析儀測(cè)定pMD-S質(zhì)粒的濃度,然后用雙蒸水做連續(xù)10倍稀釋,取每個(gè)稀釋度的病毒模板按上述體系及方法進(jìn)行PCR反應(yīng),以確定該方法的敏感性。1.10可靠性和穩(wěn)定性試驗(yàn)用已建立的RT-PCR檢測(cè)方法分別對(duì)PEDV陽性和陰性的各10份病料重復(fù)檢測(cè)3次,以驗(yàn)證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。1.11腹瀉病例pedv檢測(cè)利用本研究建立的RT-PCR鑒別檢測(cè)方法對(duì)來自廣西南寧、柳州、桂林、貴港、玉林、崇左等地養(yǎng)豬場(chǎng)發(fā)生腹瀉的仔豬糞便樣品(123份)進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)這些樣品用常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè),統(tǒng)計(jì)當(dāng)前腹瀉病例中PEDV變異毒株和經(jīng)典毒株所占的比例。2結(jié)果2.1rt-pcr擴(kuò)增豬致病性腹瀉病毒基因?yàn)楂@得該反應(yīng)的最佳擴(kuò)增效果和最高敏感性,對(duì)PCR擴(kuò)增的條件進(jìn)行了摸索和優(yōu)化,梯度性地改變引物濃度、模板量、變性溫度和時(shí)間、退火溫度和時(shí)間、延伸時(shí)間和時(shí)間以及循環(huán)數(shù)等條件。最終確定了最佳上、下游引物各為0.5μL,最佳模板量為3.0μL;最佳擴(kuò)增程序94℃,3min;94℃40s,52℃40s,72℃50s,35個(gè)循環(huán);72℃10min。電泳結(jié)果(見圖1)顯示,所建立的RT-PCR方法能擴(kuò)增出豬流行性腹瀉病毒變異毒株約826bp的片段,與預(yù)期的基因大小符合;而豬流行性腹瀉病毒疫苗毒株為陰性。因此,通過該檢測(cè)可以判斷腹瀉糞便中是否存在豬流行性腹瀉病毒變異毒株。2.2pcr擴(kuò)增酶切出約843bp的特異性條帶將擴(kuò)增的目的基因回收,克隆到pMD18-T載體。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定,可以擴(kuò)增或者酶切出約826bp的特異性條帶(見圖2)。測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的PEDV變異株(JQ257005)S基因序列進(jìn)行比對(duì),核苷酸序列的同源性達(dá)98.8%,說明本方法成功擴(kuò)增出PEDV變異株的S基因。2.3ddh2o擴(kuò)增用紫外分析儀測(cè)定質(zhì)粒核酸濃度后,然后按10倍系列稀釋,以ddH2O作為對(duì)照,用建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示,該方法可以檢測(cè)出11.3pg的豬流行性腹瀉病毒質(zhì)粒DNA(見圖3)。2.4異地檢測(cè)病毒的特異性試驗(yàn)結(jié)果(見圖4)顯示,本研究建立的RT-PCR方法能特異地檢測(cè)出豬流行性腹瀉病毒,而對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒、A群豬輪狀病毒、豬嵴病毒、偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細(xì)小病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性,表明建立的方法具有較好的特異性。2.5豬致病性腹瀉病毒的檢測(cè)用本研究建立的RT-PCR方法對(duì)20份樣品進(jìn)行的豬流行性腹瀉病毒重復(fù)檢測(cè)3次,所有樣品的3次檢測(cè)結(jié)果均一致,表明該方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好。2.6pedv陽性檢測(cè)對(duì)采集的123份糞便樣品,分別用常規(guī)RT-PCR和本研究建立的鑒別診斷RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,常規(guī)RT-PCR檢測(cè)出83份樣品為PEDV陽性,陽性率為67.5%;而本鑒別診斷RT-PCR檢測(cè)出72份樣品為PEDV變異毒株陽性,PEDV變異毒株陽性率為58.5%;PEDV變異毒株占總PEDV毒株的86.7%(72/83),已成為當(dāng)前豬流行性腹瀉的優(yōu)勢(shì)毒株。3tgev與pedv檢測(cè)結(jié)果PED是危害養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之一。1995年起,豬傳染性胃腸炎(transmissiblegastro-enteritis,TGE)與PED二聯(lián)滅活疫苗及弱毒疫苗開始在我國投入使用后,顯著降低了該病的發(fā)病率及對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)造成的損失。但2006年起,PED開始在免疫豬群中出現(xiàn)流行。2010年以來,我國PED更是呈高發(fā)的態(tài)勢(shì)。據(jù)Sun等報(bào)道,2010年10月開始,中國南方超過10個(gè)省份暴發(fā)PED疫情,并導(dǎo)致超過100萬頭的哺乳仔豬死亡。檢測(cè)結(jié)果顯示,100%的腹瀉豬場(chǎng)為PEDV陽性,82.0%(105/128)的糞便樣品及40.8%(20/49)的母乳樣品為PEDV陽性。這些結(jié)果提示,PEDV可能存在新的傳播途徑及垂直傳播。鄭逢梅等收集來自華中地區(qū)三省182家豬場(chǎng)臨床上均表現(xiàn)為嚴(yán)重腹瀉豬的糞便樣本,經(jīng)RT-PCR方法確定有110個(gè)豬場(chǎng)的樣本為PEDV陽性,豬場(chǎng)陽性率高達(dá)60.44%(110/182)。而在這些病料中僅檢測(cè)出1份樣本為TGEV陽性,陽性率僅為0.55%(1/182),且未發(fā)現(xiàn)PEDV與TGEV的混合感染情況。因此,確定此次疫情主要是PEDV單獨(dú)感染引起的。董彥鵬等自2011年2月至2012年3月收集了華東地區(qū)47個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)共153份腹瀉病料樣品,采用RT-PCR檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒。結(jié)果顯示,26個(gè)豬場(chǎng)的88份樣品為PEDV陽性,豬場(chǎng)陽性率達(dá)到55.32%,病料陽性率達(dá)到57.52%。上述研究表明,近幾年來引起產(chǎn)房哺乳仔豬以高發(fā)病率、高死亡率為特征的腹瀉的病原為PEDV。冠狀病毒的S蛋白在中和抗體的產(chǎn)生、特異性受體的結(jié)合以及細(xì)胞膜融合等方面具有重要的生物學(xué)意義,S基因的變異將會(huì)導(dǎo)致其宿主范圍、組織細(xì)胞培養(yǎng)及毒力發(fā)生改變。楊敏對(duì)Brl/87、CV777、JS-2004-2、Chouju、Chinju99、CH/S等多個(gè)PEDV毒株的M、E、N、S基因進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示,M、E、N基因同源性高,這3個(gè)基因非常保守;而S基因的同源性相對(duì)較低,變異較大。我國2010年以來的PEDV流行毒株和以往毒株的S基因存在較大的差異:核苷酸序列同源性低,存在大量核苷酸點(diǎn)突變和堿基缺失、插入現(xiàn)象;特征性的變異表現(xiàn)在S基因N端第170~171、413~414位核苷酸之間分別存在12、3個(gè)堿基的插入和第479~480位核苷酸之間6個(gè)堿基的缺失。盡管目前并不清楚這些變異是否會(huì)導(dǎo)致毒力的增強(qiáng),但是變異所引起S蛋白抗原位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)及跨膜螺旋的改變,可能是導(dǎo)致原有疫苗免疫失敗的一個(gè)重要原因。PCR作為一種體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)已廣泛用于各種病毒特異性核酸的檢測(cè),具有簡(jiǎn)便、快捷、敏感性高和特異性好等優(yōu)點(diǎn),對(duì)疾病的早期診斷、流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。根據(jù)病毒基因序列的差異,可以通過PCR或RT-PCR方法對(duì)野毒和弱毒進(jìn)行鑒別檢測(cè)診斷,如郝曉芳等運(yùn)用RT-PCR方法鑒別診斷豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典毒株和高致病性毒株,張玲等建立了小反芻獸疫病毒疫苗株與強(qiáng)毒株的RT-PCR鑒別方法。本研究參考GenBank中登錄的PEDV經(jīng)典毒株和變異病毒毒株的S基因序列,在上述變異