重度牙周炎病人中性多形核白細(xì)胞分泌功能及急性期纖維蛋白原的影響

重度牙周炎病人中性多形核白細(xì)胞分泌功能及急性期纖維蛋白原的影響

中立多形核細(xì)胞（pmn）是牙齒組主要的免疫細(xì)胞，在預(yù)防螺母疾病方面發(fā)揮著重要作用。但PMN清除感染微生物的同時(shí)產(chǎn)生和釋放的氧自由基、蛋白酶、促炎細(xì)胞因子以及前列腺素等具有強(qiáng)烈的促炎癥反應(yīng)和組織破壞作用。研究顯示:侵襲性和重度慢性牙周炎病人PMN或單核細(xì)胞可對(duì)一些刺激產(chǎn)生異常強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)、釋放高水平促炎細(xì)胞因子等炎性介質(zhì),即具有“過度炎癥反應(yīng)特征(hyper-reactiveinflammatoryresponsetrait)”。研究表明:嚴(yán)重的牙周感染、炎癥可導(dǎo)致機(jī)體急性期反應(yīng),使急性期纖維蛋白原(fibrinogen,Fg)水平升高而影響冠心病(coronaryheartdisease,CHD)的發(fā)生;并且Fg可促進(jìn)牙齦卟啉單胞菌對(duì)人口腔上皮的黏附、定植、還可通過促進(jìn)白細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子而加重組織炎癥反應(yīng),可能是牙周炎與CHD相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究分析Fg對(duì)不同牙周狀態(tài)者外周血PMN分泌促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-8的影響,探討PMN功能和Fg在炎癥反應(yīng)中的作用。1材料和方法1.1elisa法中性粒細(xì)胞分離液PolymorphprepTM(AXIS-SHIELD,挪威);IL-1β和IL-8ELISA試劑盒(R&D,美國(guó));純化人Fg(Sigma,美國(guó));趨化性甲酰三肽fMLP(Fluka,美國(guó));TECAN全自動(dòng)ELISA工作站(SAFIRE,澳大利亞)。1.2方法1.2.1臨床附著喪失選取牙周健康、重度牙周炎志愿者各4人,年齡45～52歲,要求:全身健康,無全身性疾病、無吸煙史。牙周健康組定義為:牙齦無炎癥、出血,無牙周袋形成、附著喪失;重度牙周炎組定義為:全口平均臨床附著喪失(clinicalattachmentloss,CAL)≥2.5mm,鄰面CAL≥5mm的位點(diǎn)數(shù)≥3,且分布于3個(gè)不同的區(qū)段,非牙周炎失牙數(shù)≤14。研究對(duì)象來自四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙周科門診,均知情同意。1.2.2pmn分離純化分別抽取各受試對(duì)象前臂肘前靜脈血10mL,加入肝素鈉抗凝管,采用Polymorphprep梯度密度離心法分離PMN,分別混勻后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液密度。取PMN懸液少量涂片、Wright-Giemsa染色,證實(shí)分離所得PMN純度>95%;2%臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)證實(shí)活細(xì)胞率為95%～98%(圖1～2)。1.2.3趨化肽fmlp配制人Fg液并以終濃度2mg/mL加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板作為實(shí)驗(yàn)組2(T2組),4℃過夜預(yù)覆蓋,加入PMN懸液前以PBS液洗孔2次;部分孔中加入終濃度為100nmol/L的趨化肽fMLP(N-Formyl-Met-Leu-Phe)作為實(shí)驗(yàn)組1(T1組)。然后各孔以1×106/1mL分別加入牙周健康或重度牙周炎者PMN懸液,僅加入PMN懸液而無Fg或fMLP者作為空白對(duì)照組(C組),各實(shí)驗(yàn)孔均設(shè)2平行孔。24孔板于50mL/LCO2、37℃條件下孵育,并分別于第2、8小時(shí)取各孔上清液,2500r/min離心5min后分裝、-20℃凍存;采用定量夾心ELISA法,按試劑盒說明分別檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-1β、IL-8水平。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件配對(duì)t檢驗(yàn)、方差分析(ANOVA)和最小顯著差(LSD)法多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。2結(jié)果2.1不同牙齒周期的pmn分泌il-1進(jìn)行比較(表1)2.2不同牙齒周圍的pmn分泌il-8以進(jìn)行比較(表2)3重度慢性牙周炎病人pmn的雙重感染反應(yīng)特點(diǎn)機(jī)體過度炎癥和免疫反應(yīng)是牙周組織破壞的主要原因。雖然單個(gè)的活化單核細(xì)胞可釋放較PMN更多量的促炎細(xì)胞因子,但PMN在炎癥牙周組織和齦溝液中數(shù)量巨大,因此它們是牙周病損區(qū)細(xì)胞因子的主要來源,在牙周炎發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。VanDyke等認(rèn)為,重度慢性牙周炎病人PMN可能并非“功能低下”,而是“炎癥反應(yīng)過度”,它們對(duì)刺激可產(chǎn)生異常強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),分泌的促炎細(xì)胞因子水平顯著高于正常PMN,并將其這一特點(diǎn)稱為“過度炎癥反應(yīng)特征”。趨化性甲酰三肽fMLP可在結(jié)構(gòu)上模擬感染部位的微生物趨化肽激活PMN,因此,本文將其作為實(shí)驗(yàn)組刺激物觀察其對(duì)PMN分泌功能的影響,同時(shí)也作為Fg組的陽(yáng)性對(duì)照以觀察二者對(duì)PMN作用的異同。結(jié)果發(fā)現(xiàn):受Fg或fMLP刺激后,重度慢性牙周炎病人PMN分泌IL-1β、IL-8的水平均較牙周健康者高(雖然某些水平差異未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),提示重度慢性牙周炎病人外周血PMN存在“過度炎癥反應(yīng)特征”,對(duì)一些刺激反應(yīng)強(qiáng)烈,可分泌高水平的促炎細(xì)胞因子。頑固性、侵襲性牙周炎、I型糖尿病病人也具有這種“過度炎癥反應(yīng)”表型的吞噬細(xì)胞,但這種特殊表型是長(zhǎng)期炎癥刺激誘導(dǎo)形成抑或細(xì)胞本身固有的遺傳特征,目前尚無定論。Beck、Offenbacher等曾據(jù)此推測(cè),具有這種特殊吞噬細(xì)胞表型的個(gè)體可能是牙周炎、CHD易感者,這些個(gè)體一旦牙周炎病損確立,即會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)毒素和高水平促炎細(xì)胞因子對(duì)全身血管系統(tǒng)的慢性反復(fù)刺激。促炎細(xì)胞因子IL-1β不僅與牙周組織破壞密切相關(guān),還可刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管細(xì)胞黏附分子-1而促進(jìn)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附、上調(diào)低密度脂蛋白受體的基因轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)脂質(zhì)成分在巨噬細(xì)胞中集聚并形成泡沫細(xì)胞、使平滑肌細(xì)胞增生和遷移,促進(jìn)CHD病理基礎(chǔ)——?jiǎng)用}粥樣硬化的形成。趨化因子IL-8可趨化募集PMN、加重牙周炎癥反應(yīng),并且具有與單核細(xì)胞趨化蛋白-1相似的作用,可趨化T細(xì)胞進(jìn)入粥樣硬化病損區(qū),促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。然而,不論是否具有“過度炎癥反應(yīng)”表型,PMN表面β2整合素受體與配體的結(jié)合可激活PMN。急性期蛋白成分Fg是β2整合素受體的天然高親和力配體,二者結(jié)合可介導(dǎo)PMN黏附并啟動(dòng)其炎癥相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá),誘導(dǎo)PMN呼吸爆發(fā)和脫顆粒反應(yīng),分泌促炎細(xì)胞因子、加重炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果也顯示:與Fg作用后,PMN分泌IL-1β、IL-8的水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05),也顯著高于PMN的強(qiáng)刺激因子趨化肽fMLP刺激組(P<0.05)?？梢酝茰y(cè),由于重度牙周炎病人PMN可能具有“過度炎癥反應(yīng)特征”、可分泌高水平促炎細(xì)胞因子,同時(shí),嚴(yán)重的牙周感染、炎癥可引發(fā)急性期反應(yīng)、導(dǎo)致Fg水平升