廣西甜茶制劑中甜茶素的測(cè)定

廣西甜茶制劑中甜茶素的測(cè)定

廣西甜茶是薔薇科的一種多年生類(lèi)型的懸鉤子。這些葉子和樹(shù)枝是廣西特有的野生甜植物，具有低能量，高甜味，具有獨(dú)特的經(jīng)濟(jì)功能。主要成分為萜類(lèi)、黃酮、多酚、氨基酸及礦物質(zhì)等。廣西甜茶在民間有悠久的應(yīng)用歷史,長(zhǎng)期以來(lái)除當(dāng)茶葉飲用之外還可入藥,具有清熱、潤(rùn)肺、祛痰、止咳等功效,并用于糖尿病和高血壓病等癥的輔助治療?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明廣西甜茶還具有減肥和抗腫瘤的作用。甜茶素,又稱(chēng)甜葉懸鉤子苷,甜度相當(dāng)于蔗糖的300倍,是廣西甜茶甜味構(gòu)成的主要成分。藥理研究表明,甜茶素具有降血糖、降血脂、降血壓等藥理活性,與廣西甜茶的主要功效一致。甜茶素是由斯替維醇和葡萄糖結(jié)合而成的四環(huán)二萜苷,分子式C32H50O13,化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。目前市面銷(xiāo)售廣西甜茶的制劑以袋泡茶為主,國(guó)內(nèi)主要產(chǎn)區(qū)是在廣西,國(guó)外是在日本。研究表明,甜茶中甜茶素的含量可因不同的產(chǎn)地、采收季節(jié)、采收部位而有較大差異,制劑中甜茶原材料的來(lái)源也可能受這些因素的影響而導(dǎo)致制劑中甜茶素的含量差異。文獻(xiàn)報(bào)道采用分光光度法、紅外光譜法、高效液相色譜法等對(duì)甜茶藥材中甜茶素含量進(jìn)行測(cè)定。但分光光度法需要經(jīng)過(guò)對(duì)甜茶素水解、顯色、薄層分離后進(jìn)行紫外分析等繁雜的步驟;紅外光譜法能區(qū)別甜茶素的含量差異但無(wú)法定量;高效液相色譜法雖然作為目前含量測(cè)定最常用的方法,但與基于小粒徑填料色譜柱技術(shù)的RSLC相比較,仍存在分析時(shí)間長(zhǎng)、溶劑消耗量大、分離效能較低等缺點(diǎn)。因此本文首次采用RSLC-DAD對(duì)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的廣西甜茶制劑中甜茶素含量進(jìn)行快速測(cè)定并進(jìn)行比較,該方法可以顯著縮短分析時(shí)間和節(jié)省有機(jī)溶劑,為建立科學(xué)合理的廣西甜茶袋泡茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。1儀器和試劑盒1.1動(dòng)進(jìn)樣器和dad-400rs檢測(cè)戴安Ultimate3000超快速液相色譜儀(包含3000RS泵,WPS-3000RS自動(dòng)進(jìn)樣器,TCC-3000RS柱溫箱,DAD-3000RS檢測(cè)器,變色龍色譜數(shù)據(jù)處理軟件,美國(guó)DIONEX);CP225D電子分析天平(德國(guó)SARTORIUS);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)MILLIPORE);SB-5200D超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。1.2廣西甜茶制劑樣品甜茶素對(duì)照品(03-1001,上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心);廣西甜茶制劑樣品(市售,共21份,見(jiàn)“2.9”項(xiàng)下);乙腈(色譜純,Fisher);水為超純水;其余試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1回收塔板分離度色譜柱為DionexRSLC120C18柱(50mm×2.1mm,2.2μm),流動(dòng)相為乙腈-水(36∶64),檢測(cè)波長(zhǎng)205nm,柱溫40℃,流速0.3ml/min,進(jìn)樣量2μl。按甜茶素峰計(jì)算理論塔板數(shù)不低于2000,分離度大于1.5。色譜圖見(jiàn)圖2~3。2.2對(duì)照品貯備液的制備精密稱(chēng)取甜茶素對(duì)照品10.0mg置10ml量瓶中,加50%乙醇超聲溶解后定容,配成濃度為1.00mg/ml的對(duì)照品貯備液。精密吸取儲(chǔ)備液3ml置5ml量瓶中,加50%乙醇稀釋至刻度,搖勻,即得濃度為0.60mg/ml對(duì)照品工作液,精密吸取該工作液1ml置10ml量瓶中,50%乙醇稀釋至刻度,搖勻,即得濃度為60μg/ml的對(duì)照品工作液。2.3rslc分析法提取樣品精密稱(chēng)取甜茶粗粉(糖果碾碎后稱(chēng)取)0.05g,置2ml的量瓶中,加入2ml的50%乙醇,超聲提取15min,放冷至室溫,用溶劑定容至刻度,搖勻,取提取溶液過(guò)0.22μm微孔濾膜,取續(xù)濾液即得RSLC分析樣品。2.4方法的線(xiàn)性范圍與峰面積線(xiàn)性關(guān)系取甜茶素對(duì)照品工作液,用50%乙醇稀釋成系列濃度(15,30,90,150,210,300μg/ml),每個(gè)濃度進(jìn)樣3次,以平均峰面積(A)為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),做線(xiàn)性回歸,計(jì)算得回歸方程為Y=19.099X+0.0997,r2=0.9997,表明甜茶素進(jìn)樣量在0.03~0.6μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系。2.5儀器精密度試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液(0018),按上述色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣5次,測(cè)得甜茶素平均峰面積為8.5894,RSD=1.9%,表明儀器精密度良好。2.6穩(wěn)定性測(cè)定方法取同一份樣品(0018),分別在0,2,4,6,8,10,12h進(jìn)樣分析,測(cè)定樣品在12h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果峰面積RSD為1.3%,表明甜茶樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.7測(cè)定甜茶素含量精密稱(chēng)取同供試品(0018)5份,按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液,測(cè)定甜茶素的含量。結(jié)果甜茶素平均含量為45.17mg/g,RSD=1.3%,表明方法重復(fù)性良好。2.8對(duì)照品回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知含量的樣品(0018),平行9份,分別加入對(duì)照品適量(約為樣品中甜茶素含量的50%,100%,150%,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算各樣品的對(duì)照品加樣回收率。結(jié)果平均回收率為99.1%,RSD為0.97%,符合含量測(cè)定要求。2.9甜茶樣品測(cè)試按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按色譜條件測(cè)定峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算甜茶素含量。結(jié)果見(jiàn)表2。3討論3.1高效液相色譜法本實(shí)驗(yàn)首次建立了RSLC-DAD對(duì)不同廠(chǎng)家的廣西甜茶制劑中甜茶素的測(cè)定方法。RSLC是一種分析速度快、靈敏度高的新色譜技術(shù),與傳統(tǒng)HPLC相比具有分離度高、速度快、靈敏度高等優(yōu)勢(shì):本實(shí)驗(yàn)采用快速高效液相色譜法所測(cè)成分保留時(shí)間在1.3min,分析一個(gè)樣品僅用2min——僅為普通液相三分之一,流動(dòng)相消耗僅為普通液相十五分之一。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)還對(duì)樣品測(cè)定的前處理?xiàng)l件如提取溶劑、溶劑倍量及超聲時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)選,所建立的測(cè)定方法簡(jiǎn)便、快速、可靠。3.2結(jié)果表明，甜茶素含量為采用建立的RSLC-DAD方法對(duì)中國(guó)和日本市面上共21份甜茶商品中甜茶素進(jìn)行了測(cè)定,含量范圍為0~63.79mg/g。3.2.1植物來(lái)源分析0066,0086和0111號(hào)樣品中并未檢測(cè)到甜茶素?？紤]到這3份樣品分別產(chǎn)自云南和湖南雪峰山,結(jié)合其顯微特征,推測(cè)其植物來(lái)源應(yīng)為殼斗科多穗柯IithocarpusploystachyusRehd而非廣西甜茶,進(jìn)而提示本方法可以將廣西甜茶與多穗柯甜茶進(jìn)行區(qū)分。3.2.2袋泡茶中甜茶素的含量從表2可以看出不同廣西甜茶商品中甜茶素含量有明顯差異:0118樣品為甜茶糖果,甜茶素含量?jī)H為5.45mg/g;0057和0065號(hào)樣品為多種代用茶(廣西甜茶、絞股藍(lán)、桑葉、茯苓)混合而成的袋泡茶,含有較多的添加物,導(dǎo)致甜茶素含量偏低(分別為14.77mg/g和17.25mg/g);0125和0127為甜茶葉片,甜茶素含量較高,分別為63.79mg/g和45.11mg/g;其余14份樣品均為袋泡茶,甜茶素含量范圍為17.17~59.75mg/g。3.2.3廣西平樂(lè)指標(biāo)84.84.84.84.84.97.g本文收集的日本市售廣西甜茶商品的原材料均來(lái)源于廣西。因此根據(jù)含量測(cè)定的結(jié)果,得出不同產(chǎn)地的廣西甜茶袋泡茶、茶葉甜茶素含量的差異:廣西金秀(含量范圍45.57~63.79mg/g,平均54.18mg/g)和廣西平樂(lè)(59.75mg/g)含量最高,其次為廣西桂林(53.33mg/g)、湖南永州(50.98mg/g)、廣西玉林(45.11mg/g)、江西上饒(43.21mg/g)、貴州三都(29.99mg/g)、廣西羅城(24.89mg/g)、廣東惠州(17.17mg/g)。吳祖祥和唐輝分別采用分光光度法和紅外光譜法對(duì)甜茶素含量進(jìn)行了測(cè)定,均報(bào)道廣西金秀產(chǎn)甜茶素含量較高。4不同部位、材料、干酵母粉含量對(duì)甜茶素含量的影響文獻(xiàn)曾報(bào)道甜茶素在不同季節(jié)