高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地醋莪術(shù)飲片中4種成分

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地醋莪術(shù)飲片中4種成分

姜科姜黃屬植物的蓬莪術(shù)c.kwasinsi類和ii類。g.leeetc.f.liang和wenyuni不在乎。h.chen等人的干燥根系主要產(chǎn)于四川、廣西和浙江。醋莪術(shù)為莪術(shù)飲片經(jīng)醋炙后得到的合格飲片,其主要含有揮發(fā)油(1%~2.5%)和姜黃素2大類成分。揮發(fā)油中主要成分為單萜和倍半萜類,如莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮和β-欖香烯等。莪術(shù)醇在2005年版和2010年版《中國(guó)藥典》中作為含量鑒別的指標(biāo)已有廣泛研究,莪術(shù)常用的含量測(cè)定方法有:分光光度法、氣相色譜法、毛細(xì)管氣相色譜法。孫艷濤等采用HPLC波長(zhǎng)切換法測(cè)定了莪術(shù)殘油(去除β-欖香烯的揮發(fā)油)中莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇和吉馬酮的含量,李敏等采用HPLC法測(cè)定了郁金類藥材中吉馬酮和莪術(shù)二酮的含量,馮海紅等采用氣相色譜法測(cè)定了不同品種莪術(shù)中β-欖香烯的含量,在現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中,有關(guān)莪術(shù)的化學(xué)成分研究主要集中于生藥、生飲片和莪術(shù)油,莪術(shù)炮制品如醋飲片研究報(bào)道較少,而中醫(yī)臨床上應(yīng)用較多的是醋莪術(shù)飲片。因此同時(shí)分析檢測(cè)醋莪術(shù)飲片中莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮和β-欖香烯這4種有效成分的含量對(duì)醋莪術(shù)飲片及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立和臨床應(yīng)用都有重大的意義。1藥品、成分配比及樣品來源Agilent1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)包括:四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器;依利特HypersilODS2柱(4.6mm×250mm,5μm)(大連依利特分析儀器有限公司)。莪術(shù)二酮對(duì)照品(上海滬云醫(yī)藥開發(fā)有限公司,批號(hào)13657-68-6),莪術(shù)醇對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)100185-200506),吉馬酮(牻牛兒酮)對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)111665-200902),β-欖香烯對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)100268-200401)。樣品:取購(gòu)自莪術(shù)主產(chǎn)地(四川、廣西、浙江),經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院巢建國(guó)教授鑒定為姜科植物蓬莪術(shù)C.phaeocaulis、廣西莪術(shù)C.kwangsiensis及溫郁金C.wenyujin的干燥根莖。生藥材標(biāo)本存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制實(shí)驗(yàn)室。分別取凈莪術(shù)片按2010年版《中國(guó)藥典》莪術(shù)飲片項(xiàng)下制法各產(chǎn)地相應(yīng)的莪術(shù)和醋莪術(shù)飲片。樣品來源及批次見表1。試劑:乙腈、甲醇為色譜純,其他所用試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1腈a-水-腈ODS-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,乙腈(A)-水(B),0~30min,40%~60%A;30~40min,60%~80%A;40~60min,80%~90%A。下一個(gè)循環(huán)前用100%乙腈沖洗色譜柱10min,繼續(xù)用40%的乙腈平衡10min。柱溫25.0℃;流速1.0mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。2.2溶液的制備2.2.1混合對(duì)照品溶液的配制精密稱取各對(duì)照品適量,置于10mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,即得含莪術(shù)二酮0.2640g·L-1,莪術(shù)醇1.3670g·L-1,吉馬酮0.0520g·L-1,β-欖香烯0.2531g·L-1的混合對(duì)照品溶液。2.2.2聯(lián)合濾過濾濾稱取莪術(shù)片粉末0.5g,精密稱定,加乙醚超聲提取3次,每次用量為10mL,時(shí)間為10min,合并濾液,用少量乙醚洗滌殘?jiān)盀V器,合并乙醚液,揮干乙醚,殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0mL,搖勻,濾過,即得。2.2.3不同藥物治療吉馬酮的情況精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液5mL,置于10mL量瓶中,甲醇定容至刻度,搖勻,重復(fù)此操作再連續(xù)稀釋4次。最終使莪術(shù)二酮的質(zhì)量濃度分別為0.2640,0.1320,0.0660,0.0330,0.0165,0.0083g·L-1;莪術(shù)醇為0.2136,0.1068,0.0534,0.0267,0.0133,0.0067g·L-1;吉馬酮為0.0520,0.0260,0.0130,0.0065,0.0033,0.0016g·L-1;β-欖香烯為0.2531,0.1265,0.0633,0.0316,0.0158,0.0079g·L-1。2.3色譜條件同前處理分別取空白溶劑,混標(biāo)溶液,樣品溶液,注入液相色譜儀中,色譜條件同前,進(jìn)樣10μL,測(cè)定,結(jié)果表明莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮和β-欖香烯分離良好,在各出峰處均無干擾,見圖1。2.4線性范圍與相關(guān)系數(shù)各對(duì)照品液分別進(jìn)樣10μL,重復(fù)2次,按2.1項(xiàng)下測(cè)定峰面積值,以峰面積平均值和對(duì)照品濃度進(jìn)行回歸處理,計(jì)算線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù),見表2。2.5武德吉馬酮、吉馬酮、-欖香烯的檢測(cè)取同一混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯質(zhì)量濃度分別為0.2640,1.3670,0.0520,0.2531g·L-1),連續(xù)進(jìn)樣6次,進(jìn)樣量10μL,測(cè)定莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯的峰面積值,計(jì)算得的RSD分別為0.73%,0.63%,0.78%,0.52%。2.6溶液穩(wěn)定性測(cè)定取批號(hào)為100204的樣品粉末0.5g,照供試品溶液的制備項(xiàng)下制備供試品溶液,隔2h進(jìn)樣10μL,進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算峰面積在12h內(nèi)的RSD,結(jié)果莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯的分別為0.78%,0.51%,0.33%,0.57%,表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.7樣品檢測(cè)及分析取批號(hào)為100204的樣品粉末0.5g,精密稱定,按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備樣品,平行試驗(yàn)6份,在上述色譜條件下,進(jìn)樣量10μL,進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯的峰面積的RSD,結(jié)果為2.1%,2.0%,2.8%,2.3%。2.8加樣回收率試驗(yàn)精密稱取9份批號(hào)為100204的莪術(shù)粉末0.25g,分別置于具塞錐形瓶中,再精密加入質(zhì)量濃度為1.32g·L-1莪術(shù)二酮、1.068g·L-1莪術(shù)醇、0.3155g·L-1吉馬酮、0.5062g·L-1β-欖香烯對(duì)照品溶液1.2,1.0,0.8mL(每個(gè)濃度取3份),照供試品溶液制備項(xiàng)下制備樣品,注入液相色譜儀中,色譜條件同前,進(jìn)樣10μL,計(jì)算加樣回收率。結(jié)果莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯的回收率分別為98.27%,97.96%,98.20%,97.27%,RSD分別為2.9%,1.5%,2.0%,2.7%。2.9供試品溶液的制備取18批醋莪術(shù)飲片樣品(過3號(hào)篩)約0.5g,精密稱定,按供試品溶液制備方法制備,得供試品溶液。并按上述含量測(cè)定方法分別測(cè)定其中4種成分的含量,見表3。3討論3.1色譜條件選擇作者比較了KromasilC18柱(4.6mm×250mm,5μm);依利特HypersilODS2柱(4.6mm×250mm,5μm),分別采用同一色譜條件進(jìn)行分離,結(jié)果表明依利特HypersilODS2柱,4種成分均能出峰,各峰間分離度、對(duì)稱性較好,分離效果為佳。3.2相為乙腈a-水b分別采用不同梯度的流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離。結(jié)果表明流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B),0~30min,40%~60%A;30~40min,60%~80%A;40~60min,80%~90%A。分離效果最佳。3.3醋酒中各化合物的含量在最佳提取制備條件摸索方面,作者對(duì)提取溶劑,提取方式及提取次數(shù)進(jìn)行考察。發(fā)現(xiàn)采用乙醚超聲提取,提取效果較好,且色譜峰峰形較好;實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間超聲提取會(huì)使提取溫度升高,影響揮發(fā)性成分的含量測(cè)定,故控制超聲提取時(shí)間為10min;樣品提取至無色需要重復(fù)操作3次,故樣品只提取3次。實(shí)驗(yàn)中樣品使用乙醚作溶劑,以超聲提取3次,每次用量為10mL,每次10min為宜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明莪術(shù)經(jīng)醋制后莪術(shù)二酮和β-欖香烯的含量明顯下降,莪術(shù)醇的含量略微上升,吉馬酮的含量略微下降。莪術(shù)二酮等4種成分均為萜類和倍半萜類化合物,熔沸點(diǎn)較低,炮制過程中的加熱易造成這些成分的揮發(fā),許志忠等研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)二酮在受熱的條件下可以定量地轉(zhuǎn)化為莪術(shù)醇,涉及一個(gè)熱重排反應(yīng),且在相同條件下,莪術(shù)醇不能轉(zhuǎn)化為莪術(shù)二酮,可能