紫外分光光度法測定黑豆皮中花青素含量

紫外分光光度法測定黑豆皮中花青素含量

黑客是中國的傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)品種。它有著悠久的食用和藥用歷史。自古以來，人們就使用黑豆來補充、活血和改善頭發(fā)。黑豆皮,又稱烏衣,富含大量花青素,主要以飛燕草素、矢車菊素為主,具有抗氧化活性、抑制誘變、抗炎、預(yù)防癌癥以及延緩衰老等多種保健功效,一直是天然食用添加劑和健康保健食品的原料。我國是農(nóng)業(yè)大國,從南到北很多省份都種植黑豆,資源豐富,可謂世界各國之首。在我國的北方,如天津市、河北省、山東省都有豐富的黑豆產(chǎn)量,但是由于產(chǎn)地不同,黑豆皮中的功效成分差異較大,因此本文在文獻(xiàn)工作基礎(chǔ)上,利用比色法測定不同產(chǎn)地黑豆皮中花青素的含量,從而進(jìn)一步控制黑豆皮的質(zhì)量,為其在食品添加劑和保健食品中的應(yīng)用提供參考。1材料和方法1.1材料、試劑和設(shè)備1.1.1黑豆皮、黑皮黑豆皮原料:黃仁黑豆皮,產(chǎn)自湖北;青仁黑豆皮,產(chǎn)至東北,青扁黑豆皮,產(chǎn)自安徽;市售黑豆皮,產(chǎn)自山東濱州;內(nèi)蒙黑豆皮,產(chǎn)自內(nèi)蒙古。所有試驗黑豆皮原料由天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供。1.1.2試劑飛燕草素標(biāo)準(zhǔn)品:挪威Polyphenols公司;無水乙醇、甲醇:均為分析純,天津康科德化工有限公司;鹽酸:天津大茂化工有限公司。1.1.3設(shè)備UV-2401PC:日本島津公司;HZQ-QX型電動振蕩機:東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。1.2方法1.2.1黑豆皮提取物的吸附劑分析用1%鹽酸甲醇溶液配制少量黑豆皮提取液,用UV-2401PC紫外可見分光光度計200nm~600nm的范圍內(nèi)對色素進(jìn)行掃描,得黑豆皮提取液的吸附光譜圖。同時對標(biāo)準(zhǔn)品溶液在200nm~600nm的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,得到飛燕草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸附光譜圖。1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的測量1.2.2.標(biāo)品溶液的配制精密稱取飛燕草素對照品適量,用1%鹽酸甲醇溶液溶解,定容在100mL容量瓶中,配制成85.211μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液,備用。1.2.2.標(biāo)準(zhǔn)品儲備液的稀釋分別精密吸取2、4、6、8、10mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,用1%鹽酸甲醇溶液稀釋并且定容至刻度。在520nm下測定吸光度,測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.3質(zhì)量檢測準(zhǔn)確稱取黑豆皮原料5g加入浸提液浸泡過夜,過濾,測定其體積為V。精密吸取1mL樣品浸提液,置1000mL棕色容量瓶中,用1%的鹽酸甲醇定容到刻度,以同批1%鹽酸甲醇溶液作空白,置520nm處測定其吸收度?；ㄇ嗨睾坷?.2.2.2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測定。1.2.4黑豆皮中清除藍(lán)色素的條件1.2.4.樣品溶液配制準(zhǔn)確稱取黑豆皮5g,共4份,分別置于100mL三角瓶中,分別加入甲醇、95%乙醇,1%鹽酸甲醇50mL和1%鹽酸乙醇各50mL,浸提8h。按照1.2.3項下配制方法進(jìn)行樣品制備,測量其吸光度。通過對甲醇、95%乙醇、含有體積比例為1%鹽酸的甲醇溶液和95%乙醇溶液進(jìn)行考察,確定最佳提取溶劑。1.2.4.鹽酸甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)為5.5%鹽酸甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)準(zhǔn)確稱取黑豆皮5g,共5份,分別置于100mL三角瓶中。分別加入甲醇50mL、0.5%鹽酸甲醇溶液(體積分?jǐn)?shù))50mL、1%鹽酸甲醇溶液(體積分?jǐn)?shù))50mL、1.5%鹽酸甲醇溶液(體積分?jǐn)?shù))50mL、2%鹽酸甲醇溶液(體積分?jǐn)?shù))50mL,浸提8h。按照1.2.3項下配制方法進(jìn)行樣品制備測量其吸光度。1.2.4.樣品前提取時間的確定準(zhǔn)確稱取黑豆皮5g,共6份,分別置于100mL三角瓶中,精密加入1%鹽酸甲醇50mL。6份樣品,密封狀態(tài)下進(jìn)行提取,提取時間分別為1、2、4、6、8、10h。然后按照1.2.3項下配制方法進(jìn)行樣品制備,測量其吸光度。1.2.4.鹽酸甲醇浸提液的制備準(zhǔn)確稱取黑豆皮5g,共5份,分別置于100mL三角瓶中。分別加入1%鹽酸甲醇10、25、50、75、100mL。密閉狀態(tài)下進(jìn)行浸提8h。然后按照1.2.3項下配制方法進(jìn)行樣品制備,測量其吸光度。1.2.5加樣回收率的測定精密稱取已知含量的供試品原料5g,準(zhǔn)確加入與供試品中花青素含量相同的飛燕草素對照品,按照1.2.4中確定的提取方法進(jìn)行提取,按1.2.3項下確定的方法準(zhǔn)確測定,計算平均回收率。1.3提取方法的確定分別準(zhǔn)確稱取不同產(chǎn)地的黑豆皮5g,按照1.2項下確定的最優(yōu)提取方法進(jìn)行提取,按照1.2項下的含量測定方法進(jìn)行含量測定。每個產(chǎn)地的黑豆皮平行測定3次。2試驗結(jié)果2.1花青素類色素的吸收峰圖1a是黑豆皮提取物在1%鹽酸甲醇溶液中的吸收光譜,從光譜中可以看出黑豆皮提取物分別在520、362、279、205nm處有吸收峰,而520nm為花青素類色素的特征吸收峰。圖1b是標(biāo)準(zhǔn)品飛燕草素在1%鹽酸甲醇溶液中的吸收光譜,從光譜中可以發(fā)現(xiàn)其在520、360、280nm處有吸收峰,綜合分析后,選擇520nm作為黑豆皮提取物中花青素吸收度的檢測波長。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的測量和方法研究2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按照1.2.2.2項下方法進(jìn)行測定,結(jié)果如圖2所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.0943x,(x表示為測試溶液的濃度,單位為μg/mL),r=0.9996(n=5),該標(biāo)準(zhǔn)曲線在濃度為1.7μg/mL~8.5μg/mL的范圍內(nèi)線性良好。2.2.2準(zhǔn)確度的測量吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1mL,按1.2.2.2項下的方法進(jìn)行精密度測定,RSD=0.21%(n=6),本方法的精密度良好。2.2.3測定吸光度值吸取供試品溶液1mL,分別在2、4、6、8、10h后測定吸光度值。試驗結(jié)果表明:在0~10h內(nèi)穩(wěn)定性良好,RSD=0.23%。2.2.4方法重現(xiàn)性測定準(zhǔn)確稱取同一產(chǎn)地的黑豆皮5份,每份5g。按1.2.4項下確定的方法進(jìn)行提取,再按1.2.3項下方法進(jìn)測定,實驗結(jié)果顯示,該方法重現(xiàn)性良好,RSD為0.74%(n=5)。2.3黑豆皮中清除藍(lán)色素的條件2.3.1提取溶劑的選擇不同溶劑的浸提結(jié)果見表1。表1測試結(jié)果顯示采用1%的鹽酸甲醇溶液作為提取溶劑時,吸光度最高,說明具有很好的提取效果。因此本試驗采用1%的鹽酸甲醇作為提取溶劑。2.3.2鹽酸對提取效果的影響不同鹽酸濃度的浸提結(jié)果見表2。測試結(jié)果如表2,在相同提取時間條件下,隨著鹽酸濃度的增加,測試溶液的吸光度值也在增高。說明酸度的增加會提高提取收率。但是從1%~2.5%的酸度變化,提取溶液的吸光度值增加并不明顯,因此確定提取溶液鹽酸濃度為1%。2.3.3不同浸提時間和提取時間對吸光度值的影響不同時間的浸提結(jié)果見表3。如表3所示,浸提時間達(dá)到8h時,吸光度值達(dá)到最高,而且隨著提取時間的增加,吸光度值達(dá)到穩(wěn)定。因而確定浸提時間為8h。2.3.4最佳料液比的確定不同料液比的浸提結(jié)果見表4。通過對不同料液比的考察,結(jié)果如表4所示,料液比為1∶10時,吸光度值達(dá)到最高,因而確定最佳料液比為1∶10。2.4樣品回收率的測定按照1.2.5項下確定的方法準(zhǔn)確測定,平均回收率為98.34%,RSD=2.32%(n=5)。2.5加標(biāo)回復(fù)加量測定結(jié)果按照1.2.4項下確定的提取方法進(jìn)行含量測定,結(jié)果如表5所示。分析結(jié)果如表5所示,市售的黑豆皮其花青素含量相對較低,而安徽產(chǎn)的青扁黑豆皮花青素含量相對較高。3品種間