金銀花葉中木犀草素的分離與鑒定

金銀花葉中木犀草素的分離與鑒定【摘要】目的建立一種可以從金銀花葉中分離出木犀草素的方法。方法采用超聲提取，石油醚回流脫色、大孔樹脂柱和聚酰胺柱分離相結合的方法，通過薄層色譜、紫外光譜、紅外光譜、高效液相色譜進行鑒定，最終得到木犀草素產品。結果此產品純度最高可達81.6%，得率為28.9ug?g-1。結論建立了從金銀花葉中分離木犀草素的新工藝。【關鍵詞】金銀花葉；木犀草素；分離；鑒定金銀花是名貴中藥材，含有多種有效成分，木犀草素作為一種黃酮單體，具有抗炎、抗菌、抗癌、抑酶、抗氧化、利膽利尿等多種作用，金銀花葉作為金銀花的一種副產物，產量較大，而且常常被浪費掉，研究表明，金銀花葉中木犀草素的含量平均是花中的2.8倍［1，2］，但目前對于金銀花葉中木犀草素的研究僅限于含量測定，對于木犀草素產品的分離、純化還未見報道。本文采用超聲提取，石油醚回流脫色、大孔樹脂柱和聚酰胺柱分離相結合的方法從金銀花葉中分離出了黃酮單體木犀草素，并結合聚酰胺薄層色譜、紅外光譜、紫外光譜、高效液相色譜等方法對分離后得到的木犀草素產品進行定性鑒定和定量分析，其純度最高可達81.6%，得率為28.9ug?g-1。1儀器與材料紫外-可見分光光度計UV-2450（日本島津公司）；電子分析天平;旋轉蒸發(fā)器RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠）；Agilent1100型高效液相色譜儀，紅外光譜儀FTIR-8400S（日本島津公司），紫外燈。聚酰胺粉（80-100目），木犀草素標準品（購于北京豐斯特公司），工業(yè)酒精，其它試劑均為分析純。2方法2.1木犀草素含量測定精密吸取0.100mg/ml木犀草素對照品溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml于10ml容量瓶中，用流動相（甲醇:0.02%磷酸=50:50）定容至刻度，選擇色譜柱為ZORBAXSB-C18柱（250mmX4.6mm，5um，Agilent公司）；以甲醇:0.02%磷酸=50：50為流動相;在檢測波長350nm，柱溫30°C；流速為1.0ml/min的條件下進樣20.0ul。記錄峰面積，得直線回歸方程為Y=33578.22C-11.807（Y代表峰面積，C代表木犀草素濃度mg/ml），R2=0.9997；木犀草素在0.02?0.1mg/ml范圍內呈良好的線性關系。2.2上柱樣品的制備用20倍量的50%乙醇超聲浸提黃酮后，將提取液濃縮，然后按照質量比（金銀花葉和聚酰胺粉的質量）為15：1的比例混入聚酰胺（80?100目）粉，使其保持松散，不結塊，將此固體粉末取出，放在索氏提取器中用石油醚回流脫色10次后，取出此固體粉末，揮干石油醚，即得黃酮粗品拌料，然后經過物料比（黃酮粗品拌料與大孔樹脂質量比）為1：6,柱徑與柱長比為1：6的HPD100型大孔樹脂柱進一步分離富集，先用2倍柱體積的蒸餾水洗掉蛋白和糖類等大分子雜質，再用70%的乙醇以最大流速洗脫，收集2?8倍柱體積的洗脫液，濃縮后得到樣品。2.3聚酰胺柱的裝填把一定量的聚酰胺用水浸泡24h，濕法裝柱，然后用甲醇以3BV/h的流速洗滌聚酰胺，至流出液澄清為至，再用蒸餾水洗至無甲醇。2.4木犀草素產品的分離純化樣品上柱后開始洗脫，先用水洗去糖、蛋白分子及其它水溶性雜質，然后采用30%，50%，70%的醇溶液梯度洗脫，采用30%和50%的醇梯度洗脫時，柱中開始有淡粉色和黃色色帶出現(xiàn)，隨著洗脫的進行，淡粉色色帶變得模糊，黃色色帶開始緩慢下移。當兩個色帶拉開一段距離后，改用70%的醇洗脫，黃色色帶下移的速度加快，收集此色帶從開始到流完的洗脫液，每50ml一接，記為1?9瓶。以醋酸乙酯：乙酸：水=1：1：1為聚酰胺薄層色譜展開劑，對1?9瓶的洗脫液初步檢驗，發(fā)現(xiàn)薄層板上呈現(xiàn)單點，而且此點的Rf值和木犀草素標準點的Rf值相同。然后每3瓶一合并，蒸干即可得到3個不同純度的木犀草素產品，記為1號，2號，3號。用甲醇對1號，2號，3號進行重結晶，得到木犀草素產品1，2，3。3結果對1號、2號、3號木犀草素產品進行定性鑒定和定量分析。3.1定性分析3.1.1顏色反應分別取3個等級的少量產品溶解在甲醇中，得到的溶液滴于濾紙上，在紫外燈下呈現(xiàn)深紫色，用氨水熏后，在紫外燈下觀察，呈現(xiàn)黃色，這和木犀草素標準品的斑點顯色一致。3.1.2高效液相色譜法的鑒定把上述得到的木犀草素產品用“2.1”項的流動相溶解，定容至25ml容量瓶中，對此溶液在“2.1”項條件下進行高效液相色譜分析（以產品2為例進行說明），發(fā)現(xiàn)：①整個過程中，產品色譜圖呈現(xiàn)單峰，而且此峰的保留時間和木犀草素標準品的保留時間一致，均為Rt=13.1min。②改變流動相，產品色譜峰的保留時間提早或者推后，并沒有發(fā)生拆分;③改變檢測波長為255,267,350nm，產品色譜峰沒有被拆分；④加入標準品木犀草素于產品溶液中，產品中加標前后的色譜圖如圖1?2，結果發(fā)現(xiàn)，產品加標后的色譜峰保留時間不變（和標準品的一致），只是峰增強了。圖1產品色譜圖圖2產品加標后色譜圖由以上色譜峰可見，此類產品中木犀草素的純度較高。3.1.3紫外圖譜法采用標準品木犀草素（結構如圖3）和樣品對照的方法進行紫外圖譜［3］鑒定。使用的移動劑為無水醋酸鈉和無水粉狀硼酸（均為AR級），在醋酸鈉存在下，硼酸能和黃酮體母核上所有鄰位二羥基螯合，生成絡合物，使得紫外光譜發(fā)生紅移。在醋酸鈉/硼酸存在下，B環(huán)有鄰位二羥基的黃酮及黃酮醇的帶I向長波移動12?30毫微米。移動劑的使用程序如下。①將產品的甲醇溶液在190?550mn波長范圍內進行紫外掃描，得到其吸收光譜圖。測完之后，再進行移動劑光譜的測定。②將粉末狀NaOAc直接加入到吸收池內新?lián)Q的產品的甲醇溶液中，直到池底出現(xiàn)2mm厚的NaOAc沉淀為止，搖勻測定液，測定。③測定完NaOAc圖譜后，直接往吸收池中加入H3BO3（加入量大約為NaOAc的一半），混合均勻后測定NaOAc/H3BO3圖譜。結果如圖4?7所示：圖3木犀草素結構圖圖4產品加入移動劑前后的UV圖譜由圖4所示，產品甲醇溶液的紫外圖譜中帶I的入max=346nm，帶II的入max=256nm，具有黃酮結構的兩個特征譜帶，加入醋酸鈉后，產品的紫外光譜帶II紅移了18nm，說明此化合物含有游離的7羥基，在醋酸鈉/硼酸存在下，產品的紫外光譜帶I紅移了20nm，據(jù)此說明此化合物B環(huán)有鄰位二羥基，即3'，4'-二羥基存在，而且從圖5,6,7也發(fā)現(xiàn)，它和標準品的色譜峰重合的相對較好，是純度較高的木犀草素產品。圖5標品和產品的UV圖譜圖6標品和產品中加入醋酸鈉后的UV圖譜3.1.4紅外圖譜法分別取產品2和標準品的固體粉末0.5?2mg，在瑪瑙研缽中研細，再加入100?200mg磨細干燥的KBr粉末，混合均勻后，加入壓膜內，在壓力機中邊抽氣邊加壓，制成一定直徑及厚度的透明片，然后將此薄片放入儀器光束中測定，得到的譜圖如圖8所示。圖7標品和產品中加入醋酸鈉和硼酸后的UV圖譜圖8樣品的IR圖譜通過比較標品和產品的IR圖譜發(fā)現(xiàn)，它們吻合的較好，其中在3380，3294cm-1為羥基吸收峰，1671cm-1為羰基吸收峰，1613，1554，1521cm-1為苯環(huán)碳骨架吸收峰。3.2定量分析運用高效液相色譜法對3個產品1號，2號，3號進行定量分析。分別稱取一定量的3種產品，用“2.1”中的流動相（甲醇:0.02%磷酸=50:50）溶解定容后，在“2.1”色譜條件下測其峰面積，對照測定木犀草素標準曲線，按照外標法測定其中木犀草素的量，然后分別計算產品中木犀草素純度和產品得率，公式如式①和②所示。結果見表1。產品中木犀草素純度（%）=產品的質量產品中木犀草素質量X100%式①產品得率二產品質量金銀花針的質量式②表1聚酰胺柱分離后的產品4討論本實驗采用聚酰胺柱［4,5］進一步分離，聚酰胺分子中含有極性酰胺基團和非極性的脂肪鍵。作為一個相對弱極性的化合物，當移動相為強極性的溶劑（如水等）時，聚酰胺作為非極性固定相，其層析行為類似反相分配層析，極性較大的吸附物易被洗脫。隨著洗脫劑極性降低，極性較小的化合物相繼被洗脫下來。所以，利用聚酰胺作為層析柱填料，可使一定極性范圍的某類物質得以分離精制。采用聚酰胺柱進行分離，嘗試采用70%的乙醇等度洗脫，發(fā)現(xiàn)柱中沒有出現(xiàn)明顯的色帶，收集洗脫液，用聚酰胺薄層跟蹤分析，發(fā)現(xiàn)薄層板上呈自上而下的一系列點，無木犀草素的單點出現(xiàn)。洗脫劑選擇不合適，洗脫能力可能過強，把木犀草素和其它物質一起沖下來，沒有達到分離的目的。接著使用洗脫能力稍微弱一些的50%的乙醇作為洗脫劑等度洗脫，洗脫時間加長，但是仍然不能把木犀草素和其它雜質分離開來，由上可見，在聚酰胺柱上采用等度洗脫不適用。參考文獻楊敏麗，王麗婷.金銀花不同品種及不同部位木犀草素含量的比較[J].中華中醫(yī)藥雜志，2007，22(10)：666.王麗婷，楊敏麗.高效液相色譜法同時測定金銀花及葉中的黃酮類物質[