動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展

組織培養(yǎng)技術(shù)是19世紀(jì)末的一項(xiàng)原材料技術(shù)。近一個(gè)世紀(jì),從能維持組織存活到生長(zhǎng)出新細(xì)胞,從少數(shù)組織到各種組織細(xì)胞的培養(yǎng),從精細(xì)的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)技術(shù)到大規(guī)模的生產(chǎn)工藝,組織培養(yǎng)技術(shù)已成為生物制品制備以及基因工程等領(lǐng)域必不可少的工具之一。隨著生物制品需求的不斷增加,動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)已向著大型化、自動(dòng)化、精細(xì)化的方向發(fā)展。本文就近年來(lái)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)有關(guān)的微載體、氧供應(yīng)及無(wú)血清培養(yǎng)等問(wèn)題作一文獻(xiàn)回顧。使用微載體培養(yǎng)細(xì)胞傳統(tǒng)的貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)是通過(guò)靜止或轉(zhuǎn)瓶等培養(yǎng)來(lái)獲得,操作繁復(fù),且耗費(fèi)空間及人力。1967年,vanWezel首先提出了“微載體”培養(yǎng)系統(tǒng),為貼壁依賴性細(xì)胞的高產(chǎn)培養(yǎng)提出了一個(gè)新概念。經(jīng)過(guò)幾十年的研究,微載體培養(yǎng)已廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng),其中尤以Pharmacia生物技術(shù)公司生產(chǎn)的微載體(Cytodex、Cytopore和Cytoline等)使用范圍最廣。微載體培養(yǎng)是細(xì)胞在由葡聚糖制成的小球表面成單層生長(zhǎng),通過(guò)輕輕攪拌使細(xì)胞維持懸浮狀態(tài)。這種培養(yǎng)較傳統(tǒng)的單層細(xì)胞培養(yǎng),面積大大增加。如5mgCytodex1表面積能達(dá)到30cm2/ml,而傳統(tǒng)的單層細(xì)胞培養(yǎng)難以達(dá)到如此高的表面積/容積比(佩特里培養(yǎng)皿約為4cm2/ml)。如將這種微載體在流化床式、固定床式反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng),則可獲得比原來(lái)多20~50倍的高密度細(xì)胞。另外,這種培養(yǎng)對(duì)勞動(dòng)力的需求下降,1升微載體培養(yǎng)生產(chǎn)的細(xì)胞相當(dāng)于50個(gè)轉(zhuǎn)瓶(490cm2/瓶)所生產(chǎn)的細(xì)胞,省卻了玻璃容器等的清洗和準(zhǔn)備工作。而且細(xì)胞與培養(yǎng)液的分離簡(jiǎn)單,一旦攪拌停止,3分鐘后細(xì)胞即能依靠其重力而沉淀,只要去除上清液,而無(wú)須進(jìn)行離心操作。減少了繁復(fù)的操作步驟,降低了污染率。目前,狂犬病毒精制滅活疫苗就是采用Cytodex培養(yǎng)Vero細(xì)胞而進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的。但是,微載體使用量的增加并不意味著能增加細(xì)胞產(chǎn)量。過(guò)去有人報(bào)道,當(dāng)DEAE-SephadexA-50微載體超過(guò)1—2mg/ml時(shí),毒性增加,細(xì)胞產(chǎn)量卻未達(dá)到比例增長(zhǎng)。其毒性表現(xiàn)為3方面,即培養(yǎng)初期的細(xì)胞破壞、長(zhǎng)延滯期及有限的細(xì)胞飽和濃度。對(duì)此,Levine認(rèn)為此毒性可能是由于細(xì)胞微環(huán)境的過(guò)度離子交換所致,因?yàn)橐话阄⑤d體如Cytodex1、Cytodex2,為了便于細(xì)胞吸附和生長(zhǎng),其表面都具有特殊的小電荷分子。為了緩解上述毒性反應(yīng),Pharmacia生物技術(shù)公司又制成Cytodex3,即在微載體的表面覆蓋一層膠原蛋白,以更接近機(jī)體內(nèi)環(huán)境。這種微載體細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)快,且能長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)。通常,運(yùn)用微載體培養(yǎng)常需加上輕微的攪拌。攪拌能使微載體處于懸浮狀態(tài),利于細(xì)胞在其表面充分生長(zhǎng),形成均一的培養(yǎng)環(huán)境,也可避免因細(xì)胞過(guò)分生長(zhǎng)而引起的微載體凝集,促進(jìn)氣—液間的氣體交換。但如攪拌速度過(guò)快,對(duì)細(xì)胞的剪切力增加,將影響細(xì)胞的產(chǎn)量。有人對(duì)氣液界面氣泡對(duì)微載體培養(yǎng)的影響進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)不論是否帶有細(xì)胞,微載體極易吸附到氣液界面,由于流體動(dòng)力學(xué)的關(guān)系,當(dāng)微載體隨著氣泡上升時(shí),細(xì)胞很容易與微載體分離。大多孔微載體Cytopore的發(fā)明,則克服了上述弊端。這種微載體以纖維素為基質(zhì),內(nèi)部有許多網(wǎng)狀的相互連通的小孔通向載體表面,細(xì)胞在接種后,易于進(jìn)入微載體內(nèi)部生長(zhǎng)分裂,以避免剪切力或氣泡的影響,即使大部分細(xì)胞免受機(jī)械損傷,又為細(xì)胞提供了充分的生長(zhǎng)空間。這樣就意味著允許供氣量及攪拌速度增加,允許使用高濃度的微載體,使表面積進(jìn)一步增加。Onderwater等報(bào)道,使用大多孔微載體培養(yǎng)能表達(dá)人類細(xì)胞色素P450同功酶的V79細(xì)胞,細(xì)胞量從接種時(shí)的2×105/ml,增加到六天后的1×107/ml。ZhaolieC等用多孔微載體Cytopore培養(yǎng)重組CHO細(xì)胞系4B3,最高細(xì)胞密度達(dá)到8.83×106/ml。胡顯文等將Cytopore多孔微載體用于中試規(guī)模的反應(yīng)器,也收到了很好的效果。另外,由聚乙烯和二氧化硅制成的微載體Cytoline,則適用于貼壁依賴性及非貼壁依賴性細(xì)胞的流床或灌注培養(yǎng)。雖然這些載體還存在某些不足,如成本高、制作工藝復(fù)雜、部分微載體不能重復(fù)使用等,但隨著新的微載體制作材料的開發(fā)及對(duì)其結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)改進(jìn),這種載體的優(yōu)勢(shì)日漸顯露。HyClone公司生產(chǎn)的CultiSpher-S以明膠為基質(zhì)而制成,具有表面積大、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、耐高壓滅菌、易于消化分離細(xì)胞等特點(diǎn),為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)帶來(lái)了更多的方便。培養(yǎng)基氧張力的控制細(xì)胞培養(yǎng)的理化環(huán)境至關(guān)重要,有關(guān)乳酸、氨、CO2等對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的抑制作用報(bào)道較多,在此不再贅述,僅就供氧作一些介紹。供氧作為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不可缺少的條件,歷來(lái)受到重視。Kilbum等早在1968年就報(bào)道了鼠LS細(xì)胞在控制與不控制氧分壓的情況下出現(xiàn)的不同的細(xì)胞生長(zhǎng)。當(dāng)不控制培養(yǎng)基氧分壓時(shí),氣相的氧分壓從培養(yǎng)起始的160mmHg,下降到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的120mmHg。而培養(yǎng)基中的氧分壓則從接種后的160mmHg明顯下降到140mmHg,接著幾乎立即下降,至兩天半后進(jìn)入無(wú)氧狀態(tài),3.8天后培養(yǎng)基中的氧分壓才又開始上升。因此,在延長(zhǎng)的無(wú)氧期,細(xì)胞繁殖受到了限制。接著,作者對(duì)培養(yǎng)基的氧分壓進(jìn)行了控制,從1.6mmHg到320mmHg,細(xì)胞存活量可達(dá)最大,為1.2×106/ml,這比不控制氧分壓所獲得的高50%,同時(shí)發(fā)現(xiàn),最佳的培養(yǎng)基氧分壓范圍為40~100mmHg?？梢?正確的氧氣供應(yīng)是細(xì)胞獲得高產(chǎn)的重要因素。然而,動(dòng)物細(xì)胞對(duì)氧的需求可有很大差異。靜止的單層細(xì)胞培養(yǎng)常處于相對(duì)無(wú)氧狀態(tài),許多建株細(xì)胞系(establishedcelllines)的培養(yǎng)與此相似,因而無(wú)須很高的氧張力;原代細(xì)胞則需在有氧的培養(yǎng)條件下進(jìn)行,且氧張力須與組織中的狀態(tài)相似;正常二倍體細(xì)胞所需的氧張力介于二者之間。一般,氧張力多對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。當(dāng)培養(yǎng)密度較低時(shí),低氧分壓(1—6%)適合于正常二倍體細(xì)胞株和建株細(xì)胞系的生長(zhǎng)。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,氧張力常需提高:適合于L-細(xì)胞生長(zhǎng)的氧分壓是9%,因?yàn)榇藭r(shí)氨的積聚最少;適合于人二倍體細(xì)胞生長(zhǎng)的氧分壓低于5%;鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)則以20%為宜。但氧張力并非越高越好,過(guò)高對(duì)細(xì)胞具有毒性作用,從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。一般來(lái)說(shuō),氣液之間,通過(guò)擴(kuò)散來(lái)交換氣體的過(guò)程相對(duì)較慢,攪拌微載體培養(yǎng)則成為改善氣體交換的一個(gè)重要途徑。但由于目前設(shè)計(jì)的反應(yīng)器攪拌速度低,導(dǎo)致氣體交換率下降。因此,當(dāng)攪拌速度低于30rpm時(shí),或在細(xì)胞培養(yǎng)晚期,一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞產(chǎn)量較預(yù)期低或生長(zhǎng)率突然下降,應(yīng)考慮改善氣體的供應(yīng)。方法有:(1)連續(xù)供氣,比例為95%空氣∶5%CO2;(2)通過(guò)使用含高濃度氧的混合氣體增加培養(yǎng)基氣相的氣體張力;(3)提高攪拌速度,根據(jù)細(xì)胞類型及其融合程度可提高25—50%;(4)新的培養(yǎng)基可經(jīng)適當(dāng)供氣,再送入反應(yīng)器,這是培養(yǎng)基獲得高張力氧的簡(jiǎn)單方法;(5)培養(yǎng)基通過(guò)反應(yīng)器外的氣體交換裝置再循環(huán)。反應(yīng)器氧張力的控制主要通過(guò)浸入培養(yǎng)液的電極發(fā)出信號(hào)來(lái)完成。常用的供氧控制方法有:(1)脈沖式直接噴霧供氧。該技術(shù)較穩(wěn)定,雖可引起細(xì)胞損傷,但由于其供氧能力強(qiáng),仍是細(xì)胞培養(yǎng),尤其是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)所不可缺少的工具,適用于對(duì)剪切力抗性較強(qiáng)的細(xì)胞。有人提出,如培養(yǎng)基中加入具有保護(hù)濃度的血清或PluronicF68,則損傷作用會(huì)有所緩和。(2)使用多孔硅膠管供氧。此法是使氧氣由硅管內(nèi)向管外的培養(yǎng)液中擴(kuò)散,不易產(chǎn)生氣泡,氧氣供給速度不受管內(nèi)氣體的流速及培養(yǎng)槽攪拌速度的影響。但硅管的厚度及其兩側(cè)的濃度梯度是重要的影響因素。(3)使用多孔特氟隆管供氧。疏水性多孔特氟隆(聚四氟乙烯)管是使管內(nèi)的孔形成氣體狀的氧而擴(kuò)散,并與培養(yǎng)液形成氣-液界面,直接溶解于培養(yǎng)液。只要保持管內(nèi)適當(dāng)?shù)膲毫?就可使此界面在管外形成,維持氧氣的移動(dòng)。但此法還有待于最佳材料的開發(fā)。另外,如管內(nèi)壓力過(guò)高,管表面有可能產(chǎn)生氣泡;管內(nèi)壓力過(guò)低,則液體有可能浸入?？刂乒軆?nèi)的壓力將是關(guān)鍵。特殊的生物活性培養(yǎng)基通常,動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)均有賴于血清的存在,在普通培養(yǎng)基中,如不加血清,絕大部分細(xì)胞將不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潛在的污染源、不同批間蛋白含量差異大及價(jià)格高等,給生物制品的生產(chǎn)造成了不利。這就引發(fā)了人們對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),只要在培養(yǎng)基中增加某些適于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分,如纖連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和表皮生長(zhǎng)因子等,不少細(xì)胞即能在無(wú)血清供應(yīng)的情況下生長(zhǎng),尤其是CHO、雜交瘤及重組骨髓瘤細(xì)胞等。其中胰島素是無(wú)血清培養(yǎng)基中促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的最重要的多肽。CHO細(xì)胞能在僅含重組人胰島素一種蛋白成分的無(wú)血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代。在人類細(xì)胞培養(yǎng)中,應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基還能有選擇性地控制及避免成纖維細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)。某些細(xì)胞在無(wú)血清的條件下,其生長(zhǎng)和抗體的產(chǎn)量甚至較有血清培養(yǎng)時(shí)高出數(shù)倍。另外,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基的成功,還將為某些疫苗的生產(chǎn)降低成本。但無(wú)血清培養(yǎng)基并不適用于所有的細(xì)胞,一般細(xì)胞須經(jīng)適應(yīng),且倍增時(shí)間延長(zhǎng)。培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的改變也能影響細(xì)胞對(duì)激素的反應(yīng)。Barnes等發(fā)現(xiàn),Hela細(xì)胞對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基中所含的胰島素、氫化考的松等的需要可因選用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液不同而有所差異。另外,由于培養(yǎng)基中所添加的蛋白主要來(lái)源于動(dòng)物或人,仍然存在病毒污染的危險(xiǎn)。因此,只有完全采用非動(dòng)物來(lái)源的材料,才是相對(duì)安全的,而植物提取物