動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的研究進展

動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的研究進展

組織培養(yǎng)技術(shù)是19世紀末的一項原材料技術(shù)。近一個世紀,從能維持組織存活到生長出新細胞,從少數(shù)組織到各種組織細胞的培養(yǎng),從精細的實驗室培養(yǎng)技術(shù)到大規(guī)模的生產(chǎn)工藝,組織培養(yǎng)技術(shù)已成為生物制品制備以及基因工程等領(lǐng)域必不可少的工具之一。隨著生物制品需求的不斷增加,動物細胞的培養(yǎng)技術(shù)已向著大型化、自動化、精細化的方向發(fā)展。本文就近年來動物細胞培養(yǎng)技術(shù)有關(guān)的微載體、氧供應(yīng)及無血清培養(yǎng)等問題作一文獻回顧。使用微載體培養(yǎng)細胞傳統(tǒng)的貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)是通過靜止或轉(zhuǎn)瓶等培養(yǎng)來獲得,操作繁復(fù),且耗費空間及人力。1967年,vanWezel首先提出了“微載體”培養(yǎng)系統(tǒng),為貼壁依賴性細胞的高產(chǎn)培養(yǎng)提出了一個新概念。經(jīng)過幾十年的研究,微載體培養(yǎng)已廣泛地應(yīng)用于動物細胞的培養(yǎng),其中尤以Pharmacia生物技術(shù)公司生產(chǎn)的微載體(Cytodex、Cytopore和Cytoline等)使用范圍最廣。微載體培養(yǎng)是細胞在由葡聚糖制成的小球表面成單層生長,通過輕輕攪拌使細胞維持懸浮狀態(tài)。這種培養(yǎng)較傳統(tǒng)的單層細胞培養(yǎng),面積大大增加。如5mgCytodex1表面積能達到30cm2/ml,而傳統(tǒng)的單層細胞培養(yǎng)難以達到如此高的表面積/容積比(佩特里培養(yǎng)皿約為4cm2/ml)。如將這種微載體在流化床式、固定床式反應(yīng)器中進行培養(yǎng),則可獲得比原來多20~50倍的高密度細胞。另外,這種培養(yǎng)對勞動力的需求下降,1升微載體培養(yǎng)生產(chǎn)的細胞相當于50個轉(zhuǎn)瓶(490cm2/瓶)所生產(chǎn)的細胞,省卻了玻璃容器等的清洗和準備工作。而且細胞與培養(yǎng)液的分離簡單,一旦攪拌停止,3分鐘后細胞即能依靠其重力而沉淀,只要去除上清液,而無須進行離心操作。減少了繁復(fù)的操作步驟,降低了污染率。目前,狂犬病毒精制滅活疫苗就是采用Cytodex培養(yǎng)Vero細胞而進行大規(guī)模生產(chǎn)的。但是,微載體使用量的增加并不意味著能增加細胞產(chǎn)量。過去有人報道,當DEAE-SephadexA-50微載體超過1—2mg/ml時,毒性增加,細胞產(chǎn)量卻未達到比例增長。其毒性表現(xiàn)為3方面,即培養(yǎng)初期的細胞破壞、長延滯期及有限的細胞飽和濃度。對此,Levine認為此毒性可能是由于細胞微環(huán)境的過度離子交換所致,因為一般微載體如Cytodex1、Cytodex2,為了便于細胞吸附和生長,其表面都具有特殊的小電荷分子。為了緩解上述毒性反應(yīng),Pharmacia生物技術(shù)公司又制成Cytodex3,即在微載體的表面覆蓋一層膠原蛋白,以更接近機體內(nèi)環(huán)境。這種微載體細胞貼壁、生長快,且能長時間培養(yǎng)。通常,運用微載體培養(yǎng)常需加上輕微的攪拌。攪拌能使微載體處于懸浮狀態(tài),利于細胞在其表面充分生長,形成均一的培養(yǎng)環(huán)境,也可避免因細胞過分生長而引起的微載體凝集,促進氣—液間的氣體交換。但如攪拌速度過快,對細胞的剪切力增加,將影響細胞的產(chǎn)量。有人對氣液界面氣泡對微載體培養(yǎng)的影響進行了研究。發(fā)現(xiàn)不論是否帶有細胞,微載體極易吸附到氣液界面,由于流體動力學(xué)的關(guān)系,當微載體隨著氣泡上升時,細胞很容易與微載體分離。大多孔微載體Cytopore的發(fā)明,則克服了上述弊端。這種微載體以纖維素為基質(zhì),內(nèi)部有許多網(wǎng)狀的相互連通的小孔通向載體表面,細胞在接種后,易于進入微載體內(nèi)部生長分裂,以避免剪切力或氣泡的影響,即使大部分細胞免受機械損傷,又為細胞提供了充分的生長空間。這樣就意味著允許供氣量及攪拌速度增加,允許使用高濃度的微載體,使表面積進一步增加。Onderwater等報道,使用大多孔微載體培養(yǎng)能表達人類細胞色素P450同功酶的V79細胞,細胞量從接種時的2×105/ml,增加到六天后的1×107/ml。ZhaolieC等用多孔微載體Cytopore培養(yǎng)重組CHO細胞系4B3,最高細胞密度達到8.83×106/ml。胡顯文等將Cytopore多孔微載體用于中試規(guī)模的反應(yīng)器,也收到了很好的效果。另外,由聚乙烯和二氧化硅制成的微載體Cytoline,則適用于貼壁依賴性及非貼壁依賴性細胞的流床或灌注培養(yǎng)。雖然這些載體還存在某些不足,如成本高、制作工藝復(fù)雜、部分微載體不能重復(fù)使用等,但隨著新的微載體制作材料的開發(fā)及對其結(jié)構(gòu)的設(shè)計改進,這種載體的優(yōu)勢日漸顯露。HyClone公司生產(chǎn)的CultiSpher-S以明膠為基質(zhì)而制成,具有表面積大、熱穩(wěn)定性強、耐高壓滅菌、易于消化分離細胞等特點,為動物細胞培養(yǎng)帶來了更多的方便。培養(yǎng)基氧張力的控制細胞培養(yǎng)的理化環(huán)境至關(guān)重要,有關(guān)乳酸、氨、CO2等對細胞培養(yǎng)的抑制作用報道較多,在此不再贅述,僅就供氧作一些介紹。供氧作為動物細胞培養(yǎng)不可缺少的條件,歷來受到重視。Kilbum等早在1968年就報道了鼠LS細胞在控制與不控制氧分壓的情況下出現(xiàn)的不同的細胞生長。當不控制培養(yǎng)基氧分壓時,氣相的氧分壓從培養(yǎng)起始的160mmHg,下降到對數(shù)生長期的120mmHg。而培養(yǎng)基中的氧分壓則從接種后的160mmHg明顯下降到140mmHg,接著幾乎立即下降,至兩天半后進入無氧狀態(tài),3.8天后培養(yǎng)基中的氧分壓才又開始上升。因此,在延長的無氧期,細胞繁殖受到了限制。接著,作者對培養(yǎng)基的氧分壓進行了控制,從1.6mmHg到320mmHg,細胞存活量可達最大,為1.2×106/ml,這比不控制氧分壓所獲得的高50%,同時發(fā)現(xiàn),最佳的培養(yǎng)基氧分壓范圍為40~100mmHg。可見,正確的氧氣供應(yīng)是細胞獲得高產(chǎn)的重要因素。然而,動物細胞對氧的需求可有很大差異。靜止的單層細胞培養(yǎng)常處于相對無氧狀態(tài),許多建株細胞系(establishedcelllines)的培養(yǎng)與此相似,因而無須很高的氧張力;原代細胞則需在有氧的培養(yǎng)條件下進行,且氧張力須與組織中的狀態(tài)相似;正常二倍體細胞所需的氧張力介于二者之間。一般,氧張力多對細胞增殖產(chǎn)生影響。當培養(yǎng)密度較低時,低氧分壓(1—6%)適合于正常二倍體細胞株和建株細胞系的生長。在對數(shù)生長期,氧張力常需提高:適合于L-細胞生長的氧分壓是9%,因為此時氨的積聚最少;適合于人二倍體細胞生長的氧分壓低于5%;鼠神經(jīng)干細胞(NSC)則以20%為宜。但氧張力并非越高越好,過高對細胞具有毒性作用,從而抑制細胞生長。一般來說,氣液之間,通過擴散來交換氣體的過程相對較慢,攪拌微載體培養(yǎng)則成為改善氣體交換的一個重要途徑。但由于目前設(shè)計的反應(yīng)器攪拌速度低,導(dǎo)致氣體交換率下降。因此,當攪拌速度低于30rpm時,或在細胞培養(yǎng)晚期,一旦發(fā)現(xiàn)細胞產(chǎn)量較預(yù)期低或生長率突然下降,應(yīng)考慮改善氣體的供應(yīng)。方法有:(1)連續(xù)供氣,比例為95%空氣∶5%CO2;(2)通過使用含高濃度氧的混合氣體增加培養(yǎng)基氣相的氣體張力;(3)提高攪拌速度,根據(jù)細胞類型及其融合程度可提高25—50%;(4)新的培養(yǎng)基可經(jīng)適當供氣,再送入反應(yīng)器,這是培養(yǎng)基獲得高張力氧的簡單方法;(5)培養(yǎng)基通過反應(yīng)器外的氣體交換裝置再循環(huán)。反應(yīng)器氧張力的控制主要通過浸入培養(yǎng)液的電極發(fā)出信號來完成。常用的供氧控制方法有:(1)脈沖式直接噴霧供氧。該技術(shù)較穩(wěn)定,雖可引起細胞損傷,但由于其供氧能力強,仍是細胞培養(yǎng),尤其是大規(guī)模細胞培養(yǎng)所不可缺少的工具,適用于對剪切力抗性較強的細胞。有人提出,如培養(yǎng)基中加入具有保護濃度的血清或PluronicF68,則損傷作用會有所緩和。(2)使用多孔硅膠管供氧。此法是使氧氣由硅管內(nèi)向管外的培養(yǎng)液中擴散,不易產(chǎn)生氣泡,氧氣供給速度不受管內(nèi)氣體的流速及培養(yǎng)槽攪拌速度的影響。但硅管的厚度及其兩側(cè)的濃度梯度是重要的影響因素。(3)使用多孔特氟隆管供氧。疏水性多孔特氟隆(聚四氟乙烯)管是使管內(nèi)的孔形成氣體狀的氧而擴散,并與培養(yǎng)液形成氣-液界面,直接溶解于培養(yǎng)液。只要保持管內(nèi)適當?shù)膲毫?就可使此界面在管外形成,維持氧氣的移動。但此法還有待于最佳材料的開發(fā)。另外,如管內(nèi)壓力過高,管表面有可能產(chǎn)生氣泡;管內(nèi)壓力過低,則液體有可能浸入?？刂乒軆?nèi)的壓力將是關(guān)鍵。特殊的生物活性培養(yǎng)基通常,動物細胞的生長均有賴于血清的存在,在普通培養(yǎng)基中,如不加血清,絕大部分細胞將不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潛在的污染源、不同批間蛋白含量差異大及價格高等,給生物制品的生產(chǎn)造成了不利。這就引發(fā)了人們對無血清培養(yǎng)基的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),只要在培養(yǎng)基中增加某些適于細胞生長的成分,如纖連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和表皮生長因子等,不少細胞即能在無血清供應(yīng)的情況下生長,尤其是CHO、雜交瘤及重組骨髓瘤細胞等。其中胰島素是無血清培養(yǎng)基中促進動物細胞生長的最重要的多肽。CHO細胞能在僅含重組人胰島素一種蛋白成分的無血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代。在人類細胞培養(yǎng)中,應(yīng)用無血清培養(yǎng)基還能有選擇性地控制及避免成纖維細胞的過度生長。某些細胞在無血清的條件下,其生長和抗體的產(chǎn)量甚至較有血清培養(yǎng)時高出數(shù)倍。另外,動物細胞培養(yǎng)應(yīng)用無血清培養(yǎng)基的成功,還將為某些疫苗的生產(chǎn)降低成本。但無血清培養(yǎng)基并不適用于所有的細胞,一般細胞須經(jīng)適應(yīng),且倍增時間延長。培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的改變也能影響細胞對激素的反應(yīng)。Barnes等發(fā)現(xiàn),Hela細胞對無血清培養(yǎng)基中所含的胰島素、氫化考的松等的需要可因選用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液不同而有所差異。另外,由于培養(yǎng)基中所添加的蛋白主要來源于動物或人,仍然存在病毒污染的危險。因此,只有完全采用非動物來源的材料,才是相對安全的,而植物提取物