海兔毒素10抗腫瘤作用機制的研究進展

海兔毒素10抗腫瘤作用機制的研究進展

0生物活性化合物現在，腫瘤是威脅人類健康的最大殺手之一。我國癌癥每年新發(fā)病例約為200萬,因癌癥死亡人數高達140多萬,故腫瘤的治療藥物一直是基礎醫(yī)學和臨床研究的熱點課題,其中新藥的開發(fā)利用是重中之重。海洋生物資源豐富,異于陸地生物的生存環(huán)境,而且其肽類次級代謝產物結構特別,提供了不同于陸地生物的活性產物。經過多年研究,現已從多種海洋生物中,分離出了一系列的高活性抗腫瘤多肽,其多肽結構與陸生動植物肽類(多為糖肽)有很大區(qū)別,含有豐富的羥基酸、噻酚、D-型氨基酸與α-氨基酸,部分還含有烯鍵與炔鍵,這些組分均提高了肽類的生物活性及穩(wěn)定性。其中由4個氨基酸組成的線性小肽海兔毒素10(dolastatin10,D10)的抗癌活性最為明顯。目前D10及其衍生物已進入臨床研究階段。本文就D10的發(fā)現、結構特點與作用機制,D10及其衍生物的臨床療效及不良反應等進行綜述。1活性化合物的篩選早在上世紀70年代,Pettit等就開始開展對印度洋無殼軟體動物截尾海兔(Dolabellaauricularia)中抗腫瘤活性成分的研究,并發(fā)現海兔提取物可以延長P388白血病小鼠的壽命。但由于獲得的這種活性物質含量太低以及當時技術條件的限制,直到80年代才開始以小鼠白血病P388模型為篩選體系,對印度洋、太平洋等海域的海兔進行了系統的研究。用色譜技術對2噸原料進行近2萬次反復分離篩選,Pettit的研究組至今已鑒定出18個含有特殊氨基酸的較短鏈狀肽類化合物,命名為dolastatin1~18。其中抗腫瘤活性最強者為dolastatin10。在體外抗腫瘤篩選中,D10對P388和L1210白血病細胞、非霍奇金淋巴瘤細胞、B16黑色素瘤、小細胞肺癌細胞和人前列腺癌DU-145細胞都有較強的效果。由于取材不易,提取效率較低,Pettit的研究組對D10進行了全合成,這為進一步研究提供了材料。2s10是抗有絲分裂藥D10是由4個氨基酸組成的線性縮肽類天然細胞毒性蛋白,見圖1,含有9個不對稱碳原子,從氨基端開始依次是dolavaline(Dov)、valine、dolaisoleuine(Dil)、dolaproine(Dap)4種氨基酸及特異的可能從苯丙氨酸分離出來的伯胺dolaphenie(Doe)作為羧基端縮合而成,故有研究者稱其為5肽產物,相對分子質量為784。D10有一系列同分異構體,其中一些具有生物效應。D10是一種有效的抗有絲分裂藥,其抗腫瘤機制主要是通過與β微管蛋白的氨基酸殘基結合,影響新的異二聚體的加入,導致二聚體間的界面產生彎曲,累積后導致原來直纖絲彎曲,抑制微管的形成和聚合,并促使其解聚,同時阻礙微管蛋白依賴的GTP水解,阻礙細胞的有絲分裂,使細胞停滯在細胞間期,且對多種癌細胞有誘導凋亡作用,是一類來源于海洋生物的新型細胞生長抑制劑。進一步研究表明,D10可結合到微管蛋白上的根霉素/美登素交換GTP的結合位點,導致細胞阻滯在M期。在與其他抗有絲分裂藥物的比較發(fā)現,D10對細胞活性的抑制效果IC50=0.5nMol/L,約為長春堿(vinblastine)的40倍,根霉素(rhizoxin)的2倍,擬莖點霉毒素A(phomopsinA)的10000余倍,與美坦辛(maytansine,IC50=0.5nMol/L效果相當。研究還發(fā)現D10在細胞內的滯留時間比長春堿長很多。D10通過巰基與微管蛋白結合與擬莖點霉毒素A相似,但與長春堿和美坦辛不同。實驗研究表明D10是長春堿類藥物的非競爭性抑制劑,當將其與作用于微管的藥物長春堿合用時顯示協同作用。D10可以抑制彌漫性大細胞淋巴瘤細胞中凋亡信號通路關鍵蛋白bcl-2和p53蛋白的表達,誘導細胞凋亡。通過研究D10對黑色素瘤細胞染色體形態(tài)學、端粒聯合、誘導多倍性的影響,發(fā)現D10可能通過介導末端著絲粒的丟失,誘導染色體畸變從而抑制惡性黑色素瘤細胞生長。3dolain10及其衍生物的臨床應用3.1臨床試驗結果自1990年以來D10進入多種疾病的Ⅰ期臨床試驗,在隨后的Ⅱ期臨床試驗中,初步數據結果表明40%的患者出現中度的神經病變,伴隨骨髓抑制和靜脈炎等副作用。若患者本身有潛在的精神類疾病,副作用更為明顯,Kindler等用D10進行治療28例未接受化療的癌癥患者(12例胰腺癌和16例肝膽管癌,靜脈注射給藥劑量為400mg/m2。每間隔3周給藥1次,每2個周期治療后進行CT檢測。結果顯示:27例患者出現臨床效應,但不明顯。59%的患者表現為嗜中性粒細胞減少(3~4級),18%的患者表現為發(fā)熱。胰腺癌患者平均壽命約為5個月,經D10治療的患者有17%可存活1年。肝膽管癌患者的平均壽命為3個月,經D10治療29%的患者可存活1年。故認為D10對胰腺癌和肝膽管癌無特殊療效。同年,Perez等對已接受了1~2種化療的21例轉移性乳腺癌患者靜脈注射D10,劑量為400mg/m2,每3周一次,結果顯示其中有1例患者經過113天治療后獲得部分恢復,4例患者經過87天的治療,病情穩(wěn)定,但同時出現了嗜中性粒細胞減少癥(3~4級)。在其毒性可以接受的劑量范圍內,D10對乳腺癌的療效不明顯,因此不推薦應用于進一步的臨床治療。在D10針對軟組織肉瘤的Ⅱ期臨床試驗中療效亦不明顯。D10在對實體瘤的Ⅱ期臨床試驗中效果均不理想,并出現明顯的副作用,故未單獨用于臨床治療,可與其他抗癌藥物聯合使用。3.2tzt-1087對小鼠腫瘤細胞毒活性和血管毒性的作用由于D10在Ⅱ期臨床驗證中未獲得預期的結果,而且其化學結構復雜,低水溶性難以利用,D10衍生物的研究受到重視,如TZT-1027(auristatinPE)和auristatinPYE在臨床顯示出顯著的治療效果。TZT-1027是完全合成的D-10衍生物,用苯乙胺取代Doe單位,擴大了抗腫瘤譜。在細胞分裂期通過化學鍵連接到到微管蛋白上,干擾微管聚合及穩(wěn)定性,使細胞從G2期到M期的分化停滯,導致細胞凋亡。Watanabe等將TZT-1027與其他抗癌藥如紫杉醇、阿霉素和長春新堿分別作用于體內乳腺癌腫瘤模型,結果顯示TZT-1027的抗腫瘤活性明顯高于其他抗癌藥物。此外,TZT-1027也能通過抑制血管生成來破壞腫瘤中的血管殺滅腫瘤細胞。將TZT-1027作用于小鼠腫瘤模型3h后,在腫瘤的血管系統中血液流動受到阻礙,隨之發(fā)生繼發(fā)性血管斷裂壞死,導致腫瘤細胞因缺氧而死亡。TZT-1027的分子結構見圖2,對癌癥細胞表現出高效的細胞毒活性。在Ⅰ期臨床試驗中,Yamamoto等對早期軟組織肉瘤患者靜脈注射TZT-1027,檢測其最大耐受劑量,逐漸從0.3mg/m2增至2.1mg/m2,每周1次,3周為1個周期。結果顯示TZT-1027為安全、有效的抗癌藥物,血液毒性也在臨床控制范圍內。Horti等對小細胞肺癌進行的Ⅰ期臨床試驗中,發(fā)現TZT-1027的最大耐受量為4.8mg/m2,每3周注射1次。目前,TZT-1027已進入了Ⅱ期臨床試驗階段。AuristatinPYE是以吡啶基團取代D10的Doe單位,作用機制也是通過抑制微管的聚合,使其從G2期到M期分化停滯,導致腫瘤細胞凋亡。2005年以來,Shnyder等對auristatinPYE的細胞毒活性和機制做了深入研究,發(fā)現在μmol濃度范圍內,auristatinPYE能夠顯著抑制微管的聚合從而抑制腫瘤生長。為了進一步研究其作用機制,Shnyder等還觀察了auristatinPYE對人結腸癌模型體內和體外的效果,將auristatinPYE和D10分別作用于DLD-1和COLO2052種人類結腸癌細胞系,體外給藥96h后auristatinPYE對上述2種細胞的IC50分別為4.4nmol/L和1.2nmol/L,而D10均為0.3nmol/L,提示體外實驗中auristatinPYE的效果低于D10。但在體內試驗中,可以觀察到auristatinPYE給藥后的裸鼠體內腫瘤體積明顯縮小,其機制可能是血管抑制作用。臨床前研究的結果促進了進一步的臨床試驗。3.3半胱氨酸殘基偶聯隨著單抗藥物在癌癥治療中的應用,對D10衍生物與抗體的偶聯進行了更多的研究,并在抗癌治療的臨床試驗中顯示出良好的前景。目前,已進入Ⅱ期臨床試驗的有SGN-35(圖3)和CR011-vc-MMAE等,其中對SGN-35的研究較為詳細。SGN-35由含有D10衍生物的一甲基-auristatin-谷氨酸(monomethylauristatinE,MMAE)通過二肽交聯劑與抗CD30抗體(即cAC10)分子鏈內還原的半胱氨酸殘基偶聯,形成cAC10-Val-Cit-MMAE偶聯物,針對霍奇金病細胞中的CD30抗原和癌細胞中的LeY抗原。在動物體內實驗中,SGN-35的治療劑量和完全治愈劑量僅為最大耐受劑量的1/200。在對22名霍奇金病患者進行治療,劑量為1.2mg/kg,45%的患者達到部分緩解,其中23%完全消退,86%的患者治療后有好轉?，F已可以確定SGN-35具有最低限度的免疫原性,大多數患者可以接受至少6個月以上的治療。還有一些D10衍生物及其偶聯物正處于Ⅰ期臨床試驗階段。如MEDI-547,將一甲基-auristatin-苯丙氨酸(monomethylauristatinF,MMAF)和抗酪氨酸蛋白激酶受體EphA2的單抗1C1通過不裂解的交聯劑偶聯,又稱MEDI-547,可刺激半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7活化。EphA2在乳腺癌、前列腺癌、肺癌及多形性膠質母細胞瘤細胞上過度表達。在體外試驗中,MEDI-547能降低子宮內膜癌細胞系中Hec-1A和Ishikawa細胞活力,加速其凋亡。在體內試驗中,MEDI-547能誘導EphA2降解,能有效的抑制腫瘤的生長,抑制率達86%~88%,且能降低腫瘤的轉移率。在I期臨床試驗階段,對具有復發(fā)性或難治性實體瘤的成人,每3周1次或每周1次,以21天為1個循環(huán),以靜脈注射MEDI-547的最高劑量確定MEDI-547的安全性和耐受性,并可用于治療惡性腫瘤細胞有EphA2表達的患者。4單克隆抗體偶聯使用對臨床意