《合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的幾點思考

《合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的幾點思考

2007年10月，國家食品藥品監(jiān)督管理局（fda）發(fā)布了《合成多媒體藥物應(yīng)用技術(shù)指南》（以下簡稱“指南原則”）。該指南的出版對國內(nèi)合成多媒體藥物的開發(fā)和注冊起到了積極的指導(dǎo)和參考作用。由于合成多肽藥物一方面屬于化學(xué)藥物的范疇,另一方面其制備方法、結(jié)構(gòu)研究、質(zhì)量研究等都有著與其他化學(xué)藥物不同的特點,而且在合成多肽的某些研究領(lǐng)域(如立體結(jié)構(gòu)研究)仍存在一些技術(shù)難題,因此課題組將本指導(dǎo)原則定位于:在已有的指導(dǎo)原則基礎(chǔ)上,根據(jù)多肽藥物研究技術(shù)的最新進展,結(jié)合國內(nèi)對多肽藥物研究和評價的實踐經(jīng)驗,對合成多肽藥物藥學(xué)研究方面所涉及的特殊問題進行分析、總結(jié),提出合成多肽藥物各項藥學(xué)研究的一般要求。在具體內(nèi)容的表述上,本指導(dǎo)原則重點在于闡明合成多肽藥學(xué)研究的特點、提出研究需關(guān)注的問題,在內(nèi)容上偏重于原則性要求,同時也不再涉及與其他化學(xué)藥物基本一致的一般性研究內(nèi)容和技術(shù)要求。本文主要是結(jié)合藥品技術(shù)審評過程中遇到的一些共性問題就合成多肽藥物的結(jié)構(gòu)確證、質(zhì)量研究中的幾個關(guān)鍵問題對《合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》做進一步解讀。1不同長度多肽的結(jié)構(gòu)確證本指導(dǎo)原則對合成多肽結(jié)構(gòu)確證研究的表述比較充分,技術(shù)要求也較為明確。盡管指導(dǎo)原則提到了很多結(jié)構(gòu)研究方法,并對不同長度多肽的結(jié)構(gòu)確證提出了不同的要求,看上去較為繁雜,但是多肽結(jié)構(gòu)研究的目的是非常明確的,那就是“要說明其氨基酸組成和序列是否正確”,研究者需要緊緊圍繞這一核心目的開展研究工作。當然,從廣義角度來看,某些多肽的氨基酸序列還包含空間構(gòu)象問題。以下謹針對實際工作中經(jīng)常遇到的幾個常見問題進行解讀。1.1氨基酸序列與肽的連接順序在審評工作中會遇到個別研究者未進行合成多肽的氨基酸序列研究,其主要理由為該多肽采用固相合成工藝制備且氨基酸組成分析結(jié)果顯示其組成正確。實際上,氨基酸組成分析系用于說明多肽組成的正確性,而氨基酸序列研究則是直觀的說明多肽中氨基酸連接順序是否正確,兩者的研究目的不一致。而采用固相合成工藝只能是從側(cè)面、間接地說明氨基酸的連接順序,并不能獨立作為一項結(jié)構(gòu)確證性研究。因此,合成多肽結(jié)構(gòu)確證研究中必須包含氨基酸序列研究內(nèi)容,這也是FDA和EMEA的常規(guī)要求。氨基酸序列研究方法既包括通常采用的Edman降解,對于一些短肽有時也可采用質(zhì)譜、核磁共振譜等來說明其序列。另外,本指導(dǎo)原則還明確說明,對于一些不能直接確定序列的多肽可采用內(nèi)切酶先將多肽裂解成小片段、再分析各片段序列的方法。1.2短肽、中肽、長肽的內(nèi)涵本指導(dǎo)原則分別針對短肽和中、長肽的結(jié)構(gòu)確證研究提出了建議和要求,質(zhì)量研究部分也有類似的表述。但是如何界定短肽和中、長肽?指導(dǎo)原則中并未給出準確定義。這一問題是本指導(dǎo)原則起草過程中爭論最多的問題之一。課題組在本指導(dǎo)原則起草和征求意見過程中咨詢了大量專家和業(yè)界代表,均未能得到明確意見,有的認為5個氨基酸殘基以下算短肽,有的認為是8個氨基酸,有些則認為20個氨基酸以下均為短肽。另外,目前國內(nèi)外權(quán)威專業(yè)書籍、論著也均未能準確定義短肽、中肽、長肽的長度。因此,本指導(dǎo)原則暫未對“短肽”、“中肽”、“長肽”的長度進行定義,而是采用原則性的表述方式。本指導(dǎo)原則針對不同長度多肽的結(jié)構(gòu)研究多采用原則性、建議性的表述方式,也并未完全按照多肽的長短嚴格區(qū)分相關(guān)技術(shù)要求,評價的關(guān)鍵是研究結(jié)果是否能充分確證其結(jié)構(gòu)。例如,對于短肽,指導(dǎo)原則表述為“采用一般有機化合物常用的結(jié)構(gòu)研究方法例如元素分析、紅外光譜、核磁共振譜、質(zhì)譜等,結(jié)合理化常數(shù)測定、化學(xué)純度和光學(xué)純度分析等,有時就足以說明其結(jié)構(gòu)特征”。但是,如果上述研究方法尚不能說明多肽組成和序列的正確性,指導(dǎo)原則同樣要求“進行氨基酸序列測定”。1.3指導(dǎo)原則中的多肽結(jié)構(gòu)研究多肽的空間結(jié)構(gòu)研究也是業(yè)界非常關(guān)注的一個問題。課題組針對該問題進行了充分地討論并廣泛征求了意見,基本的觀點為:一些長肽需要具有一定的空間結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮活性,應(yīng)開展空間結(jié)構(gòu)研究,但研究工作難度較大,目前多為研究、試驗性方法?；谏鲜稣J識,課題組認為指導(dǎo)原則中應(yīng)明確提出多肽的空間結(jié)構(gòu)研究,但其技術(shù)要求又不能超越現(xiàn)階段的技術(shù)能力。因此,本指導(dǎo)原則關(guān)于多肽空間結(jié)構(gòu)研究部分同樣采用了原則性表述方式。需要注意的是,原則性表述并不代表沒有要求。在實際工作中,如果已經(jīng)有文獻報道、試驗研究顯示某一多肽或其類似物需要維持一定空間結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮作用,那么研究者必須開展相應(yīng)的空間結(jié)構(gòu)研究。2主要內(nèi)容和相關(guān)要求質(zhì)量研究是藥品注冊研究的核心內(nèi)容之一,合成多肽類藥物也不例外,因此本指導(dǎo)原則用了大量的篇幅來闡述多肽藥物質(zhì)量研究的主要內(nèi)容和相關(guān)要求。總結(jié)來說,合成多肽藥物的質(zhì)量研究一方面要參考一般化學(xué)藥物的質(zhì)量研究內(nèi)容和研究思路,另一方面還必須結(jié)合合成多肽的結(jié)構(gòu)特征、工藝特點和生物學(xué)特性等進行針對性的研究。本文重點是對合成多肽藥物質(zhì)量研究中具有多肽特色的部分內(nèi)容進行解讀,同時基于合成多肽制劑及其質(zhì)量研究的特點,本部分主要針對合成多肽原料藥的質(zhì)量研究工作進行論述。2.1合成多肽藥物的研究重點合成多肽原料藥的質(zhì)量研究除參考一般化學(xué)藥物的研究思路進行常規(guī)項目的研究外,還應(yīng)根據(jù)合成多肽的結(jié)構(gòu)特征、制備工藝特點和生物學(xué)特點等進行針對性的研究,研究項目(原料藥)一般包括:外觀性狀、理化常數(shù)、鑒別、氨基酸組成分析、水分、反離子含量、多肽純度、有機溶劑和反應(yīng)試劑殘留量、生物學(xué)安全性檢查、多肽含量或活性效價測定等,這其中以下幾項研究內(nèi)容由于與普通化學(xué)藥物有所不同需要研究者特別關(guān)注:①合成多肽藥物必須進行氨基酸組成分析,要求訂入質(zhì)量標準并建議參照USP或EP中同類產(chǎn)品的標準嚴格擬訂各氨基酸的限度,穩(wěn)定氨基酸的組成通常應(yīng)在理論值的90%～100%范圍內(nèi)。②合成多肽的理化常數(shù)研究應(yīng)關(guān)注等電點、溶解性等項目,其中進行溶解性研究時溶劑一般采用水和不同pH值的緩沖液。③對于一些中長肽而言,相對于常規(guī)的化學(xué)方法和色譜方法,肽圖分析是具有很高專屬性的多肽鑒別方法。④合成多肽藥物通常以與一定反離子(通常為醋酸根)成鹽的形式存在,因此需要進行反離子含量研究并訂入質(zhì)量標準。反離子的含量要控制在一定限度范圍內(nèi),如10.0%～15.0%。⑤對某些多肽(如一些長肽、具有一定空間結(jié)構(gòu)的多肽),質(zhì)量研究內(nèi)容還需包括聚合體檢查、生物學(xué)安全性檢查、活性測定等,相關(guān)內(nèi)容下文將會重點介紹。2.2合成多肽過程中易出現(xiàn)的問題有關(guān)物質(zhì)(對于多肽藥物通常也稱為相關(guān)肽)研究是合成多肽藥物藥學(xué)研究的一項重要內(nèi)容,由于合成多肽本身結(jié)構(gòu)、合成工藝以及穩(wěn)定性方面的特殊性,這類藥物的有關(guān)物質(zhì)研究較為復(fù)雜、存在一定的難度,在實際審評工作中遇到的問題也最多。以下就根據(jù)指導(dǎo)原則的技術(shù)要求并結(jié)合注冊審評工作對合成多肽藥物有關(guān)物質(zhì)的特點、研究的難點和關(guān)注點進行解讀。2.2.1合成多媒體藥物的性質(zhì)和研究難度合成多肽的有關(guān)物質(zhì)主要為源于合成過程帶來的工藝雜質(zhì)和由于多肽不穩(wěn)定而產(chǎn)生的降解產(chǎn)物、聚合物等。2.2.1.合成多肽過程中雜質(zhì)的性質(zhì)和應(yīng)用盡管目前合成多肽的純化工藝已經(jīng)有了很大進步,但工藝雜質(zhì)仍是合成多肽有關(guān)物質(zhì)的重要來源,這主要是由于合成多肽的一些工藝雜質(zhì)(如缺失肽、斷裂肽、氧化肽、二硫鍵交換的產(chǎn)物等)與藥物本身的性質(zhì)可能非常近似,從而給純化造成了一定的難度。而且,不同的多肽合成方法也在很大程度上決定了終產(chǎn)品中雜質(zhì)的性質(zhì),例如液相合成和固相合成所引入的工藝雜質(zhì)就會明顯不同,固相合成中Boc合成法與Fmoc合成法所產(chǎn)生的雜質(zhì)也會有所差異,甚至不同的保護/脫保護策略都會帶來不同的工藝雜質(zhì)。因此,在進行合成多肽的有關(guān)物質(zhì)研究時,研究者必須結(jié)合自身的工藝特點對可能由此引入的雜質(zhì)有充分認識,從而才能夠建立有針對性的有關(guān)物質(zhì)研究方法。同時,這也意味著,對于仿制產(chǎn)品而言不能盲目照搬國家標準、已上市產(chǎn)品的有關(guān)物質(zhì)檢查方法,必須充分考慮到產(chǎn)品本身的工藝特點。2.2.1.合成多肽中的氨基酸多肽的化學(xué)穩(wěn)定性和物理穩(wěn)定性一般較差,因此降解產(chǎn)物、聚合物等是合成多肽有關(guān)物質(zhì)研究的主要對象之一。影響合成多肽穩(wěn)定性的因素包括脫酰胺、氧化、水解、二硫鍵錯配、消旋、β-消除、聚集等,研究顯示合成多肽中最常見的降解產(chǎn)物是脫酰胺產(chǎn)物、氧化產(chǎn)物、水解產(chǎn)物等。在組成多肽的各種氨基酸中,天冬酰胺、谷胺酰胺易于發(fā)生脫酰胺反應(yīng)(尤其是在pH值升高和高溫條件下);甲硫氨酸、半胱氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸最易氧化,對光照也較為敏感;天冬氨酸參與形成的肽鏈較易斷裂,尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽鍵。由于1個多肽分子中通常會含有多種不穩(wěn)定性的氨基酸殘基或肽鍵,因此合成多肽可能的降解機制和降解產(chǎn)物較為復(fù)雜。而多肽的聚集主要是由于疏水作用引發(fā)的,盡管目前還很難準確預(yù)測哪些多肽易發(fā)生聚集,但至少對于一些中長肽而言需對可能存在聚合物進行研究。綜上,由于結(jié)構(gòu)、合成工藝和穩(wěn)定性方面的特殊性,合成多肽中可能存在著大量性質(zhì)各不相同的工藝雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、聚合物,這就給合成多肽藥物的有關(guān)物質(zhì)研究帶來了很大的挑戰(zhàn)。除了合成多肽中雜質(zhì)不易定性、定量外,由于合成多肽中有些雜質(zhì)的性質(zhì)與終產(chǎn)品非常接近,有些雜質(zhì)的性質(zhì)又相差較大,建立適宜的方法充分檢出這些雜質(zhì)是合成多肽藥物有關(guān)物質(zhì)研究中的最大困難。2.2.2關(guān)于合成多媒體藥物的材料研究應(yīng)該注意以下幾點2.2.2.合成多肽的研究方法由于合成多肽中有關(guān)物質(zhì)的復(fù)雜性,且某一特定研究方法總會存在一定的局限性,因此對于合成多肽藥物、尤其是新合成多肽的有關(guān)物質(zhì)研究而言,通常需同時結(jié)合使用不同原理的方法進行有關(guān)物質(zhì)研究。一般認為,對合成多肽雜質(zhì)認知的程度與研究中使用的獨立技術(shù)的數(shù)量成正比。常見的合成多肽的有關(guān)物質(zhì)研究方法包括基于各種不同原理的高效液相色譜法(如反相HPLC法、離子交換HPLC法、分子排阻HPLC法)、毛細管電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)以及激光散射等。其中,反相HPLC法基于疏水性的分離機制,離子交換HPLC法依據(jù)多肽分子所帶電荷的差異,毛細管電泳的分離基礎(chǔ)是荷質(zhì)比。分子排阻HPLC法的分辨能力雖然較反相HPLC法低,但相對于其他HPLC方法而言較適用于聚合物的檢查。此外,激光散射法是目前測定多肽中聚合物的有效方法。2.2.2.梯度洗脫方法的檢查方法目前,反相HPLC法是最常用的合成多肽有關(guān)物質(zhì)研究方法。但是由于合成多肽中存在的有關(guān)物質(zhì)的性質(zhì)相差較大,采用簡單的等度洗脫的方法往往很難充分檢出產(chǎn)品中存在的各種有機雜質(zhì)。對于合成多肽類藥物,已有大量研究顯示采用梯度洗脫方法無論是檢出的雜質(zhì)個數(shù)還是檢出雜質(zhì)的含量均明顯高于等度洗脫方法。例如,在實際工作中遇到過一個按注冊分類3申報的多肽,最初采用自擬的等度洗脫方法檢查有關(guān)物質(zhì),可檢出2個雜質(zhì)峰,雜質(zhì)總量為0.3%(面積歸一化法),之后參照國外藥典改為梯度洗脫方法,檢出的雜質(zhì)峰數(shù)增加至5個,雜質(zhì)總量增至0.7%。目前,國外上市的合成多肽產(chǎn)品(醋酸丙氨瑞林、醋酸奧曲肽、特利加壓素、鮭降鈣素、生長抑素等)的有關(guān)物質(zhì)檢查方法多采用梯度洗脫方法。因此,采用反相HPLC法進行合成多肽有關(guān)物質(zhì)研究時應(yīng)盡量采用梯度洗脫方法,當然梯度程序的選擇應(yīng)以盡可能多的檢出雜質(zhì)為前提。2.2.2.強制降解試驗專屬性是評價雜質(zhì)研究方法的重要指標。目前,國內(nèi)很多研究者在對合成多肽有關(guān)物質(zhì)檢查方法的專屬性進行驗證的時候通常僅進行強制降解試驗。然而,由于雜質(zhì)來源的不同,合成多肽通常存在的工藝雜質(zhì)的檢查專屬性很難通過強制降解試驗進行驗證。因此除進行強制降解試驗外,研究者還應(yīng)采用精制純化前含有典型工藝雜質(zhì)的多肽粗品進行有關(guān)物質(zhì)研究方法的專屬性考察。采用多肽粗品進行研究除了能夠更加全面地驗證雜質(zhì)研究方法的專屬性外,還有助于考察多肽合成過程中精制純化工藝的合理性。2.3合成多肽的生物安全性問題本指導(dǎo)原則中所指的生物安全性檢查包括過敏試驗、降壓物質(zhì)、升壓物質(zhì)、異常毒性檢查以及長肽的免疫原性或抗原活性檢查等。在本指導(dǎo)原則起草過程中,對于是否要在指導(dǎo)原則中規(guī)定生物安全性檢查一直存在爭議。反對者認為,生物安全性檢查一般是針對由發(fā)酵或從動物組織提取得到的產(chǎn)品,這類產(chǎn)品純度不高,可能含有大量組胺乃至蛋白質(zhì)等組分而易導(dǎo)致風(fēng)險,而本指導(dǎo)原則只針對采用化學(xué)合成工藝制備的多肽,其雜質(zhì)含量明顯減少,應(yīng)該不會存在生物安全性問題。支持者則認為,盡管合成多肽的純度很高,但是基于其化學(xué)組成的特殊性,合成多肽尤其是長肽本身是否會產(chǎn)生生物安全性反應(yīng)尚不明確,而且合成多肽藥物多采用注射給藥,從嚴格控制風(fēng)險角度來講需要對這類藥物的生物安全性問題進行研究。課題組經(jīng)充分討論并廣泛征求專家和企業(yè)代表的意見,從控制風(fēng)險的角度出發(fā)并考慮到將來可能會有50個、100個甚至更多氨基酸殘基的合成多肽藥物出現(xiàn),最終將生物安全性研究寫入了指導(dǎo)原則,但采用了相對比較原則的表述方法:①純度檢查有時難以從根本上有效控制產(chǎn)品安全性,需要進行必要的生物學(xué)安全性檢查。②根據(jù)產(chǎn)品具體情況,對于長肽,有時尚需進行免疫原性或抗原活性等生物特性的研究。這種處理方式與現(xiàn)階段人們對合成多肽藥物的認識相符,回避了機械的剛性要求,無論對于研究者還是評價者都留下了一定的空間。例如,對于像奧曲肽這種上市多年、有大量臨床使用經(jīng)驗的合成多肽,人們對其安全性的認識較為充分,再進行一些動物體內(nèi)甚至體外的生物安全性研究的意義就不大了。但對于一個全新的多肽、尤其是長肽,進行上述研究還是很有必要的,有助于全面控制產(chǎn)品質(zhì)量、保證安全性,降低風(fēng)險。2.4活性的測定方法本指導(dǎo)原則要求“對于具有一定空間結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮其活性的多肽,需進行生物學(xué)方法或酶化學(xué)方法測定藥物活性(效價)的研究,包括含量與活性的關(guān)系、相應(yīng)的方法學(xué)驗證等”,這主要是考慮到對于這種具有一定空間結(jié)構(gòu)