聚賴氨酸的合成及應(yīng)用

聚賴氨酸的合成及應(yīng)用

食品腐敗和變質(zhì)主要是指由微生物作用引起的食品品質(zhì)下降或失去食用價值的所有變化，這些變化直接影響食品的質(zhì)量和消費者的健康。全世界每年約有10%~20%的農(nóng)副產(chǎn)品、水產(chǎn)品、果蔬會腐敗變質(zhì),經(jīng)濟損失巨大。如何防止食品的腐敗變質(zhì)越來越引起人們的重視,有關(guān)食品防腐劑的研究也日趨完善。目前使用的防腐劑品種很多,美國有50多種,日本有43種,中國香港特區(qū)27種,主要為丙酸及鹽類、山梨酸及鉀鹽、苯甲酸類、噻菌靈、對羥基苯甲酸酯類、以及新型生物防腐劑聚賴氨酸、魚精蛋白、乳酸、鏈球菌素等。我國允許使用的約18種,主要品種有:苯甲酸鈉、山梨酸及其鉀鹽、丙酸鈣等,生物防腐劑的開發(fā)和應(yīng)用尚處于起步階段。苯甲酸系列、山梨酸系列、丙酸鹽等這些防腐劑均為化學(xué)合成的防腐劑,對人體健康有一定影響。隨著人們生活水平的日益提高,迫切需要更安全的防腐劑。日本開始使用聚賴氨酸、Nisin等以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的天然防腐劑替代傳統(tǒng)的化學(xué)合成的防腐劑。作為新型的天然防腐劑,ε-聚賴氨酸已于2003年10月被FDA批準(zhǔn)為安全食品保鮮劑。迄今為止,ε-聚賴氨酸的微生物發(fā)酵在日本已實現(xiàn)工業(yè)化,年產(chǎn)千噸ε-聚賴氨酸的現(xiàn)代化工業(yè)裝置已建成投產(chǎn)。但該技術(shù)在國內(nèi)還處于實驗室階段,ε-聚賴氨酸生物防腐劑的開發(fā)和生產(chǎn)還處于起步階段,如果能重點扶持這一技術(shù),將會在未來幾年創(chuàng)造出可觀的經(jīng)濟效益。1同型單體聚合物p1977年日本學(xué)者S.Shima和H.Sakai在從微生物中篩選DragendorffPositive(簡寫為DP)物質(zhì)的過程中,發(fā)現(xiàn)一株放線菌No.346能產(chǎn)生大量而穩(wěn)定的DP物質(zhì),通過對酸水解產(chǎn)物的分析及結(jié)構(gòu)分析,證實該DP物質(zhì)是一種含有25~30個賴氨酸殘基的同型單體聚合物,稱為ε-多聚賴氨酸(ε-PL)。研究證明由于ε-PL比α-PL有更強的抑菌活性,而且α-多聚賴氨酸有一定毒性,目前在國際市場上ε-多聚賴氨酸作為食品防腐劑已經(jīng)取代了α-多聚賴氨酸。其分子式如下:1.1酸分子量的影響ε-聚賴氨酸為淡黃色粉末、吸濕性強,略有苦味,是賴氨酸的直鏈狀聚合物。它不受pH值影響,對熱穩(wěn)定(120℃,20min),能抑制耐熱菌,故加入后可熱處理。但遇酸性多糖類、鹽酸鹽類、磷酸鹽類、銅離子等可能因結(jié)合而使活性降低。與鹽酸、檸檬酸、蘋果酸、甘氨酸和高級脂肪甘油酯等合用又有增效作用。分子量在3600~4300之間的ε-聚賴氨酸其抑菌活性最好,當(dāng)分子量低于1300時,ε-聚賴氨酸失去抑菌活性。由于聚賴氨酸是混合物,所以沒有固定的熔點,250℃以上開始軟化分解。ε-聚賴氨酸溶于水,微溶于乙醇。對其表征進行紅外光譜分析表明:在1680~1640cm-1和1580~1520cm-1有強吸收峰。1.2急性口服毒性ε-聚賴氨酸是一種具有抑菌功效的多肽,這種生物防腐劑在80年代初由日本學(xué)者騰井正弘,平木純首次應(yīng)用于食品防腐。ε-聚賴氨酸能在人體內(nèi)分解為賴氨酸,而賴氨酸是人體必需的8種氨基酸之一,也是世界各國允許在食品中強化的氨基酸。因此ε-聚賴氨酸是一種營養(yǎng)型抑菌劑,安全性高于其他化學(xué)防腐劑,其急性口服毒性為5g/kg。ε-聚賴氨酸抑菌譜廣,對于酵母屬的尖銳假絲酵母菌、法紅酵母菌、產(chǎn)膜畢氏酵母、玫瑰擲孢酵母;革蘭氏陽性菌中的耐熱脂肪芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌;革蘭氏陰性菌中的產(chǎn)氣節(jié)桿菌、大腸桿菌等引起食物中毒與腐敗的菌有強烈的抑制作用。劉慧等研究也表明:ε-聚賴氨酸對革蘭氏陽性的微球菌,保加利亞乳桿菌,熱鏈球菌,革蘭氏陰性的大腸桿菌,沙門氏菌以及酵母菌的生長有明顯抑制效果,聚賴氨酸與醋酸復(fù)合試劑對枯草芽胞桿菌有明顯抑制作用。2-pl及其衍生物傳統(tǒng)研究認為,食品防腐劑的作用機理主要表現(xiàn)在如下3個方面:(1)作用于細胞壁和細胞膜系統(tǒng);(2)作用于遺傳物質(zhì)或遺傳微粒結(jié)構(gòu);(3)作用于酶或功能蛋白。S.Shima,H.Sakai等研究發(fā)現(xiàn),防腐劑主要抑制微生物的呼吸作用,導(dǎo)致能量物質(zhì)ATP和還原物質(zhì)NADH虧缺,所有合成代謝受阻,活性的動態(tài)膜結(jié)構(gòu)不能維持,代謝方向趨于水解,最后產(chǎn)生細胞自溶。實驗表明,ε-聚賴氨酸踞留生物膜后,破壞依賴于膜結(jié)構(gòu)完整的能量代謝和細胞及細胞器賴以生存的對物質(zhì)的選擇性,導(dǎo)致胞內(nèi)溶酶體膜破裂而誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生自溶作用,最終導(dǎo)致細胞死亡。1984年S.Shima等對ε-PL的進一步研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)其濃度為1~8mg·L-1時,即對G+、G-細菌有抑制作用,且抑菌能力強,ε-PL必須含有10個以上賴氨酸殘基才具有抑菌活性,對氨基的化學(xué)修飾會降低其抑菌能力。ε-PL通過與細胞膜作用影響微生物細胞的呼吸,與胞內(nèi)的核糖體結(jié)合影響生物大分子的合成。1983年VaaraM等發(fā)現(xiàn)聚陽離子能破壞G-細菌的外膜,并進一步殺死這些細菌。1992年VaaraM進一步發(fā)現(xiàn),聚賴氨酸是通過吸附到G-細菌的外膜上,釋放出大量的脂多糖,破壞細菌外膜,而起到抑菌作用的。1995年NDelihas等發(fā)現(xiàn)分枝桿菌屬的細菌對ε-PL的抑菌作用具有高度的敏感性,說明ε-PL及其衍生物可用作抗結(jié)核藥物。2000年劉慧等對聚賴氨酸的抑菌性能進行了研究,發(fā)現(xiàn)ε-PL不僅可抑制耐熱性較強的G+的微球菌,而且對其它天然防腐劑(如Nisin)不易抑制的G-的大腸桿菌、沙門氏菌抑菌效果亦非常好,同時還可抑制保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、酵母菌的生長。但是單獨使用ε-PL時對枯草芽孢桿菌、黑曲霉抑制不明顯,采用ε-PL與醋酸復(fù)合處理,對枯草芽孢桿菌抑制作用增強,經(jīng)高溫處理后的ε-PL對微球菌仍有抑菌活性。3-多酚酸的生產(chǎn)3.1聚合酶催化合成-聚賴氨酸ε-聚賴氨酸的生物合成途徑目前還不清楚。據(jù)日本學(xué)者推測,是由L-賴氨酸聚合酶催化單體賴氨酸聚合而成,所以ε-聚賴氨酸的代謝途徑可能經(jīng)賴氨酸合成途徑,最后由聚合酶催化合成見圖23.2ph對-pl發(fā)酵的影響1981年S.Shima和H.Sakai對篩選到的ε-PL產(chǎn)生菌進行了分類鑒定確定為白色鏈霉菌(streptomycesalbulus)。白色鏈霉菌在形態(tài)特征方面,菌孢子絲簡單分枝、密螺旋,顏色為灰色或灰棕色,組成孢子絲的孢子數(shù)量有數(shù)十個,孢子是1.2~1.5μm的橢圓形,具有多刺的表面結(jié)構(gòu)。生長溫度15~40℃(最適30℃)。同時S.Shima等研究了ε-PL的發(fā)酵生產(chǎn)條件,發(fā)現(xiàn)碳源中甘油和葡萄糖是最好的;有機氮源中硫酸銨和酵母膏的混合使用更有利于ε-PL的形成。在發(fā)酵過程中pH的下降,對于ε-PL的積累是至關(guān)重要的條件。ε-PL生產(chǎn)的最適溫度是25~30℃,通氣量的增加有利于ε-PL的積累。姜俊云等采用5L自控式發(fā)酵罐研究了ε-聚賴氨酸分批發(fā)酵過程中攪拌轉(zhuǎn)速和pH對發(fā)酵指標(biāo)以及菌體細胞形態(tài)的影響。提高攪拌速率對菌體生長和ε-聚賴氨酸的合成有顯著的促進作用;當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為350r·min-1和控制pH4.0時可獲得最大的ε-聚賴氨酸產(chǎn)量2.95g·L-1,這是由于當(dāng)白色鏈霉菌形成菌絲球時,在一定的攪拌速度下,使其比較疏松,有利于聚賴氨酸的合成。2001年P(guān).Kahar等研究了通過控制pH增加白色鏈霉菌410菌株的ε-PL產(chǎn)量的方法,他們認為ε-PL的發(fā)酵生產(chǎn)過程中,前階段細胞生長期若維持pH5.0以上,利于細胞的生長;后階段ε-PL積累期將pH維持在4.0左右,能增加ε-PL的產(chǎn)量,同時通過補料方式使pH不上升,這種控制pH的發(fā)酵方式使ε-PL的產(chǎn)量由5.7g·L-1增加到了48.3g·L-1。據(jù)有關(guān)方面報道,在白色鏈霉菌細胞膜存在一種PL裂解酶,該酶在pH5.0時才有活性,這可能就是為什么pH高于4.0時PL產(chǎn)量會降低。目前,ε-聚賴氨酸的合成菌株的最高產(chǎn)率為50g·L-1左右,但若要取得更大的經(jīng)濟效益,還必須對菌株作進一步改良。傳統(tǒng)的方法是對出發(fā)菌株采用常規(guī)的誘變方法;隨著對ε-PL合成機理研究的深入和合成酶基因的定位、克隆和表達,科研人員將采用基因工程手段,構(gòu)建基因工程菌應(yīng)用于ε-PL的生產(chǎn)。4-多酚酸的應(yīng)用4.1-聚賴氨酸+醋酸徐紅華等通過飽和試驗設(shè)計研究了ε-聚賴氨酸和甘氨酸對牛奶保鮮作用,結(jié)果表明單獨使用ε-聚賴氨酸和甘氨酸,其抑菌能力明顯低于二者混合使用的效果。混合使用時其增效隨二者用量的增加而增加;但當(dāng)ε-聚賴氨酸用量過高時,這種增效作用會有所減弱。其中添加420mg·L-1ε-聚賴氨酸和2%的甘氨酸抑菌效果最佳。日本學(xué)者騰井正弘在米飯中添加0.4%~0.6%ε-聚賴氨酸-醋酸制劑研究對米飯的防腐作用結(jié)果顯示:30℃培養(yǎng)48h后,添加ε-聚賴氨酸防腐劑的樣品中細菌總數(shù)為6.0×103個/g,而空白樣中細菌總數(shù)為3.6×108個/g,表明ε-聚賴氨酸-醋酸制劑有明顯的抑菌作用。有關(guān)方面報道,用大蒜為主要原料與聚賴氨酸混合制成食品防腐劑。這種食品防腐劑使用時加入食品中或噴淋到食品表面,均具有顯著的抗菌防腐作用,能殺死或抑制食品內(nèi)部或表面的致病微生物。4.2聚賴氨酸pasaε-聚賴氨酸富含陽離子,與帶有陰離子的物質(zhì)有強的靜電作用力并且對生物膜有良好的穿透力,基于這一特性多聚賴氨酸可用于某些藥物的載體,因此在醫(yī)療和制藥方面得到廣泛應(yīng)用。Huguesetal發(fā)現(xiàn)將氨甲嘌呤(治療白血病、腫瘤的藥物)與ε-PL聚合,能提高藥物的療效。解放軍總醫(yī)院基礎(chǔ)所的科研人員用海藻酸鈉)——聚賴氨酸一海藻酸鈉(APA)微囊化牛嗜鉻細胞后(BBC)注入脊髓蛛網(wǎng)膜下,其對慢性疼痛有鎮(zhèn)痛作用,而且這種APA膜具有良好的免疫隔離作用。Fan-Tslet.al將聚賴氨酸作為媒介應(yīng)用于酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)。Fan用聚賴氨酸包裹T2毒素,然后接種白兔T2抗體,通過專一性的抗原抗體反應(yīng)來檢測抗體的數(shù)量。劉德伍,李國輝等在研究培養(yǎng)人表皮細胞的實驗中表明多聚賴氨酸能顯著提高表皮細胞的貼壁、集落和膜片形成的速率,同時對培養(yǎng)表皮細胞的生長無不利影響。Sospedra.petal用以聚賴氨酸為主鏈的分支聚合蛋白搭載生物大分子來治療肝炎病毒(HAv),取得了良好的療效。龔海鵬等在研究殼聚糖對神經(jīng)細胞的作用發(fā)現(xiàn),殼聚塘表面涂敷多聚賴氨酸和殼聚糖與多聚賴氨酸混合材料是比殼聚糖更好的促神經(jīng)細胞生長的生物材料,是很有應(yīng)用價值的神經(jīng)修復(fù)材料。劉彥春等,發(fā)現(xiàn)以PL包埋的支架對軟骨細胞的吸附力明顯增強,且細胞分泌基質(zhì)增多,表明PL不但對細胞有良好的吸附,還有促進細胞發(fā)揮正常功能的作用。Diederich.ankeetal研究了電脈沖對不同分子量聚賴氨酸修飾的細胞膜的破壞程度,發(fā)現(xiàn)細胞膜吸附高分子量聚賴氨酸會降低其破損臨界電壓。另外ε-PL的另一個重要用途是作為高吸性聚合物,用于婦女衛(wèi)生巾、嬰兒尿片和其他各種工業(yè)產(chǎn)品中。5添加劑的添加量目前日本的聚賴氨酸的商品一般都是以50%的有效成分配合成商品出售.如:酒精制劑:以含質(zhì)量分數(shù)50%聚賴氨酸的糊精粉末為基礎(chǔ)原料,添加體積分數(shù)30%~70%的酒精的制劑,主要用于各種蛋制品。醋酸制劑:添加體積分數(shù)0.5%~5.0%的醋酸,主要用于米飯,色拉等食品;甘油制劑:添加量為體積分數(shù)0.01%~5%,主要用于含有動物性蛋白乳蛋白較多的食品;甘氨酸制劑:添加量為質(zhì)量分數(shù)0.01%~10%,和聚賴氨酸復(fù)合使用,