口蝦原肌球蛋白的分離純化及免疫學(xué)性質(zhì)分析

口蝦原肌球蛋白的分離純化及免疫學(xué)性質(zhì)分析

食物過(guò)敏是一種由ige誘導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)。其臨床癥狀主要包括水腫、皮炎、哮喘和腸球菌，如果嚴(yán)重時(shí)死亡。流行病學(xué)調(diào)查顯示,在國(guó)外大約有1%~2%的成人以及5%~7%的兒童遭受由花生、堅(jiān)果、小麥、大豆、牛奶、雞蛋、魚(yú)以及甲殼類動(dòng)物等食物引起的過(guò)敏反應(yīng)。其中,甲殼類是常見(jiàn)的主要過(guò)敏食物之一。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心呂相征等對(duì)4052名在校大學(xué)生食物過(guò)敏的流行情況調(diào)查發(fā)現(xiàn),15~24歲年齡段健康人群中,約有36%對(duì)水產(chǎn)品過(guò)敏。目前對(duì)甲殼類動(dòng)物的研究主要集中在可食用的軟甲綱十足目動(dòng)物,包括印度對(duì)蝦(Penaeusindicus)、棕蝦(Penaeusaztecus)、刀額新對(duì)蝦(Metapenaeusensis)、龍蝦、銹斑蟳(Charybdisferiatus)、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)等。研究結(jié)果表明,甲殼類動(dòng)物的主要過(guò)敏原是原肌球蛋白(tropomyosin,TM),該蛋白的分子量在35~38ku,易生成同源二聚體。在十足類動(dòng)物中,由于氨基酸序列的高度同源(>90%),TM具有很強(qiáng)的免疫交叉反應(yīng)性。除了十足類,Suma等報(bào)道了鞘甲亞綱藤壺的主要過(guò)敏原也是TM,與十足類動(dòng)物的TM有免疫交叉反應(yīng),但其氨基酸序列與十足類動(dòng)物TM的同源性僅為60%左右,而與鮑TM則有76%~78%的同源性。以上結(jié)果表明,TM可能是甲殼類動(dòng)物的主要交叉過(guò)敏原并具有一定的種屬特異性?？谖r蛄是我國(guó)食用較多的甲殼類水產(chǎn)品之一,其在分類學(xué)上與蝦蟹距離較遠(yuǎn),屬掠蝦亞綱口足目。2008年,Motoyama等的研究指出,口蝦蛄與其它蝦類相比,由于TM的含量極低,其致敏性很低。而李振興等對(duì)口蝦蛄粗提物的研究表明,口蝦蛄的主要過(guò)敏原為穩(wěn)定存在的TM,不同種類蝦的致敏性無(wú)顯著差異。Alonso等報(bào)道了蝦蛄中的過(guò)敏原為25ku的蛋白,但該蛋白不是TM。因此,對(duì)于口蝦蛄過(guò)敏原的存在情況、過(guò)敏原的性質(zhì)及致敏性仍需作進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)采用過(guò)敏患者血清鑒定口蝦蛄主要過(guò)敏原,并對(duì)該主要過(guò)敏原進(jìn)行分離、純化及性質(zhì)分析,以期探明口蝦蛄過(guò)敏原的存在情況,為對(duì)其作進(jìn)一步研究提供理論參考。1材料和方法1.1血清及ige抗體鮮活水產(chǎn)品包括口蝦蛄(Squillaoratoria)、鋸緣青蟹(Scyllaserrata)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)和雜色蛤(Venerupisvariegata)均購(gòu)自廈門(mén)市集美菜市場(chǎng)。甲殼類過(guò)敏患者血清及正常人血清由集美大學(xué)醫(yī)療中心提供,血清提供者均為在校學(xué)生,年齡為17~25歲。HRP標(biāo)記的羊抗人IgE抗體購(gòu)自KPL公司;兔抗中華絨螯蟹TM抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備;HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Pierce公司;蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為Fermentas公司和NewEnglandBiolabs公司產(chǎn)品;其他試劑均為分析純。1.2磷酸鹽緩沖液/l.取新鮮肌肉樣品均質(zhì)于4倍含0.6mol/LKCl的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)。勻漿混合物在沸水浴中加熱10min,離心取上清即得加熱粗提物。1.3離心-硫酸銨鹽析tki參考Liang等的方法并做少量修改,將口蝦蛄肌肉用10倍體積含有50mmol/LKCl的20mmol/LTris-HCl(pH7.5)抽提,離心,取沉淀重復(fù)上述操作4次后,用預(yù)冷的丙酮處理,制備丙酮粉。將制備得到的丙酮粉用10倍體積含1mol/LKCl的20mmol/LTris-HCl(pH7.5)溶液抽提過(guò)夜,離心,取上清調(diào)整pH至等電點(diǎn),離心,沉淀溶于20mmol/LTris-HCl(pH7.5),用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.5后,進(jìn)行40%~60%硫酸銨鹽析。將硫酸銨鹽析后的樣品置于100℃水浴中加熱15min,冷卻后,離心,上清即為純化的TM。1.4聚丙烯酰胺凝膠取制備的蛋白樣品加入SDS上樣緩沖液,95℃加熱10min后上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠。電泳后凝膠以考馬斯亮藍(lán)染色,凝膠成像系統(tǒng)(G:BOX,Syngene公司)成像后,蛋白條帶的分子量采用Syngene公司的GeneTools圖像分析軟件(3.07)分析。1.5免疫印跡實(shí)驗(yàn)以12%的分離膠進(jìn)行電泳后,轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶封閉1h,采用抗中華絨螯蟹TM抗體為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn),DAB顯色。抑制性免疫印跡即在上述操作中對(duì)照組以抗中華絨螯蟹TM抗體為一抗,實(shí)驗(yàn)組的一抗預(yù)先與純化的TM在37℃預(yù)孵育1h,其余操作同免疫印跡。1.6elisa測(cè)定相關(guān)蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:將分別稀釋為0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1μg/mL的鋸緣青蟹TM于96孔板4℃包被過(guò)夜;TBS-T洗滌后,加入5%脫脂奶37℃封閉1h;TBS-T洗滌5次,加入一抗(抗中華絨螯蟹TM抗體)37℃反應(yīng)1h;TBS-T洗滌5次,加入二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG)37℃反應(yīng)40min;TBS-T洗滌5次后,加入TMB顯色25min,用2mol/LH2SO4終止,最后在96孔板酶標(biāo)儀(Benchmark,Bio-Rad公司)測(cè)定A450nm值。稀釋各種甲殼類動(dòng)物粗提物的蛋白濃度,其它操作同上,最終使其A450nm值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所含TM的濃度。抑制性ELISA的操作同上。一抗對(duì)照組采用過(guò)敏患者血清,實(shí)驗(yàn)組為過(guò)敏患者血清與純化的TM在37℃預(yù)孵育1h。2結(jié)果2.1粗提物電泳后蛋白免疫印跡口蝦蛄肌肉粗提物采用SDS進(jìn)行分析,結(jié)果如圖1-A所示。粗提物所含的蛋白組分分子量從14ku至200ku不等,條帶較為彌散,與Motoyama等的結(jié)果較為相似,但不同的是,本實(shí)驗(yàn)中,在36ku處有一明顯的蛋白條帶,推測(cè)可能是TM。粗提物電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測(cè),結(jié)果如圖1-B所示。粗提物中分子量為36ku的蛋白能與4份甲殼類過(guò)敏患者血清反應(yīng),而與混合陰性血清無(wú)反應(yīng)。該結(jié)果表明,粗提物中分子量為36ku的蛋白是口蝦蛄的主要過(guò)敏原。而第2、4份血清的結(jié)果中還有一些其他條帶,可能是口蝦蛄肌肉中的其它過(guò)敏原;結(jié)合后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測(cè)這些條帶也可能是TM的降解產(chǎn)物。2.2抗中華絨螯蟹tm抗體蛋白的純化與純化經(jīng)丙酮處理、等電點(diǎn)沉淀、硫酸銨鹽析和加熱可得到純度較高的口蝦蛄主要過(guò)敏原,其分子量約為36ku(圖2-A)。以抗中華絨螯蟹TM抗體進(jìn)行的免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,純化的蛋白為口蝦蛄TM(圖2-B)。采用甲殼類過(guò)敏患者混合血清為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗人IgE為二抗進(jìn)行的免疫印跡結(jié)果顯示,在36ku左右有一明顯的條帶,說(shuō)明其具有致敏性,這與粗提物與血清的反應(yīng)結(jié)果相一致,進(jìn)一步說(shuō)明純化所得的TM是口蝦蛄的主要過(guò)敏原(圖2-C)。2.3粗提物的免疫活性為了研究口蝦蛄TM與其它甲殼類動(dòng)物過(guò)敏原的交叉反應(yīng)性,首先提取口蝦蛄、凡納濱對(duì)蝦、鋸緣青蟹、雜色蛤等甲殼類動(dòng)物肌肉的粗提物進(jìn)行SDS(圖3)。在采用相同的提取方法、蛋白上樣量一致的前提下,不同甲殼類動(dòng)物肌肉粗提物電泳圖譜有明顯差異。對(duì)應(yīng)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果,口蝦蛄和凡納濱對(duì)蝦TM的分子量在36ku左右,雜色蛤TM的分子量約為34ku,鋸緣青蟹的TM的分子量約為38ku。其中,凡納濱對(duì)蝦和鋸緣青蟹TM的含量明顯高于口蝦蛄和雜色蛤。與其它3種甲殼類動(dòng)物的粗提物不同,口蝦蛄粗提物的電泳條帶較為彌散,結(jié)合Motoyama等的結(jié)果推測(cè),口蝦蛄肌肉中可能存在較高的蛋白酶活性。采用抑制性免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)純化的口蝦蛄TM與其他水產(chǎn)品TM的免疫交叉反應(yīng)性。由圖4A可以看出,純化的口蝦蛄TM、口蝦蛄粗提物、凡納濱對(duì)蝦粗提物和鋸緣青蟹粗提物與抗中華絨螯蟹TM抗體均產(chǎn)生免疫交叉反應(yīng),而雜色蛤粗提物的反應(yīng)程度很弱,表明中華絨螯蟹TM與口蝦蛄、凡納濱對(duì)蝦以及鋸緣青蟹TM在氨基酸序列上有較高的同源性,與雜色蛤TM的同源性則低很多。其中,在口蝦蛄的粗提物中可以檢測(cè)到一些分子量小于36ku的條帶,提示可能是蛋白酶作用后TM的降解片段。實(shí)驗(yàn)組中,采用100μg/mL純化的口蝦蛄TM與抗中華絨螯蟹TM抗體預(yù)孵育,結(jié)果顯示,純化的口蝦蛄TM、口蝦蛄粗提物、凡納濱對(duì)蝦粗提物和鋸緣青蟹粗提物的TM條帶與抗體的反應(yīng)幾乎全部被抑制,進(jìn)一步表明口蝦蛄TM與凡納濱白對(duì)蝦TM、鋸緣青蟹TM存在著較強(qiáng)的免疫交叉反應(yīng)。而雜色蛤TM由于與抗中華絨螯蟹TM抗體的反應(yīng)性很弱,因此,從該結(jié)果難以判斷口蝦蛄TM與雜色蛤TM的同源性。不同甲殼類動(dòng)物粗提物的致敏性及其與口蝦蛄TM的免疫交叉反應(yīng)性,采用過(guò)敏患者血清和純化的口蝦蛄TM進(jìn)行抑制性ELISA實(shí)驗(yàn)(圖5)。口蝦蛄、凡納濱白對(duì)蝦、鋸緣青蟹粗提物的致敏性相近,雜色蛤粗提物的致敏性相對(duì)較低;純化的口蝦蛄TM與血清的預(yù)孵育使凡納濱白對(duì)蝦、鋸緣青蟹及雜色蛤的粗提物與過(guò)敏患者血清的反應(yīng)明顯減弱,表明這3種甲殼類動(dòng)物的過(guò)敏原與口蝦蛄的TM存在著免疫交叉反應(yīng)性。其中雜色蛤粗提物與口蝦蛄TM的免疫交叉反應(yīng)程度相對(duì)較低,該結(jié)果與抑制性免疫印跡實(shí)驗(yàn)相符。2.4青蟹tm和口蝦tm含量的比較目前,已有多項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)品過(guò)敏原的檢測(cè),如SDS、ELISA、PCR等方法。SDS電泳圖譜(圖3)顯示口蝦蛄中TM的含量較低。為了證實(shí)該結(jié)果,采用抗中華絨螯蟹TM多克隆抗體以ELISA方法對(duì)4種甲殼類動(dòng)物的TM進(jìn)行定量比較。圖6是以純化的鋸緣青蟹TM繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1為通過(guò)ELISA方法測(cè)定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算的3種甲殼類動(dòng)物粗提物中TM的含量。其中,凡納濱白對(duì)蝦和鋸緣青蟹TM含量較高,口蝦蛄TM含量相對(duì)較少。需要指出的是,由于采用鋸緣青蟹TM作標(biāo)準(zhǔn)曲線,因此,口蝦蛄、凡納濱白對(duì)蝦和雜色蛤的真實(shí)TM含量可能與測(cè)量值有一定差異。但本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與SDS的結(jié)果較為一致,能在一定程度上反映這3種甲殼類動(dòng)物TM的相對(duì)含量。雜色蛤的TM因?yàn)榕c鋸緣青蟹的TM同源性很低,難于用該方法測(cè)定,故未列出。根據(jù)肌肉粗提物SDS電泳圖譜以及免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè),口蝦蛄肌肉粗提物中可能含有較高的蛋白酶活性,從而導(dǎo)致TM產(chǎn)生部分分解。因此,我們對(duì)口蝦蛄肌肉中蛋白酶活進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其中含有較高的絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶活性(結(jié)果另行報(bào)道)。因此,Motoyama等報(bào)道的口蝦蛄肌肉中TM含量極低,可能是由于其中的蛋白酶對(duì)TM產(chǎn)生了一定程度的降解所致。在本研究中,通過(guò)ELISA法定量得到口蝦蛄肌肉中TM含量較低,而采用過(guò)敏患者血清檢測(cè)粗提物致敏性時(shí)卻發(fā)現(xiàn)口蝦蛄粗提物的致敏性與凡納濱白對(duì)蝦及鋸緣青蟹相當(dāng),這可能是由于蛋白酶酶解破壞了TM的部分IgG結(jié)合位點(diǎn),但其IgE結(jié)合位點(diǎn)仍然保留。另外,Motoyama等報(bào)道的口蝦蛄粗提物SDS圖譜未能觀察到TM條帶,而李振興等的SDS圖譜中TM條帶清晰,無(wú)降解現(xiàn)象。本研究所得到口蝦蛄粗提物