王鏡巖-生物化學(xué)I-第5章 蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)-第6章 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

第五章蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)

1952年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以分成四個層次:

primarystructure

一級結(jié)構(gòu)：氨基酸序列

secondarystructure

二級結(jié)構(gòu)：α螺旋，β折疊

tertiarystructure

三級結(jié)構(gòu)：所有原子空間位置

quanternarystructure

四級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)多聚體

1969年正式將一級結(jié)構(gòu)定義為氨基酸序列和雙硫鍵的位置。介于二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間還存在超二級結(jié)構(gòu)（二級結(jié)構(gòu)的組合）和結(jié)構(gòu)域（在空間上相對獨立）這兩個層次。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次肽基的C、O和N原子間的共振相互作用共振產(chǎn)生的重要結(jié)果：

限制繞肽鍵的自由旋轉(zhuǎn)

形成酰胺平面

產(chǎn)生鍵的平均化

肽鍵呈反式構(gòu)型sp2sp2sp2sp3共振雜化體歷史上第一個被確定

氨基酸序列的蛋白質(zhì)

胰島素

insulin胰島素的歷史第一個生化藥物最小的蛋白質(zhì)，由A鏈(21AA)和B(30AA)組成；動物胰腺?細胞分泌的一種激素,告訴細胞往里面運輸糖、氨基酸、K+；1921年Banting&Best從胰腺中抽提出了有活性的胰島素，1923年Banting&Macleod獲Nobel醫(yī)學(xué)獎；1943－53年，Sanger確定了牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)，1958年獲得Nobel化學(xué)獎；1981年，Berg（因DNA重組技術(shù)得獎）在大腸桿菌中表達了人胰島素.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的步驟1、蛋白質(zhì)的分離純化

2、測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目3、亞基分離4、二硫鍵的拆分與保護5、分析每一多肽鏈的氨基酸組成6、鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端殘基7、多種方法的部分水解8、測序9、重疊

10、二硫鍵位置的確定一級結(jié)構(gòu)測定策略蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定步驟N端的測定方法1、Sanger（二硝基氟苯）法2、丹磺酰氯法3、Edman法4、酶降解法氨基酸與2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)

（sanger反應(yīng)）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黃色)++HF弱堿中氨基酸Sanger試劑(FDNB)標(biāo)記N末端Sanger試劑標(biāo)記反應(yīng)ABCDE↓*ABCDE↓*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE↓*A,*A+B,……*A+B+C+D+E↓*A,*A+*B,……*A+*B+*C+*D+*E

12345

結(jié)論：ABCDEFDNBFDNB完全水解部分水解Sanger試劑標(biāo)記測序H2N—CH—COOH+

RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOH

RDNS-氨基酸取代DNFB測定蛋白質(zhì)N端氨基酸，靈敏度高酰化反應(yīng)氨基酸與苯異硫氰酯（PITC）的反應(yīng)

（Edman反應(yīng)）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱鹼中(400

C)(硝基甲烷400

C)H+Edman降解法(I)DABITC：有色Edman試劑在Edman試劑上加發(fā)色基團Edman降解法1Edman降解法(II)Edman降解法2無冕英雄PehrVictorEdman

瑞典人,1916.4.14-1977.3.191946-47年在美國留學(xué)時想到改進1930年Abderhalden&Brockmann發(fā)明的

PITC試劑的反應(yīng),50年發(fā)明Edmandegradation反應(yīng).ActaChemScand4:283(1950)

1957年移居墨爾本,遠離國際學(xué)術(shù)中心開始過隱居生活,1967年研制的自動化儀器可以達到每小時一個氨基酸的速度;他堅持不申請專利,給了美國公司得以隨便開發(fā)儀器的方便.1972年到德國,77年因腦瘤過世.由于Edman降解產(chǎn)物需要在紫外域進行檢測,只有HPLC和相應(yīng)的紫外檢測手段進步后才得到普及;60年代后期Moore&Stein利用該反應(yīng)測定了RNase的一級結(jié)構(gòu),遺憾的是Edman沒有和他們分享Nobel化學(xué)獎.1、肼法2、還原法3、酶降解法C端的測定方法蛋白質(zhì)與無水肼加熱

-------NH-CH-CONH-CH-COOH

|

|

Rx

Ry

--+--+NH-CH-CONH-NH2

+

NH2-CH-COOH

|

|

Rx

Ry肼(hydrazine)法測定＋NH2NH2，100℃，5～10h溶于有機溶劑而被除去多種方法確定肼法C端測定

利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase)將肽鏈的氨基酸從N端

(aminopeptidase)或C端

(carboxypeptidase)一個接一個游離出來，

在不同時間取樣進行分析，根據(jù)所游離的氨基酸的摩爾數(shù)的多少來判斷氨基酸的排列順序。酶解法末端測序酶解法末端測序肽鍵的專一性水解(化學(xué)法)化學(xué)法:CNBr,H+,NH2OH,etc化學(xué)法專一性水解消化道內(nèi)幾種蛋白酶的專一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶彈性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶（Phe.Trp）泛用酶：

胰蛋白酶（trypsin）；

Lys-X,Arg-X(X≠Pro)

胰糜乳蛋白酶（chymotrypsin）；Y-X（Y=Phe,Trp,Tyr;X≠Pro)

嗜熱菌蛋白酶（thermolysin）；

木瓜蛋白酶（papain）；

X-Y(X=R,K,Q,H,Y)

胃蛋白酶（pepsin）；

枯草桿菌堿性蛋白酶（subtilisin）

專一酶：

Lys-X;X-Lys;Arg-X;Glu-X;X-Asp;Pro-X;Asn-X,商品名：EndoproteinaseAsn-C肽鍵的專一性水解(酶法)酶法專一性水解太短在多肽鏈中次序的決定資料：N-末端殘基H,C-末端殘基S;第一套肽段

第二套肽段OUS

SEOPS

WTOUEOVE

VERLRLA

APSHOWT

HO借助重疊肽確定肽段次序：末端殘基HS末端肽段HOWT

APS

或

OUS第一套肽段：HOWT

OUS

EOVE

RLA

PS第二套肽段：HO

WTOU

SEO

VERL

APS推斷全序列:

HOWTOUSEOVERLAPS二硫鍵的斷裂：幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。可以通過加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價力；應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。胰島素

-巰基乙醇碘乙酸二硫鍵的斷裂確定原多肽鏈重二硫鍵的位置：一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將每個肽段進行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。二硫鍵的切割與保護1、過甲酸〔performicacid〕

不可逆

－CH2SO3H2、還原＋烷基化

不可逆[巰基乙醇，DTT]

＋碘乙酸等

－S-CH2-COOH二硫鍵的保護1、為防止Cys跟Cys-Cys發(fā)生交換反應(yīng)，先將自由SH基封閉;2、進行專一性部分水解;3、紙層析分離水解產(chǎn)物;4、氣相過甲酸法切斷S-S鍵，作第二相紙層析;5、將遷移率發(fā)生變化的多肽進行測序經(jīng)典的二硫鍵位置的確定法二硫鍵位置確定對角線電泳示意圖現(xiàn)用蛋白質(zhì)一級

結(jié)構(gòu)分析方法分離純化蛋白質(zhì)酶切部分水解后分離短肽對短肽進行測序構(gòu)建cDNA文庫根據(jù)序列設(shè)計探針篩選cDNA文庫根據(jù)cDNA序列推測蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)

N末端和C末端的測序除了用于未知蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的研究以外，最常用于基因工程表達產(chǎn)物的末端分析。末端測序的用途常利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫//www.espasy.ch/swissmod///////pdb/蛋白質(zhì)氨基酸順序與生物功能研究蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系主要是：研究多肽鏈中不同部位的殘基與生物功能的關(guān)系。進行這方面的研究常用的方法有：同源蛋白質(zhì)氨基酸順序相似性分析、氨基酸殘基的化學(xué)修飾及切割實驗等。例1鐮刀形貧血病患者血紅細胞合成了一種不正常的血紅蛋白（Hb-S）它與正常的血紅蛋白（Hb-A）的差別：僅僅在于β鏈的N-末端第6位殘基發(fā)生了變化（Hb-A）第6位殘基是極性谷氨酸殘基，（Hb-S）中換成了非極性的纈氨酸殘基使血紅蛋白細胞收縮成鐮刀形，輸氧能力下降，易發(fā)生溶血這說明了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的高度統(tǒng)一性蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的個體差異例2一級結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活

體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)分子初合成時，常帶有抑制肽，呈無活性狀態(tài)，稱為蛋白質(zhì)原.蛋白質(zhì)原的部分肽鏈以特定的方式斷裂后，才變?yōu)榛钚苑肿?例：胰島素，在剛合成時，是一個比成熟的胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱為前胰島素原前胰島素原的N-末端有一段肽鏈，稱為信號肽.信號肽被切去，剩下的是胰島素原。胰島素原比胰島素分子多一段C肽，只有當(dāng)C肽被切除后才成為有51個殘基，分A、B兩條鏈的胰島素分子單體.例3同源蛋白同源蛋白：是指在不同有機體中實現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì).同源蛋白中的一級結(jié)構(gòu)中有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱為不變殘基；其他位置的氨基酸稱可變殘基.不同種屬的可變殘基有很大變化.可用于判斷生物體間親緣關(guān)系的遠近.例：細胞色素C60個物種中，有28個位置上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構(gòu)象中發(fā)揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基.可變殘基可能隨著進化而變異，而且不同種屬的細胞色素C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關(guān)系相關(guān)。親緣關(guān)系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進化樹）.黃色：不變殘基（invariableresidues）藍色：保守氨基酸（conservativeresidues）未標(biāo)記：可變殘基（variableresidues）不同生物來源的細胞色素c中不變的AA殘基

細胞色素c分子的空間結(jié)構(gòu)不變的AA殘基

28個不變的AA殘基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能參加維持分子構(gòu)象；有的可能參與電子傳遞；有的可能參與“識別”并結(jié)合細胞色素還原酶和氧化酶。1410610013432302918176759525148454138848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgGlyCysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血紅素不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目生物與人不同的AA數(shù)目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、豬、羊、狗11馬12雞、火雞13響尾蛇14海龜15金槍魚21角餃23小蠅25蛾31小麥35粗早鏈孢霉43酵母44

第6章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能二、血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能三、血紅蛋白分子病四、免疫系統(tǒng)和免疫球蛋白五、肌球蛋白絲、肌動蛋白絲與肌肉收縮六、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能進化(Therelationbetweenstructureandfunctionofproteins)一、肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能肌紅蛋白

肌紅蛋白（myoglobin，Mb）主要存在于肌肉中，是哺乳動物細胞主要是肌細胞貯存和分配氧的蛋白質(zhì)。肌紅蛋白由一條多肽鏈和一個輔基血紅素（heme）構(gòu)成，相對分子量16700，含153個氨基酸殘基。除去血紅素后僅剩下的肽鏈部分稱為珠蛋白（globin），它和血紅蛋白的α、β亞基有明顯的同源性，它們的構(gòu)象和功能也極為相似。血紅素非共價地結(jié)合在珠蛋白的疏水空穴中。

肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)myoglobin輔基血紅素

血紅素由原卟啉Ⅸ（protoporphyrinⅨ）中間結(jié)合一個Fe原子構(gòu)成，原卟啉Ⅸ是由4個吡咯環(huán)通過甲叉橋連接而成的扁平環(huán)狀化合物。卟啉環(huán)中央結(jié)合Fe原子，F(xiàn)e原子通常是八面體配位，應(yīng)該有6個配位鍵，其中4個配位鍵與4個吡咯環(huán)的N原子相連，另兩個配位鍵分布在卟啉環(huán)的上下。Fe原子可以是二價的或三價的，相應(yīng)的血紅素稱為[亞鐵]血紅素（ferroheme，heme）和高鐵血紅素（ferriheme，hematin），相應(yīng)的肌紅蛋白稱為[亞鐵]肌紅蛋白（ferromyoglobin）和高鐵肌紅蛋白（ferrimyoglobin，metmyoglobin）。

肌紅蛋白的輔基血紅素hemeprotoporphyrinⅨO2與肌紅蛋白的結(jié)合

血紅素中的鐵的第5個配位鍵與珠蛋白的第93（或F8）位His殘基的咪唑基N結(jié)合，這個His稱為近側(cè)His，而O2與Fe的第6個配位鍵結(jié)合。在肌紅蛋白沒有結(jié)合O2時，這個部位是空的。高鐵肌紅蛋白不能與O2結(jié)合，H2O分子代替O2成為第6個配體。

在血紅素結(jié)合O2的一側(cè)，還有一個His殘基，即第64（或E7）位His殘基，稱為遠側(cè)His。由于這個遠側(cè)His的存在，使得O2的結(jié)合受到空間位阻。在氧合肌紅蛋白中，O2的兩個原子與Fe不成一條直線，而是傾斜了30°。氧合肌紅蛋白中血紅素鐵離子的6個配體近側(cè)His遠側(cè)HisCO的毒性作用

第6個配位位置的空間位阻很重要。游離在溶液中的鐵卟啉結(jié)合CO的能力比結(jié)合O2強25000倍，但在肌紅蛋白中，血紅素對CO的親和力僅比對O2的親和力大250倍。肌紅蛋白（還有血紅蛋白）降低對CO的親和力，可以有效地防止代謝過程中產(chǎn)生的少量CO占據(jù)它們的O2結(jié)合部位。盡管如此，當(dāng)空氣中CO的含量達到0.06%～0.08%即有中毒的危險，達到0.1%則會導(dǎo)致死亡。O2和CO與肌紅蛋白血紅素Fe（Ⅱ）的結(jié)合FreehemewithimidazoleMb:COComplexOxymyoglobin肌紅蛋白的蛋白質(zhì)部分的作用

通常情況下，O2分子與Fe（Ⅱ）緊密接觸會使Fe（Ⅱ）氧化成Fe（Ⅲ），溶液中游離的亞鐵血紅素很容易被氧化成高鐵血紅素，但在肌紅蛋白中，由于血紅素處于疏水環(huán)境中，血紅素Fe（Ⅱ）不容易被氧化。同樣是血紅素，與不同的蛋白質(zhì)結(jié)合后，具有不同的功能，如在細胞色素C中，血紅素起可逆電子載體的作用，過氧化氫酶中，血紅素催化H2O2歧化成H2O和O2

。肌紅蛋白血紅素Fe原子的位移

肌紅蛋白血紅素在沒有與O2結(jié)合時，鐵原子是向第5配位體方向（HisF8）突出的。當(dāng)與O2結(jié)合時，鐵原子被拉回到卟啉平面。

肌紅蛋白血紅素Fe原子的位移肌紅蛋白結(jié)合氧的定量分析肌紅蛋白與O2結(jié)合的反應(yīng)式為其解離常數(shù)為K

,…………①令Y為肌紅蛋白的氧飽和分數(shù)，即…………②將①改寫為…………③肌紅蛋白結(jié)合氧的定量分析將③代入②得

，

…………④

根據(jù)henry定律，溶于液體的任一種氣體的濃度與液體上面的該氣體的分壓成正比，即

[O2]=Ap

(O2)…………⑤式中A

為比例系數(shù)，p(O2)為氧氣的分壓。

肌紅蛋白結(jié)合氧的定量分析將⑤代入④得…………⑥肌紅蛋白的氧結(jié)合曲線

實驗中p(O2)可以測得，氧分壓常用Torr為單位。Y

值可用分光光度法測定，因為肌紅蛋白結(jié)合了O2時會引起吸收光譜的改變。Y

對p(O2)作圖所得的曲線稱為氧結(jié)合曲線。

1Torr=133Pa=1mmHg肌紅蛋白的氧結(jié)合曲線雙曲線方程Hill作圖

為氧結(jié)合肌紅蛋白的分數(shù)與沒有結(jié)合氧的肌紅蛋白的分數(shù)之比。兩邊取對數(shù)得

Hill作圖

以對作圖稱為Hill作圖，肌紅蛋白的Hill圖是一條直線。當(dāng)時（50%的肌紅蛋白結(jié)合了氧），，這時，這一點的斜率稱為Hill系數(shù)，肌紅蛋白的Hill系數(shù)等于1，說明O2分子彼此獨立地與肌紅蛋白結(jié)合。氧與肌紅蛋白結(jié)合的Hill圖肌紅蛋白的貯氧和輸氧作用

線粒體中氧濃度為0～10torr，靜脈血氧濃度為15torr或更高些。肌紅蛋白的P

50為2torr，所以在大多數(shù)情況下，肌紅蛋白是高度氧合的，是氧的貯存庫。如果由于肌肉收縮使線粒體中氧含量下降，它就可以立即供應(yīng)氧。肌紅蛋白的貯氧和輸氧作用

肌紅蛋白也有利于細胞內(nèi)氧從細胞的內(nèi)表面向線粒體轉(zhuǎn)運，因為這種運轉(zhuǎn)是順濃度梯度的，細胞內(nèi)表面的氧濃度約為10torr（肌紅蛋白的氧飽和度約為80%），而線粒體內(nèi)的氧濃度約為1torr（肌紅蛋白的氧飽和度約為25%），肌紅蛋白可以從細胞內(nèi)表面結(jié)合氧，而運到線粒體中釋放氧。二、血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能血紅蛋白

血紅蛋白（hemoglobin，Hb）存在于紅細胞中，它的主要功能是在血液中結(jié)合并轉(zhuǎn)運氧氣，它在肺中與氧氣結(jié)合，運輸?shù)饺砀魈幗M織中，再釋放出氧氣。

人體內(nèi)有正常功能的血紅蛋白血紅蛋白的氨基酸組成

α鏈或α樣鏈由141個氨基酸殘基組成，β鏈或β樣鏈由146個氨基酸殘基組成，而肌紅蛋白的肽鏈由153個氨基酸殘基組成，它們都叫珠蛋白。同一類型不同希臘字母代表的鏈有個別氨基酸殘基不同。血紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)β1β2α1α2Hb的α鏈、β鏈和Mb鏈構(gòu)象的相似性

血紅蛋白α鏈、β鏈及肌紅蛋白鏈的三級結(jié)構(gòu)非常相似，但這三種肽鏈的氨基酸序列有很大不同，141個氨基酸殘基位置中只有27個位置的殘基在這三種肽鏈中是相同的。

MbHbαHbβ不同物種血紅蛋白氨基酸序列的比較

比較了多種（從七腮鰻到人）不同的血紅蛋白的氨基酸序列，證明序列中有9個位置的殘基是所有研究過的血紅蛋白所共有的，這些稱為高度保守的殘基。血紅蛋白內(nèi)部的非極性殘基可以換成另一種非極性殘基而功能不變。

血紅蛋白氧合時亞基的移動

血紅蛋白分子中，αβ亞基的接觸有兩類，一類是α1β1接觸和α2β2接觸，這類接觸稱為裝配接觸；另一類是α1β2接觸和α2β1接觸，這類接觸稱為滑動接觸。氧合時，每個αβ二聚體半分子作為一個剛體移動，這兩個二聚體彼此滑動。我們將其中一個二聚體看作不動，另一個二聚體將繞一個設(shè)想的偏心軸旋轉(zhuǎn)15°，并平移0.08nm。血紅蛋白氧合時亞基的移動

去氧血紅蛋白

α1β1的移動過程氧合血紅蛋白血紅蛋白氧合時鐵原子的移動

在去氧血紅蛋白中，鐵原子向近側(cè)His方向凸起約0.06nm。氧合時，鐵原子的體積縮小，向卟啉環(huán)平面靠近約0.039nm，并牽拉近側(cè)His往血紅素平面移動，這些移動，傳遞到亞基的界面，使得亞基間的相互位置發(fā)生變化。

血紅蛋白氧合時鐵原子的移動

血紅蛋白的兩種構(gòu)象態(tài)

血紅蛋白有兩種主要構(gòu)象態(tài)，一種是T態(tài)即緊張態(tài)（tensestate），另一種是R態(tài)即松弛態(tài)（relaxedstate）。O2對R態(tài)的親和力明顯地高于對T態(tài)的親和力，并且O2的結(jié)合更穩(wěn)定了R態(tài)。缺氧時T態(tài)更加穩(wěn)定，因此T態(tài)是去氧血紅蛋白的主要構(gòu)象，R態(tài)是氧合血紅蛋白的主要構(gòu)象。T態(tài)血紅蛋白結(jié)合O2后轉(zhuǎn)變成R態(tài)，并使得分子內(nèi)一些鹽橋斷裂。

去氧血紅蛋白中各亞基間的鹽橋血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)

血紅蛋白是一個四聚體蛋白，它與肌紅蛋白相比，出現(xiàn)了一些新的性質(zhì)。血紅蛋白的氧合具有正協(xié)同同促效應(yīng)，即一個O2的結(jié)合促進同一分子其它亞基與O2的結(jié)合。具有這種性質(zhì)的蛋白質(zhì)稱為別構(gòu)蛋白（其它蛋白質(zhì)也有負協(xié)同效應(yīng)的）。

血紅蛋白的協(xié)同性氧結(jié)合

假設(shè)O2與Hb的結(jié)合是一種“全或無”的方式，其結(jié)合反應(yīng)式為則解離常數(shù)K

為…………⑦…………⑧

按照前面肌紅蛋白結(jié)合O2的定量分析的推導(dǎo)方法，Hb的氧飽和分數(shù)Y

的表達式為血紅蛋白與肌紅蛋白氧合曲線的比較血紅蛋白的實際氧合曲線推導(dǎo)氧合曲線實際氧合曲線圖中的n為Hill系數(shù)血紅蛋白推導(dǎo)氧合曲線誤差的原因

血紅蛋白結(jié)合O2并不是“全或無”的，各個亞基結(jié)合O2是依次進行的，并且前面亞基結(jié)合了O2對后面亞基與O2的結(jié)合有促進作用。實際測定的n=2.8，若n=1，則無協(xié)同作用，若n>1則有正協(xié)同作用。對于血紅蛋白來說，當(dāng)n=4時正協(xié)同作用最大，即當(dāng)1個O2與1個亞基結(jié)合后，另外3個亞基也同時與O2結(jié)合。實際情況是n=2.8。這樣，Hb對第4個O2的親和力約為與第1個O2親和力的300倍。血紅蛋白運輸氧的效率

在肺泡中，氧分壓為100torr，工作肌肉的毛細血管中約為20torr，血紅蛋白在肺泡中Y是0.97，在肌肉毛細血管中Y是0.25，釋放的O2是兩個Y值之差，即ΔY=0.72。這個差值越大，運輸O2的效率就越高。肌紅蛋白不能擔(dān)當(dāng)此項工作。

血紅蛋白別構(gòu)的異種效應(yīng)

血紅蛋白與O2的結(jié)合受其它分子的調(diào)節(jié)，如H+、CO2和2,3-二磷酸甘油酸（2,3-bisphosphateglycerate，BPG）等。雖然它們在蛋白質(zhì)分子上的結(jié)合部位離血紅素很遠，但這些分子極大地影響Hb的氧合性質(zhì)，這是別構(gòu)效應(yīng)中的異種效應(yīng)。

2,3-二磷酸甘油酸2,3-bisphosphateglycerate，BPGBohr效應(yīng)

組織中代謝作用產(chǎn)生H+和CO2，代謝越旺盛的組織，需要的O2越多，產(chǎn)生的H+和CO2也越多。CO2在體內(nèi)被水合成碳酸。

CO2水合的結(jié)果，使組織中pH下降，即[H+]上升。O2與血紅蛋白的結(jié)合受pH和CO2濃度的影響。去氧血紅蛋白對H+的親和力比氧合血紅蛋白大。因此，增加H+濃度將促進O2的釋放。HbO2

＋H+HbH+＋O2Bohr效應(yīng)

氧合血紅蛋白在組織中釋放的O2量除了受到組織中低O2濃度的作用外，還受組織中低pH的影響。后者叫做Bohr效應(yīng)，因1904年發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象的丹麥生理學(xué)家C.Bohr而得名。

產(chǎn)生Bohr效應(yīng)的原因是血紅蛋白中一些pK值處于7附近的可解離基團的作用，主要是His，它們解離與否會影響到血紅蛋白的構(gòu)象，從而影響血紅蛋白對O2的親和力。Mb和在不同pH下Hb的氧合曲線CO2與Hb的結(jié)合

血紅蛋白還能結(jié)合CO2

，結(jié)合部位是亞基N末端游離的α－NH2。CO2的結(jié)合也能促進O2的釋放。BPG與Hb的結(jié)合

2,3-二磷酸甘油酸（BPG）是血紅蛋白一個重要的別構(gòu)效應(yīng)劑（別構(gòu)抑制劑）。正常人紅細胞中約含有4.5mmol/L的BPG，約與血紅蛋白等摩爾數(shù)。每個Hb分子（四聚體）只有一個BPG結(jié)合位點，位于由4個亞基締合形成的中央孔穴內(nèi)。高負電荷的BPG分子與每個β鏈的若干個殘基的帶正電荷基團通過靜電結(jié)合于Hb分子上，BPG把兩個β鏈交聯(lián)在一起。O2的結(jié)合使中央孔穴變小，使BPG結(jié)合變得困難。在沒有BPG存在時，O2的結(jié)合容易，而在有BPG存在時，O2的結(jié)合變得困難。BPG分子結(jié)構(gòu)及其與

Hb兩個β鏈的離子結(jié)合BPG對Hb氧合曲線的影響

BPG對R態(tài)Hb的親和力至少比對T態(tài)Hb低一個數(shù)量級，BPG對R態(tài)Hb的親和力大小順序為：HbO2

>Hb(O2)2>Hb(O2)3

，而對Hb(O2)4則完全不結(jié)合。

BPG濃度越大，Hb的氧合曲線就越往右偏移，說明BPG抑制O2的結(jié)合，并增加了正協(xié)同效應(yīng)。BPG的存在可以增加Hb在組織中的卸氧量。正常情況下供給組織的氧量約為血液所能攜帶的最大氧量的40%（即ΔY=40%）。BPG對Hb氧合曲線的影響B(tài)PG的生理作用

人的某些生理性或病理性缺氧可以通過紅細胞中BPG濃度的升高而代償。當(dāng)正常人在短時間內(nèi)由海平面上升到4500m高的高山上時，紅細胞中的BPG濃度幾個小時后就開始上升，兩天內(nèi)可由4.5mmol/L增加到7.5mmol/L，使氧的釋放量增大。值得注意的是，BPG濃度增加對肺中Hb與O2的結(jié)合影響不大。三、血紅蛋白分子病鐮刀狀細胞貧血病

鐮刀狀細胞貧血病（sickle-cellanemia）是最早被認識的一種分子病。這種病在非洲某些地區(qū)十分流行（高達40%），它是由于遺傳基因的突變導(dǎo)致血紅蛋白分子中氨基酸殘基被改變造成的。鐮刀狀細胞貧血病人血紅蛋白含量僅為正常人（15～16g/100ml）的一半，紅細胞數(shù)目也是正常人（4.6～6.2×106個/ml）的一半左右，而且紅細胞的形態(tài)也不正常，除了有非常大量的未成熟紅細胞外，還有很多成鐮刀狀的紅細胞。當(dāng)紅細胞脫氧時，鐮刀狀紅細胞的數(shù)量明顯增加。這種病人的血紅蛋白稱為HbS。

正常紅細胞與鐮刀狀紅細胞貧血病人的紅細胞比較鐮刀狀細胞貧血病

鐮刀狀細胞貧血病是一種致死性疾病，它的純合子患者有的在童年就死亡。雜合子患者的壽命也不長，但它能抵抗一種流行于非洲的瘧疾。這種瘧疾也是一種致死性疾病，甚至具有正常血紅蛋白的人死于這種瘧疾的比例也很高，常常在還沒有繁殖后代就已死去。Hbs雜合子患者對這種瘧疾有一定的抵抗能力，尚能繁殖后代，這是因為雜合子患者加速被感染紅細胞的破壞而中斷瘧原蟲的生活周期的緣故。HbA和HbS的胰蛋白酶消化液的指紋圖譜（先垂直方向濾紙層析，后水平方向電泳）HbAHbSHbA和HbS氨基酸序列的比較HbAH2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys……C端HbSH2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val

-Glu-Lys……C端

（β鏈）12345678（示差異處）HbS聚集成纖維狀沉淀

β6殘基位于分子表面，當(dāng)Val取代了Glu后，在分子的表面多了一個疏水基團。血紅蛋白的氧合性質(zhì)和別構(gòu)性質(zhì)不受此變化的影響，但這一變化顯著影響了血紅蛋白的溶解度。在去氧血紅蛋白分子表面的另一處有一個疏水性口袋，正好能與這個Val側(cè)鏈結(jié)合，它們可以互相聚集成纖維狀沉淀。氧合血紅蛋白表面沒有這個疏水性口袋，所以只有在缺氧時，紅細胞才會成為鐮刀狀。

HbS聚集成纖維狀

兩股HbS鏈連鎖在一起14股鏈纖維地中海貧血

地中海貧血可以由幾條途徑產(chǎn)生：①缺失一個或多個編碼血紅蛋白鏈的基因；②所有基因都存在，但一個或