枇杷sco-pcr反應(yīng)體系的建立及應(yīng)用

枇杷sco-pcr反應(yīng)體系的建立及應(yīng)用

目標(biāo)起點(diǎn)密碼的多態(tài)性特征（scot）是2009年提出的一種新的目標(biāo)遺傳因素的分子標(biāo)記。根據(jù)植物基因的atg，提取點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計(jì)了單引用和抗?jié)B閾值，并在行頻帶中擴(kuò)展了各組。是一種能跟蹤性狀的新分子標(biāo)記技術(shù)。已被成功應(yīng)用于單子葉植物水稻和雙子葉植物花生。多倍化是植物進(jìn)化過程中普遍存在的一種自然現(xiàn)象,被認(rèn)為是植物進(jìn)化和物種形成的主要驅(qū)動(dòng)力,而多倍體育種也一直是新品種選育和遺傳改良的重要途徑,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。枇杷原產(chǎn)我國,其果實(shí)柔軟多汁,營養(yǎng)豐富,又在初夏水果淡季上市,越來越受到消費(fèi)者的喜愛和研究者的重視。前人對(duì)枇杷的研究主要以二倍體為主,在枇杷多倍體研究中,張凌媛等曾統(tǒng)計(jì)分析了枇杷氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目與倍性的相關(guān)性,汪衛(wèi)星則利用IS-SR、AFLP、GISH和MSAP等技術(shù),對(duì)天然與人工合成三倍體枇杷基因組變異及其DNA甲基化進(jìn)行了分析,而對(duì)于更多倍性枇杷植株的研究則鮮有報(bào)道。我們以多倍體枇杷為材料,利用正交設(shè)計(jì)方法對(duì)影響SCoT-PCR反應(yīng)體系的主要因素進(jìn)行優(yōu)化,以期建立適宜的SCoT分析體系,為多倍體枇杷的遺傳育種等研究提供新的技術(shù)支持。1材料和方法1.1材料和引物的篩選以4個(gè)枇杷品種的11個(gè)不同倍性株系瀘州六號(hào)(2x,3x,4x,5x),龍泉1號(hào)(2x,3x,4x),早紅3號(hào)(2x,3x,4x),軟條白沙(3x)為材料,其中軟條白沙3x用于枇杷SCoT-PCR體系的優(yōu)化和引物篩選。以上材料均定植于西南大學(xué)果樹學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)基地。所用SCoT引物序列來自于Collard等(表1),由上海生工生物工程有限公司合成。DL2000Marker,dNTPs,TaqDNA聚合酶,10×Buffer均購自寶生物工程(大連)有限公司。1.2蛋白酶kk-異戊醇的制備枇杷基因組DNA提取采用改良CTAB法,具體步驟為:取1g左右的枇杷嫩葉于液氮中充分研磨后轉(zhuǎn)入10mL離心管中,加入4mL去糖緩沖液,10000r·min-1,離心15min,棄去上清。然后加入3mL65℃預(yù)熱過的2%CTAB提取緩沖液和30μL的蛋白酶K(10g·L-1),65℃水浴1h,其間輕輕顛倒幾次。水浴結(jié)束后加入1/3體積(約1mL)4℃預(yù)冷的KAc(5mol·L-1),冰浴20min。再加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1),充分混勻,10000r·min-1,離心15min。重復(fù)抽提2次。加入等體積的異丙醇,顛倒混勻,用自制玻璃鉤將絮狀沉淀勾出,75%乙醇漂洗2次,無水乙醇漂洗1次,干燥。加入400μLddH2O溶解。純化時(shí)加入5μLRNA酶(10g·L-1),37℃保溫1h,純化產(chǎn)物溶于100μLddH2O,-20℃保存?zhèn)溆谩?.3擴(kuò)增程序的改進(jìn)PCR擴(kuò)增反應(yīng)在eppendorfMastercyclerPCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。參考Collard等和陳虎等的程序,有改進(jìn),本實(shí)驗(yàn)中采用的擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min;94℃變性1min,51.8℃退火1min,72℃延伸2min,循環(huán)36次;72℃延伸10min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,加入2μL6×Loadingbuffer,取8~10μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,紫外燈下照相。1.4倍體植株dna及pcr擴(kuò)增選用L25(56)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)。用軟條白沙三倍體植株DNA為模板,SP12為擴(kuò)增引物,每個(gè)處理重復(fù)3次。各處理總體積為20μL,每個(gè)處理的10×Buffer用量均為2μL,不足用ddH2O補(bǔ)足。1.5個(gè)溫度梯度根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果選擇最佳反應(yīng)體系對(duì)退火溫度進(jìn)行梯度試驗(yàn),設(shè)定12個(gè)溫度梯度:45℃、45.1℃、45.7℃、46.6℃、47.7℃、49℃、50.4℃、51.8℃、53℃、54.1℃、55℃、55.4℃。除退火溫度不同外,反應(yīng)程序與正交試驗(yàn)時(shí)相同。2結(jié)果與分析2.1+、引物、taq酶檢測從正交試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果電泳圖可以看出25個(gè)組合均能擴(kuò)增出條帶,只是條帶數(shù)量及條帶的清晰度有所不同(圖1)。其中組合14和15擴(kuò)增的條帶分散最好,也最清晰。根據(jù)桂騰琴等的方法,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分和統(tǒng)計(jì)分析(表3)。直觀分析結(jié)果中極差R反映了各個(gè)因素對(duì)反應(yīng)體系的影響程度,試驗(yàn)中5個(gè)因素對(duì)PCR反應(yīng)體系的影響由大到小依次為:dNTPs>Mg2+>模板DNA>引物>Taq酶。而根據(jù)各個(gè)因素水平下的數(shù)據(jù)平均值ki得出的適宜PCR反應(yīng)體系與處理組合15和14最為接近,其中與組合14的dNTPs和引物有所差異,與組合15的模板DNA用量有所不同。通過引物、dNTPs、模板DNA3個(gè)因素的效應(yīng)曲線圖(圖2)可以看出:引物濃度在0.5μmol·L-1和0.625μmol·L-1水平間差異表現(xiàn)并不顯著,結(jié)合經(jīng)濟(jì)角度考慮,選用0.5μmol·L-1作為引物的最佳用量;dNTPs用量在0.25mmol·L-1和0.35mmol·L-1水平間有較明顯的差異,從圖1也可看出,dNTPs的濃度為0.35時(shí)擴(kuò)增條帶更加清晰完整,因此,選用0.35mmol·L-1為dNTPs最適濃度;模板DNA用量從10ng到50ng與結(jié)果均值成正相關(guān),在50ng和10ng水平間有顯著差異,所以,選用50ng作為反應(yīng)體系的最佳模板DNA用量。故適合的枇杷SCoT-PCR反應(yīng)的最佳體系為:模板DNA50ng,dNTPs0.35mmol·L-1,Mg2+1.5mmol·L-1,引物0.5μmol·L-1,Taq酶0.5U,總體積為20μL。2.2溫度對(duì)電泳結(jié)果的影響利用正交設(shè)計(jì)得到的枇杷SCoT-PCR優(yōu)化體系進(jìn)行適宜退火溫度的篩選。由圖3可以看出當(dāng)退火溫度為45℃時(shí)只有一條擴(kuò)增條帶,當(dāng)退火溫度為45.1~50.4℃時(shí),電泳結(jié)果顯示有雜帶出現(xiàn),使條帶模糊,分散不清,不利于分析。溫度超過53℃時(shí)條帶開始減少,特異性增強(qiáng),但擴(kuò)增效果不太理想。只有在51.8℃時(shí)條帶最為清晰,所以引物SP12的最佳退火溫度為51.8℃。2.3scct-pcr體系和熔噴sco利用優(yōu)化的反應(yīng)體系和最適退火溫度對(duì)32個(gè)SCoT引物進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果顯示32個(gè)引物均能擴(kuò)增出清晰的條帶,擴(kuò)增條帶數(shù)多為2~10條,片段大小在150~2000bp,并且分散良好,便于統(tǒng)計(jì)分析(圖4)。說明篩選的SCoT-PCR體系和51.8℃的退火溫度適于不同引物的擴(kuò)增。選取2個(gè)引物SP20,SP27分別對(duì)瀘州六號(hào)(2x,3x,4x,5x),龍泉1號(hào)(2x,3x,4x),早紅3號(hào)(2x,3x,4x)3個(gè)品種的10個(gè)不同倍性株系進(jìn)行SCoT-PCR擴(kuò)增,2個(gè)引物對(duì)不同倍性枇杷基因組DNA的擴(kuò)增圖譜清晰,多態(tài)性豐富,說明獲得的SCoT–PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定,重復(fù)性高,擴(kuò)增效果良好,適用于多倍體和二倍體枇杷的遺傳分析。3多倍體scct-pcr反應(yīng)體系的改進(jìn)根據(jù)不同分子標(biāo)記技術(shù)產(chǎn)生的標(biāo)記基因組來源將分子標(biāo)記分為三類:隨機(jī)DNA分子標(biāo)記(RDMs)、目的基因分子標(biāo)記(GTMs)和功能性分子標(biāo)記(FMs)。RDMs已在分子生物學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,FMs的開發(fā)需要知道已鑒定出功能的基因序列信息,因而它尚沒有被廣泛開發(fā)出,只限于少數(shù)幾種植物當(dāng)中,因此,除隨機(jī)DNA分子標(biāo)記外大多數(shù)開發(fā)出的分子標(biāo)記屬于目的基因分子標(biāo)記一類。SCoT標(biāo)記是一種新型目的基因分子標(biāo)記,其具有操作簡單,重復(fù)性好,能有效產(chǎn)生和性狀連鎖的標(biāo)記,并且引物可以在物種間通用等優(yōu)點(diǎn)。但是由于不同的材料所適用的反應(yīng)體系不同,任何一個(gè)反應(yīng)因素的過少或過量都會(huì)對(duì)反應(yīng)結(jié)果和擴(kuò)增效果產(chǎn)生很大的影響。因此,在將這種新的標(biāo)記應(yīng)用于新的材料時(shí)需要對(duì)相應(yīng)的擴(kuò)增體系進(jìn)行優(yōu)化。利用正交設(shè)計(jì)方法,對(duì)SCoT-PCR反應(yīng)體系中的Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板DNA等主要因素以及退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化和篩選,發(fā)現(xiàn)dNTPs和Taq酶濃度分別是對(duì)枇杷SCoT-PCR反應(yīng)影響最大和最小的因素,這與付燕等關(guān)于枇杷IS-SR反應(yīng)中影響程度Mg2+>Taq酶>引物>模板DNA>dNTPs的結(jié)果相差較大,可見,即使有許多相似之處的不同標(biāo)記技術(shù)在同類材料上應(yīng)用所適用的反應(yīng)條件也有很大差異。篩選出的最適退火溫度51.8℃與Collard等在水稻上應(yīng)用的50℃有所不同,但都可以作為不同引物的共用退火溫度。改進(jìn)的反應(yīng)程序也能很好的完成PCR的擴(kuò)增。通過在不同倍性枇杷上的初步應(yīng)用,證明所建立的多倍體枇杷的SCoT-PCR優(yōu)化體系擴(kuò)增條帶清晰,效果良好,便于分析。在許多園藝植物中,多倍體育種一直受到研究者的重視,枇杷也不例外,作者所在的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)通過實(shí)生篩選、雜交和生物技術(shù)等方法獲得了數(shù)百株多倍