藥物的含量測(cè)定方法與驗(yàn)證

第四章藥物的含量測(cè)定方法與驗(yàn)證

基本內(nèi)容第一節(jié)滴定分析法第二節(jié)分光光度法第三節(jié)色譜法第四節(jié)藥品分析方法驗(yàn)證第五節(jié)定量分析樣品的前處理方法基本要求

一、掌握定量分析方法驗(yàn)證的效能指標(biāo)。二、熟悉定量分析樣品的前處理方法。三、了解定量分析樣品的前處理方法的進(jìn)展及在藥物分析中的應(yīng)用。含量測(cè)定：

藥物的含量測(cè)定系指運(yùn)用化學(xué)、物理化學(xué)或生物學(xué)的方法測(cè)定藥物中主要有效成分的含量。第一節(jié)容量分析法（一）容量分析法的特點(diǎn)：常用于測(cè)定高含量或中含量組分，原料藥含量測(cè)定首選比較準(zhǔn)確（相對(duì)誤差＜0.2%）；操作簡(jiǎn)單、快速；儀器普通易得；（二）有關(guān)計(jì)算

1.滴定度（T）：每1ml規(guī)定濃度的滴定液相當(dāng)于被測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量(mg)2.滴定度的計(jì)算

aA（待測(cè)物）

+bB（滴定液）

cC+dD

ab

T/M

1·m

T=m×a/b×Mm：滴定液濃度(mol/L)M：被測(cè)物分子量3.百分含量的計(jì)算（1）直接滴定法設(shè)至終點(diǎn)時(shí)，消耗滴定液體積為Vml則藥物實(shí)測(cè)質(zhì)量為V·T濃度校正因子W：供試品取樣量

（2）剩余滴定法（回滴定法、返滴定法）

藥物+A（定、過(guò)量）→················剩余的A+B→·······（回滴）······V

空白試驗(yàn)···········································V0光譜

光譜分析法

分光光度法

分類(lèi)

紫外-可見(jiàn)分光光度法

紅外分光光度法

原子吸收分光光度法

熒光分光光度法

火焰光度法第二節(jié)分光光度法

二、光譜分析法

（一）紫外-可見(jiàn)分光光度法

吸收光譜范圍：紫外：200～400nm

可見(jiàn)：400～760nm靈敏度高，可達(dá)10-4g/ml-10-7g/ml1.特點(diǎn)準(zhǔn)確度高，RSD（%）為2%-5%儀器價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，易普及，應(yīng)用廣范2.朗伯-比耳定律A=ECL

吸收系數(shù)：摩爾吸收系數(shù)ε——研究分子結(jié)構(gòu)百分吸收系數(shù)Ｅ——含量測(cè)定3.儀器的校正和檢定

波長(zhǎng)的校正：汞燈中的幾根較強(qiáng)的譜線(xiàn)或用儀器自身所帶的氘燈的特定譜線(xiàn)為參照進(jìn)行校正吸收度準(zhǔn)確性的檢定：重鉻酸鉀的硫酸溶液，規(guī)定波長(zhǎng)處測(cè)定Ｅ，應(yīng)符合規(guī)定雜散光的檢查：一定濃度的碘化鈉和亞硝酸鈉溶液，規(guī)定波長(zhǎng)處測(cè)定透光率，應(yīng)符合規(guī)定

4.對(duì)溶劑的要求:含雜原子的有機(jī)溶劑通常具有很強(qiáng)的末端吸收它們的使用范圍均不能小于截止使用波長(zhǎng)石英吸收池、空氣為空白

λ(nm)溶劑+吸收池A220～240≤0.40241～250≤0.20251～300≤0.10300以上≤0.055.測(cè)定方法

要求供試品溶液的A應(yīng)在0.3～0.7

1）對(duì)照品比較法：A供／A對(duì)＝C供／C對(duì)原料藥：制劑：2）吸收系數(shù)法：注意：應(yīng)>100應(yīng)注意儀器的校正和檢定：作為計(jì)算濃度的因數(shù)進(jìn)行定量的方法，不是任何情況下都適用的，特別時(shí)單色光不純的情況下，A會(huì)隨儀器不同而變化，誤差較大但若認(rèn)定一臺(tái)儀器，固定其工作狀態(tài)和測(cè)定條件，則C和A間的關(guān)系在多數(shù)情況下仍符合Lambert－Beer定律

3）計(jì)算分光光度法：方法有多種，具體按每種藥物規(guī)定的方法進(jìn)行。如：VA的三點(diǎn)校正法4）比色法

加入顯色劑后，按照對(duì)照品比較法測(cè)定影響顯色因素很多，故需注意平行操作空白溶劑：溶劑+顯色劑，同法處理

（二）熒光分析法

靈敏度高，可達(dá)10-10g/ml～

10-12g/ml

在低濃度進(jìn)行測(cè)定，防止自熄滅作用1.特點(diǎn)用基準(zhǔn)溶液代替對(duì)照液校正儀器靈敏度制備熒光衍生物，可提高靈敏度和選擇性

干擾因素多，需做空白實(shí)驗(yàn)樣品用量少，操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用范圍較廣

2.含量測(cè)定

原理：當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度、波長(zhǎng)、所用溶劑及溫度等條件固定時(shí)，物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度R與該物質(zhì)濃度C成正比

方法：對(duì)照品比較法計(jì)算：

第三節(jié)色譜法

根據(jù)混合物中各組分的色譜行為差異，先行分離后再在線(xiàn)或離線(xiàn)對(duì)各組分逐一進(jìn)行分析的方法，是分離分析混合物的最有力手段。

按分離原理：吸附；分配；離子交換；空間排阻分類(lèi)

按分離方法：PC；TLC；柱色譜；GC；HPLC

特點(diǎn)：高靈敏度、高效能、高速度、應(yīng)用廣泛（一）HPLC法

1.對(duì)儀器一般要求

固定相種類(lèi)、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類(lèi)型不得任意改變其他均可適當(dāng)改變色譜圖20分鐘內(nèi)記錄完畢

2.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)2分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);應(yīng)大于1.5重復(fù)性：對(duì)照液連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積RSD≤2.0％拖尾因子：T=W0.05h/2d1

應(yīng)在0.95～1.05

流動(dòng)相真空脫氣機(jī)四元泵自動(dòng)進(jìn)樣器柱溫箱紫外檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器液質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)譜檢測(cè)器流動(dòng)相：對(duì)于以C18為固定相的反相色譜系統(tǒng)，常用甲醇-水，間或加以乙腈、緩沖液等為流動(dòng)相，有機(jī)溶劑比例通常不低于5％四元泵自動(dòng)進(jìn)樣器色譜柱填充劑常用：十八烷基硅烷鍵合硅膠檢測(cè)器測(cè)定方法1)內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中主成分含量峰面積含量對(duì)照液（R）：ARCR

內(nèi)標(biāo)液（S）：ASCS供試液（X）：AXCXf=————AS/CSAR/CRf=————A’S/C’SAx/CxCx=f·————

AxA’S/C’S2)外標(biāo)法測(cè)定供試品中主成分含量對(duì)照液（R）：ARCR

供試液（X）：AXCX要求：進(jìn)樣量準(zhǔn)確、操作條件穩(wěn)定CXCRAXAR——＝——CX＝————CR·AXAR

（二）GC法1.對(duì)GC儀器一般要求

載氣：氮?dú)馍V柱：填充柱或毛細(xì)管柱填充柱：內(nèi)徑2～4mm，長(zhǎng)1～10m，內(nèi)裝吸附劑高分子多孔小球或涂漬固定液的載體毛細(xì)管柱：內(nèi)徑0.2～0.5mm，長(zhǎng)10～100m，一般為空心柱，內(nèi)壁或載體經(jīng)涂漬或交聯(lián)固定液檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器色譜圖：30分鐘內(nèi)記錄完畢

2.色譜適用性實(shí)驗(yàn)：同HPLC

3.測(cè)定法：同HPLC

第四節(jié)藥品分析方法驗(yàn)證

目的：證明采用的方法適合于相應(yīng)檢測(cè)要求。

起草藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)工藝變更制劑組分改變?cè)治龇椒ㄐ抻嗱?yàn)證內(nèi)容：準(zhǔn)確度、精密度、專(zhuān)屬性、檢測(cè)限、定量限、線(xiàn)性、范圍和耐用性均需對(duì)分析方法進(jìn)行驗(yàn)證一、準(zhǔn)確度（accuracy）：測(cè)量值與真實(shí)值接近的程度表示:回收率測(cè)定方法：回收試驗(yàn)

加樣回收試驗(yàn)含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度

1.原料藥：可用已知純度對(duì)照品或供試品進(jìn)行測(cè)定；或與已知準(zhǔn)確度的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較

2.制劑：考察其他組分和輔料對(duì)回收率的影響

①用含已知量被測(cè)物的制劑各組分混合物（包括制劑輔料）進(jìn)行測(cè)定，回收率計(jì)算同原料藥②向制劑中加入已知量的被測(cè)物進(jìn)行測(cè)定

③與已知準(zhǔn)確度的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較具體做法：

測(cè)定高、中、低三個(gè)濃度，n=3,共9個(gè)數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)價(jià)回收率；用UV和HPLC法時(shí)，一般回收率可達(dá)98%～102%；容量法可達(dá)99.7%～100.3%二、精密度（precision）：定義:

同一樣品多次測(cè)量值之間相互接近的程度表示：偏差，標(biāo)準(zhǔn)偏差,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

1.偏差(deviation,d)

d=測(cè)得值-平均值=Xi-X2.標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation,SD或S）

S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/23.

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relativestandarddeviation,RSD)

RSD=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%=S/X×100%

重復(fù)性:

同一實(shí)驗(yàn)室,同一人多次測(cè)定的精密度中間精密度:

同一實(shí)驗(yàn)室，不同人，不同儀器測(cè)定的精密度重現(xiàn)性:不同實(shí)驗(yàn)室，不同人測(cè)定的精密度數(shù)據(jù)要求

均應(yīng)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和可信限三、專(zhuān)屬性（specificity）:指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的特性（鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定方法，均應(yīng)考察其專(zhuān)屬性）

1.鑒別反應(yīng)應(yīng)能與其它共存的物質(zhì)或相似化合物區(qū)分，不含被測(cè)組分的樣品均應(yīng)呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)

2.含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定

色譜法和其他分離法，應(yīng)附代表性的圖譜，以說(shuō)明專(zhuān)屬性。

圖中注明各組分位置，色譜法中分離度應(yīng)符合要求。在能獲得雜質(zhì)的情況下，可加到試樣中，考察對(duì)結(jié)果的干擾。在雜質(zhì)和降解物不能獲得的情況下，可用以驗(yàn)證方法和藥典方法進(jìn)行對(duì)照；也可用對(duì)試樣加速破壞的方法，比較兩種方法。

四、檢測(cè)限（limitofdetection，

LOD)

是指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低濃度或量，是限度檢驗(yàn)指標(biāo)。它無(wú)需測(cè)定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。1.目視法用含已知