免疫藥實(shí)驗(yàn)方法-藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)-研究生

1影響免疫功能藥物藥理研究方法中藥藥理教研室洪敏唐仲英科技樓406Telmail:hongmin72@126.com2第一節(jié)概述一、免疫學(xué)研究概況免疫學(xué)的3個(gè)時(shí)期：

經(jīng)驗(yàn)免疫期科學(xué)免疫期現(xiàn)代免疫期3●經(jīng)驗(yàn)免疫學(xué)時(shí)期

中國明代，正式記載接種“人痘”，預(yù)防天花

18世紀(jì)中葉，英國醫(yī)生EdwardJenner種牛痘預(yù)防天花目前，通過全球性大面積疫苗接種我們已經(jīng)消滅了天花病毒45●科學(xué)免疫學(xué)時(shí)期

病原菌的發(fā)現(xiàn)與疫苗使用的推廣

19世紀(jì)中葉，顯微鏡的改進(jìn)使人們可在鏡下直接觀察到細(xì)菌，導(dǎo)致病原菌的發(fā)現(xiàn)。

1850年，首先在感染羊的血液中看到了炭疽桿菌。

Pasteur證明實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的炭疽桿菌能使動(dòng)物感染致病，并且發(fā)明了液體培養(yǎng)基，以培養(yǎng)細(xì)菌。

Koch發(fā)明固體培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)結(jié)核桿菌成功，提出病原菌致病的概念。EmilvonBehring1854-1917,NobelPrizein1901fordemonstratingthatcirculatingantitoxinsagainstdiphtheria（白喉）andtetanus（破傷風(fēng)）toxinsconferredimmunity.LouisPasteur1822-1895,Fatherofimmunology,attenuatedbacteriaandvirusesasvaccineagainstanthrax（炭疽）…..EdwardJenner1749-1822Successfulvaccinationagainstsmallpox（天花）RobertKoch1843-1910,NobelPrizein1905forhisworkontuberculosis（肺結(jié)核）,Anthrax（炭疽）,Cholera（霍亂）,Tuberculebacillus（結(jié)核桿菌）8科學(xué)免疫學(xué)時(shí)期的重要成就

減毒疫苗的發(fā)明抗毒素的發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體的發(fā)現(xiàn)血清學(xué)方法的建立免疫化學(xué)的研究●現(xiàn)代免疫學(xué)時(shí)期

免疫應(yīng)答細(xì)胞和T細(xì)胞亞類的發(fā)現(xiàn)免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說的提出

抗體生成克隆選擇學(xué)說的提出細(xì)胞因子研究進(jìn)展免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展（免疫標(biāo)記技術(shù)）免疫耐受現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)ClonalSelectionTheory（Burnet學(xué)說,

1960年諾貝爾獎(jiǎng)）體內(nèi)存有能識(shí)別各種抗原的細(xì)胞克隆(clone)，每一細(xì)胞表面均有對(duì)特定抗原的受體，能與相應(yīng)抗原結(jié)合而識(shí)別它們?？乖淖饔迷谟谶x擇與其相應(yīng)的細(xì)胞克隆與其受體結(jié)合后，引起細(xì)胞的增殖分化，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。胎生期免疫細(xì)胞與自己抗原相接觸形成天然自身耐受狀態(tài)（禁忌細(xì)胞系）免疫細(xì)胞系可突變產(chǎn)生與自己抗原發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞系可形成自身免疫反應(yīng)此學(xué)說對(duì)免疫學(xué)中的根本問題——自我識(shí)別有了比較滿意的解釋，對(duì)免疫學(xué)中的其他重要問題，諸如免疫記憶、免疫耐受性、自身免疫性等現(xiàn)象也能作出恰當(dāng)?shù)恼f明，因此被人們廣為接受，成為現(xiàn)代免疫學(xué)的理論基礎(chǔ)。

1112●研究進(jìn)展1.抗原識(shí)別受體多樣性的產(chǎn)生2.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的發(fā)現(xiàn)3.細(xì)胞程序性死亡途徑的發(fā)現(xiàn)4.造血與免疫細(xì)胞的發(fā)育5.應(yīng)用免疫學(xué)的發(fā)展

(1)DNA疫苗

(2)基因工程制備重組細(xì)胞因子

(3)免疫細(xì)胞治療

(4)完全人源抗體

(5)口服自身抗原,預(yù)防自身免疫病13二、免疫功能的病理生理及免疫功能的調(diào)節(jié)

●免疫應(yīng)答：是機(jī)體借助理化屏障及神經(jīng)體液調(diào)節(jié)控制，通過免疫細(xì)胞及有關(guān)的體液因子（抗體or淋巴因子等）發(fā)揮識(shí)別自己、排除異己，以維持機(jī)體內(nèi)外環(huán)境統(tǒng)一的一種功能?！穹翘禺愋悦庖邞?yīng)答：是機(jī)體防御異物進(jìn)入機(jī)體以及對(duì)進(jìn)入體內(nèi)異物的清除作用，是機(jī)體與生俱來的免疫功能?！裉禺愋悦庖邞?yīng)答：是機(jī)體發(fā)育過程中接觸抗原后發(fā)展而成的免疫力，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。14免疫應(yīng)答的3個(gè)階段：

（1）感應(yīng)期抗原進(jìn)入機(jī)體后，多數(shù)由單核－巨噬細(xì)胞攝取與加工，再將抗原信息傳遞給T、B淋巴細(xì)胞，使之能特異性地識(shí)別抗原。（2）增殖分化期抗原激活――淋巴細(xì)胞――T、B淋巴細(xì)胞――致敏淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞。（3）效應(yīng)期再次遇到抗原――致敏淋巴細(xì)胞、抗體――細(xì)胞免疫、體液免疫。15161819免疫病理與免疫性疾病按發(fā)病機(jī)制不同,免疫性疾病分為：

超敏反應(yīng)性疾病

免疫缺陷?。合忍煨约袄^發(fā)型免疫缺陷病

自身免疫病：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡,干燥綜合征,多發(fā)性硬化

移植排斥和移植物抗宿主反應(yīng)速發(fā)型：由抗體介導(dǎo)，發(fā)作快如：哮喘、蕁麻疹等遲發(fā)型：由細(xì)胞免疫介導(dǎo)，發(fā)作慢見于結(jié)核病、接觸性皮炎20目前臨床所用的影響免疫功能的藥物有：

●免疫增強(qiáng)藥：胸腺素、卡介苗、干擾素（免疫調(diào)節(jié)）、左旋咪唑等。

●免疫抑制藥：環(huán)孢素A、他克莫司、糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺、抗淋巴細(xì)胞球蛋白?！裰兴庮悾弘p向免疫調(diào)節(jié)，如：人參、黃芪、靈芝、豬苓、枸杞、銀耳、鹿茸、云芝等植物多糖。免疫抑制，如：川烏總堿、氧化苦參堿、雷公藤多苷、生物堿等。21中國醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析,2009;9(10):726-72922三、研究的基本要求（一）動(dòng)物的選擇

由于免疫反應(yīng)和基因類型有關(guān)，盡可能用純系動(dòng)物。如純系小鼠和大鼠，并控制鼠齡、性別和體重，以減少個(gè)體差異。若用雜種動(dòng)物，最好用同窩動(dòng)物。23（二）動(dòng)物模型

1、模型特點(diǎn)和要求（1）正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（2）免疫功能低下的動(dòng)物模型（腫瘤、衰老、慢性病均可造成免疫功能低下）

①免疫抑制劑造模（如環(huán)磷酰胺、氫化可的松、環(huán)孢霉素A）②輻射引起免疫功能低下動(dòng)物模型

24常用的免疫抑制劑

1.環(huán)磷酰胺：80～100mg/kg，Sc，5天后免疫功能顯著降低。

2.氫化可的松：50～100mg/kg，Sc，6～8天后免疫功能顯著降低。

3.抗淋巴細(xì)胞血清（ALS）:ip0.2ml，5～6天后免疫功能顯著降低。

4.60Co或X射線600～800拉德照射1次，4日后免疫功能顯著降低，動(dòng)物存活時(shí)間顯著縮短。25（3）免疫缺陷動(dòng)物

Nude小鼠：該小鼠先天性無胸腺，細(xì)胞免疫力低下，失去正常T細(xì)胞功能。但其B淋巴細(xì)胞功能基本正常。BALB/c–nu、NC-nu、C3H-nu、Swiss-nu

Scid小鼠：即重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠。Scid小鼠外觀與普通小鼠差別不大，有毛，被毛白色，體重發(fā)育正常。但胸腺、脾、淋巴結(jié)的重量不及正常的30%，組織學(xué)上表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞顯著缺陷。BALB/c-Scid26（4）自身免疫性疾病模型：

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、多發(fā)性硬化癥

（5）過敏性疾病模型：

哮喘，過敏性鼻炎，接觸性皮炎等27

佐劑性關(guān)節(jié)炎模型是免疫性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的基本方法。造模多采用大鼠,足跖部皮下注射法,原發(fā)病變主要表現(xiàn)為致炎局部的炎癥反應(yīng),續(xù)發(fā)病變一般于致炎后10-20天左右出現(xiàn),20天左右達(dá)到高峰,病理改變?yōu)榛は陆M織炎癥,滑膜增生,血管翳形成,軟骨破壞,4周后,關(guān)節(jié)紅腫減退,骨質(zhì)減少,新骨形成,關(guān)節(jié)間隙變窄,形成不可逆的關(guān)節(jié)改變。AA大鼠的關(guān)節(jié)組織病理學(xué)及血中變化與人相似,同時(shí),對(duì)其免疫學(xué)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),此模型存在明顯的細(xì)胞免疫異常。28II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型II型膠原+完全弗氏佐劑,乳化制成乳劑,將該乳劑于小鼠的尾根部皮內(nèi)注射致炎,腹腔注射乳劑作為激發(fā)注射。表現(xiàn)為多發(fā)性外周關(guān)節(jié)炎,關(guān)節(jié)局部紅腫,嚴(yán)重致關(guān)節(jié)畸形,病理變化為增生性滑膜炎,關(guān)節(jié)軟骨破壞,骨侵蝕,關(guān)節(jié)腔內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤,體內(nèi)可檢出針對(duì)自身型膠原的高滴度的IgG抗體,這些臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與人密切相關(guān)。不出現(xiàn)病情的波動(dòng)和復(fù)發(fā)情況,也沒有的皮下結(jié)節(jié),漿膜炎,血管炎等表現(xiàn),不出現(xiàn)類風(fēng)濕因子及抗核抗體29卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型卵蛋白+福氏佐劑混勻,注入動(dòng)物背部皮下,致敏,末次注射后一周于關(guān)節(jié)內(nèi)注入溶解的卵蛋白,24小時(shí)內(nèi)此關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫熱痛等急性炎癥的表現(xiàn),發(fā)病率達(dá)100%。卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型的病理改變有滑膜增生、血管翳形成和軟骨及骨破壞。第一階段為關(guān)節(jié)內(nèi)注入抗原后,24小時(shí)出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹,關(guān)節(jié)直徑增加,病理表現(xiàn)為急性滑膜炎。第二階段為1-4周,關(guān)節(jié)滑膜明顯增生,血管翳形成?；ぜ?xì)胞以單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為主,其次為淋巴細(xì)胞,以CD4+淋巴細(xì)胞多見,這一階段部分動(dòng)物可出現(xiàn)早期軟骨破壞。第三階段在4周后,不可逆的關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞出現(xiàn),最后可出現(xiàn)骨變形。最長的觀察到6個(gè)月,慢性炎癥仍存在,證明卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型與在發(fā)病機(jī)理上的某些類似。302、觀察指標(biāo)（1）非特異性免疫功能的測定指標(biāo)（2）體液免疫功能的測定指標(biāo)（3）細(xì)胞免疫功能的測定指標(biāo)3、給藥途徑和劑量4、對(duì)照實(shí)驗(yàn)31（1）組間對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照組弱陽性對(duì)照組（2）自身對(duì)照（3）配對(duì)對(duì)照對(duì)照組陰性對(duì)照組空白對(duì)照組假處理對(duì)照組陽性對(duì)照組32第二節(jié)實(shí)驗(yàn)方法一、影響非特異性免疫功能實(shí)驗(yàn)（一）碳粒廓清法【基本原理】

網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）是機(jī)體最主要的防御系統(tǒng)，具有強(qiáng)大而迅速的吞噬廓清異體顆?；蚰承┛扇苄援愇锏哪芰?，并能迅速清除體內(nèi)自身產(chǎn)生的某些有害物質(zhì)。當(dāng)靜脈注入特定大小的惰性顆粒后，它即可被RES細(xì)胞迅速吞噬而從血流中廓清，因此，可借助測定血流中炭粒的消失速度來反映RES吞噬異物的能力。33【實(shí)驗(yàn)步驟】（1）取小鼠，隨機(jī)分組，給藥。（2）末次給藥后30min，每鼠iv印度墨汁0.05～0.1ml/10g體重。（3）于1min（t1）和5min（t5）后，每鼠眼眶靜脈取血20ml，加到2ml0.1%NaCO3溶液中搖勻。（4）測OD680nm，計(jì)算廓清指數(shù)（K）、吞噬指數(shù)。34

廓清指數(shù)K＝＝吞噬指數(shù)α＝×

即校正廓清指數(shù)35【注意事項(xiàng)】

（1）印度墨汁應(yīng)用NS稀釋1～5倍左右，最好經(jīng)超聲處理后離心，棄去沉淀物，以免凝集的炭粒阻塞肺毛細(xì)血管，引起動(dòng)物猝死。印度墨汁的質(zhì)量可影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，墨汁顆粒大小有嚴(yán)格要求，過大則不被吞噬，過小則被其他吞噬細(xì)胞吞噬，如小吞噬細(xì)胞。印度墨汁因顆粒大小均勻，能特異性地被單核巨噬細(xì)胞所吞噬，因而適用于本實(shí)驗(yàn)。（2）iv要熟練，印度墨汁的劑量、取血時(shí)間必須準(zhǔn)確無誤。另外，取血的時(shí)間間隔也可延長至10分鐘。36【評(píng)價(jià)】

印度墨汁法測定RES吞噬活性是最經(jīng)典的一種免疫學(xué)研究方法，實(shí)驗(yàn)條件要求不高，方法簡便，結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好。若再配合小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬消化雞紅血球?qū)嶒?yàn)及白細(xì)胞游走實(shí)驗(yàn)，則可較全面地反映單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)清除異物功能狀態(tài)。37（二）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞法【基本原理】

Mφ具有強(qiáng)大的吞噬能力，雞紅細(xì)胞對(duì)鼠類是一種較強(qiáng)的抗原性異物，當(dāng)其被注入小鼠腹腔后，可引起腹腔Mφ聚集并吞噬，注入定量雞紅細(xì)胞（CRBC），隔一定時(shí)間后，吸取腹腔Mφ，鏡檢其吞噬活性，并以吞噬百分率及吞噬指數(shù)的高低表示Mφ吞噬能力的大小。38【實(shí)驗(yàn)步驟】

（1）取18～22g小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分組。（2）若篩選免疫抑制藥，預(yù)先用Mφ誘導(dǎo)劑，可在實(shí)驗(yàn)前3～4天，ip0.5％淀粉生理鹽水溶液，每鼠0.5ml。（3）4天后，ip，5％CRBC0.5ml。8～12h后脫頸椎處死小鼠，ip2mlNS，輕揉腹部1min，然后吸出洗液1ml，分滴于兩片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，移置37℃孵箱溫育30min。（4）用NS漂洗，除去未粘片的細(xì)胞。晾干，1∶1丙酮－甲醇溶液固定5min。4％（V/V）Giemsa－磷酸緩沖液染色3min，用流水沖洗、晾干，鏡檢。39【結(jié)果判定】

油鏡下計(jì)每片200個(gè)Mφ，計(jì)算吞噬百分率、吞噬指數(shù)。吞噬百分率＝×100％吞噬指數(shù)＝÷240CRBC被消化的程度，通常分4級(jí)：

Ⅰ級(jí)：未消化。CRBC完整，胞質(zhì)淺紅或淺黃帶綠色，胞核呈淺紫紅色。

Ⅱ級(jí)：輕度消化。胞質(zhì)淺黃綠色，胞核固縮呈紫藍(lán)色。

Ⅲ級(jí)：重度消化。胞質(zhì)淡染，胞核呈淺灰黃色。

Ⅳ級(jí)：完全消化。Mφ內(nèi)僅見形態(tài)類似CRBC大小的空泡，邊緣整齊，胞核隱約可見。41【注意事項(xiàng)】

（1）實(shí)驗(yàn)各步驟均需保持無菌操作。Mφ誘導(dǎo)劑僅用于免疫抑制藥研究。（2）若滴片染色過深，可用1%HCl脫色，過淺則可復(fù)染。（3）每鼠兩片的計(jì)數(shù)應(yīng)基本一致，若差距過大，應(yīng)予淘汰。腹腔吸出的液體若有血性滲出時(shí)，則不宜使用。42（4）掌握好實(shí)驗(yàn)時(shí)間，時(shí)間太短，吞噬雞紅細(xì)胞較少，過長則雞紅細(xì)胞已被消化。（5）避免腹腔注射受試藥物，以免干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果?！驹u(píng)價(jià)】

本法簡便，但操作慢而欠精確，可配合其他方法進(jìn)行綜合分析。43（三）巨噬細(xì)胞吞噬作用的化學(xué)發(fā)光測定法【基本原理】

化學(xué)反應(yīng)中電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，在其回到基態(tài)過程中，以光的形式釋放能量or將能量轉(zhuǎn)移到另一分子而發(fā)射光子，利用發(fā)光檢測儀測定發(fā)射光的強(qiáng)度or速度，即可計(jì)算發(fā)光物質(zhì)or發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的抗原or抗體的含量。測定發(fā)光強(qiáng)度的方法，即光子計(jì)數(shù)法，可用液體閃爍儀進(jìn)行測定。

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Mφ吞噬顆粒or受其他生物與化學(xué)因子刺激后，細(xì)胞代謝猛增，其特征是耗氧量增加，產(chǎn)生大量自由基（氧負(fù)離子、過氧化氫、羥自由基、單線態(tài)氧），同時(shí)，往往伴有化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，但十分微弱，難以檢測。若在體系中加入魯米諾等發(fā)光增強(qiáng)劑，就能增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度，因?yàn)檠趸瘎┘ぐl(fā)魯米諾，可發(fā)出425nm的光，易被檢測到。45【操作步驟】

（1）用HBSS將Mφ調(diào)整至2×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液備用。（2）取細(xì)胞懸液1ml，置聚乙烯小管中，加入10-4M魯米諾200ml，將小管放入液閃測量瓶中，測定發(fā)光6秒鐘，作為本底。（3）加入調(diào)理的酵母多糖200ml，搖勻，即刻測發(fā)光6秒鐘，以后每隔3～5min測一次發(fā)光，直至加酵母多糖1h。（4）以發(fā)光強(qiáng)度（cpm）為縱坐標(biāo)，加酵母多糖后的時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制Mφ吞噬發(fā)光的動(dòng)力曲線。比較各組的峰高、峰時(shí)（峰高的時(shí)間）、發(fā)光積分值及早期曲線斜率的變化。46【注意事項(xiàng)】

（1）注意無菌操作。所用試管、滴管、緩沖液等均需高壓滅菌，應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)操作，避免污染。（2）用臺(tái)盼藍(lán)染色，Mφ活力應(yīng)在90％以上。（3）所用藥物應(yīng)能完全溶解，懸浮的微粒將會(huì)影響Mφ的反應(yīng)性。（4）小試管與測量瓶先置暗室24h，整個(gè)操作系統(tǒng)均在暗室進(jìn)行。47【方法評(píng)價(jià)】

（1）本法也可檢測Mφ氧代謝功能與血清調(diào)理作用，故作為檢測吞噬功能的指標(biāo)的專一性不夠。（2）因液閃儀無溫控裝置，不能使反應(yīng)系統(tǒng)達(dá)到37℃，只能通過恒定的室溫（25±1℃）與水浴37℃進(jìn)行間接控制。48（四）溶菌酶測定法【基本原理】

溶菌酶是一種小分子蛋白質(zhì)，存在于機(jī)體的淚液、痰、鼻涕、WBC、血清等。測定它在體液or分泌物中的含量及其變動(dòng)情況，可作為側(cè)面了解機(jī)體防御功能的一個(gè)指標(biāo)。體液和分泌物中的溶菌酶活性，可通過檢查其對(duì)指定敏感菌株的裂解作用來進(jìn)行測定。492種測定法：（1）光學(xué)測定法：將檢品與菌液混合，用分光光度計(jì)觀察指定時(shí)間內(nèi)透光度改變的百分?jǐn)?shù)。（2）平板打孔測定法：在混有菌液的瓊脂凝膠上打孔，檢品放在孔內(nèi)，一定時(shí)間后測定溶菌環(huán)直徑。50二、影響特異性體液免疫功能的實(shí)驗(yàn)方法（一）血清溶血素測定法【基本原理】

經(jīng)SRBC免疫動(dòng)物的淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素），并釋放至外周血。這種抗體在試管內(nèi)與SRBC溫育，在補(bǔ)體（正常血清中的一組酶蛋白，具有溶解和殺傷細(xì)胞，增強(qiáng)吞噬等作用）參與下可產(chǎn)生溶血反應(yīng)，通過測定血紅蛋白的釋放量多少來間接測出血清中溶血素的含量。血紅蛋白與都氏試劑反應(yīng)形成氰化血紅蛋白后比色測定。51【操作步驟】

（1）免疫：小鼠，ip20％SRBC0.2ml/天，第4天取血、分離血清，將血清稀釋后供測定（一般500倍以上）。（2）溶血反應(yīng)：在試管內(nèi)依次加入血清1ml、5％SRBC0.5ml、10％補(bǔ)體1ml，置37℃水浴30min，然后移至冰浴中終止反應(yīng)，1500rpm離心5min，取上清1ml，加都氏液3ml，搖勻放置10min，測OD540nm。52（3）SRBC半數(shù)溶血值：取5％SRBC0.25ml加都氏液4ml，測OD540nm。（4）計(jì)算：樣品管半數(shù)溶血值HC50：每只鼠的血清HC50＝

×稀釋倍數(shù)53【評(píng)價(jià)】

（1）簡單易行，快速，重復(fù)性好。測定HC50較準(zhǔn)確，客觀，可克服溶血空斑法用肉眼計(jì)數(shù)的錯(cuò)誤。（2）本實(shí)驗(yàn)用615純種小鼠測出的數(shù)據(jù)比較穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。54（二）抗體形成細(xì)胞測定法（PFC）1溶血空斑試驗(yàn)（haemolyticplaqueassay，HPA）【基本原理】

PFC是一種體外檢測單個(gè)抗體形成細(xì)胞（漿細(xì)胞）的方法。將SRBC免疫的小鼠脾細(xì)胞、SRBC、補(bǔ)體混合于瓊脂內(nèi)，抗體形成細(xì)胞分泌的抗體在補(bǔ)體的參與下，使其周圍的SRBC的溶解形成肉眼可見的溶血空斑，這種溶血空斑大體上可以反映抗體形成細(xì)胞數(shù)。方法：瓊脂固相法（平皿法）：常用。

液相單層細(xì)胞法（玻片法）：很少使用。56直接溶血空斑試驗(yàn):測定產(chǎn)生IgM型抗體的細(xì)胞。因?yàn)榛罨a(bǔ)體的能力強(qiáng)，只加細(xì)胞和補(bǔ)體即可出現(xiàn)空斑，故稱直接溶血空斑測定。間接溶血空斑試驗(yàn):產(chǎn)生其他類型抗體的（如IgG或IgA等）細(xì)胞檢測，需要加靶細(xì)胞和抗各類Ig的抗血清,再加補(bǔ)體才能出現(xiàn)可見的空斑，故稱間接溶血空斑測定。57【操作步驟】（1）瓊脂固相法――直接法

1）免疫動(dòng)物：選用純系小鼠，隨機(jī)分組，每鼠腹腔注射5％的SRBC0.2ml致敏。

2）制備補(bǔ)體，同前。

3）制備底層瓊脂：稱取1.4g瓊脂糖加入100mlGey’s液中，煮沸，溶化后分裝若干只預(yù)溫的試管，每管5ml，置45℃恒溫水浴保溫。然后傾入水平放置的平皿（直徑9cm）中，凝固后打開平皿蓋，將平皿反扣放入37℃溫箱1h，備用。584）制備脾細(xì)胞懸液：免疫后第4天，用冷Gey’s制備107/ml脾細(xì)胞懸液，置4℃冰箱備用。5）上層瓊脂的制備：稱取0.7瓊脂糖加入100mlGey’s液中煮沸，溶化后分裝若干只預(yù)溫的試管，每管1.5ml，置45℃恒溫水浴保溫。逐個(gè)取出，依次加入SRBC懸液（2×109/ml）0.1ml、107/ml脾細(xì)胞懸液0.1ml，充分混勻，立即傾入上述制備好的底層瓊脂平皿中，均勻鋪平，凝固后靜止10min。596）將平皿置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，每皿中加入1∶10稀釋的豚鼠血清1.0ml，均勻覆蓋于表面，繼續(xù)溫育40～50min，取出后置室溫1h，4℃冰箱過夜，次日傾去補(bǔ)體，or加入0.25%的戊二醛（NS配置），使細(xì)胞固定后計(jì)數(shù)空斑。60

7）空斑計(jì)數(shù)與評(píng)定：用放大鏡or雙目解剖鏡可見每個(gè)空斑由抗體分泌細(xì)胞及其周圍的透明區(qū)域組成。計(jì)數(shù)每個(gè)平皿（106個(gè)細(xì)胞）的空斑數(shù)。（2）瓊脂固相法――間接法：在上述5）中再加入適當(dāng)濃度的抗-Ig血清0.1ml，其他步驟相同。61

【注意事項(xiàng)】（1）SRBC既是免疫細(xì)胞，又是靶細(xì)胞和指示細(xì)胞，故SRBC要新鮮，洗滌不得超過3次，每次離心5min。用Alsever’s液保存的SRBC可使用2周。（2）為了消除非特異性溶血，豚鼠血清在使用前必須經(jīng)SRBC吸收，補(bǔ)體的濃度以1∶10稀釋為宜。62（3）制備脾細(xì)胞懸液：若將取出的脾立即放入0℃冰浴，可明顯降低空斑計(jì)數(shù)；在20℃以下操作，不超過15min，對(duì)空斑計(jì)數(shù)并無影響。（4）測定抗血清的顯斑常數(shù)（KD）和抑斑常數(shù)（KI），作為空斑計(jì)數(shù)的校正。63

（5）傾注底層瓊脂糖時(shí)，一定要將平皿放置水平位置，以便使底層瓊脂糖水平光滑。傾上層瓊脂糖時(shí)，各種細(xì)胞成分要充分混勻。不能劇烈震蕩，以免出現(xiàn)氣泡。水浴溫度應(yīng)控制在47～49℃之間，溫度過高使細(xì)胞變性；過低使瓊脂糖凝固，影響細(xì)胞分散。642分光光度法【基本原理】

又稱SRBC的定量溶血測定法，基本原理同溶血空斑法。但本法可定量測定抗體形成細(xì)胞所分泌的抗體，較溶血空斑法精確。同時(shí)操作比較簡便。65【操作步驟】

（1）免疫動(dòng)物：同前。（2）制備脾細(xì)胞懸液：基本同前，制成5×106/ml脾細(xì)胞懸液，或按15mg脾重/ml制成脾細(xì)胞懸液。（3）溶血反應(yīng)：取試管若干只，每管依次加入脾細(xì)胞懸液、0.2％SRBC、1∶10豚鼠血清各0.5ml，充分混勻，另設(shè)不加補(bǔ)體的空白組。置37℃水浴中溫育1h，離心3000rpm，5min。（4）測OD值：取上清測OD413nm。66【注意事項(xiàng)】

（1）若使用雜種鼠時(shí)，宜將每兩只小鼠的脾混合液制備脾細(xì)胞懸液，可減少實(shí)驗(yàn)誤差。（2）反應(yīng)系統(tǒng)中其他條件不變時(shí)，SRBC濃度可根據(jù)受試藥的免疫增強(qiáng)or抑制作用作適當(dāng)調(diào)整。67三、影響特異性細(xì)胞免疫功能的實(shí)驗(yàn)方法（一）淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（3H-TdR摻入法）【基本原理】

淋巴細(xì)胞在有絲分裂原的刺激下，轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞，并分化增殖，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加，并釋放多種淋巴因子。如在培養(yǎng)液中加入3H-TdR，使其摻入到新合成的DNA中，可以定量細(xì)胞內(nèi)的DNA合成強(qiáng)度。68有絲分裂原：