發(fā)酵工程制藥-維生素和輔酶類藥物的發(fā)酵制藥

生物制藥工藝課程輔酶Q10的發(fā)酵制藥

輔酶Q10是輔酶Q類的重要成員之一，它是一種脂溶性醌類化合物，又稱泛醌，萬有醌等。其成品為黃色或淡橙黃色的結(jié)晶性粉末，無嗅、無味。熔點47－50℃。易溶于氯仿、苯、四氯化碳，溶于丙酮、乙醚、石油醚，微溶于乙醇，不溶于水、甲醇。結(jié)構(gòu)中有異戊烯基，見光易分解，使顏色變深（微紅色物質(zhì)）。輔酶Q10簡介

輔酶Q10廣泛存在于酵母、植物的葉和種子，以及動物的心臟、脾臟、肝臟和腎臟中。在人體內(nèi)，主要集中在肝、心、腎、腎上腺等組織，人體內(nèi)輔酶Q10總含量在500-1500mg之間。輔酶Q10是重要的抗氧化劑和免疫增強劑。主要用于心肌梗死、狹心癥、心律失常、竇性心動過速、早搏、高血壓和癌癥的輔助治療等，以及用于急慢性病毒性肝炎、亞急性肺壞死的綜合治療。1.保護心臟、營養(yǎng)心肌心臟在運轉(zhuǎn)中需要消耗大量的能量和營養(yǎng)，輔酶Q10有助于提高心肌攜氧量，提高心肌活力。心肌活力提高，便能發(fā)揮更強勁的脈動能力。這樣體內(nèi)的血液循環(huán)就更加順暢。同時輔酶Q10還能穩(wěn)定心臟脈沖和心臟導(dǎo)電系統(tǒng)，減低患心律異?；蛐募聠栴}的風險。輔酶Q10的作用及作用機理輔酶Q10缺乏三羧酸循環(huán)抑制ATP下降血紅細胞攜氧能力下降心肌缺氧心肌細胞心臟能動力不足心肌缺血心臟病2.防治高血壓輔酶Q10對血管能產(chǎn)生抗老化作用，使血管更具彈性，防止動脈硬化，血壓自然也就更為平穩(wěn)。3.抗衰老輔酶Q10通過直接與過氧化物自由基反應(yīng)，并且可以再生vE，獨力并協(xié)同vE發(fā)揮抗氧化劑的作用。有效清除體內(nèi)自由基，延緩人體衰老。4.增強免疫力隨年齡增長的免疫功能下降是自由基和自由基反應(yīng)的結(jié)果，輔酶Q10作為一種強抗氧化劑單獨使用或與維生素B6(吡哆醇)結(jié)合使用可抑制自由基對免疫細胞上受體與細胞分化和活性相關(guān)的微管系統(tǒng)的修飾作用，從而增強免疫系統(tǒng)，提高人體抵抗力。5.抗疲勞輔酶Q10是細胞自身產(chǎn)生的天然抗氧化劑和細胞代謝啟動劑，具有保護和恢復(fù)生物膜結(jié)構(gòu)完整性、穩(wěn)定膜電位的作用，是機體的非特異性免疫增強劑，因此顯示出很好的抗疲勞作用，輔酶Q10使細胞保持良好健康的狀態(tài)，因而機體充滿活力，精力旺盛，腦力充沛。6.保護皮膚 輔酶Q10可以減弱光子的氧化反應(yīng)，在生育醇的協(xié)助下可以啟動特異性的磷酸化酪氨酸激酶，防止DNA的氧化損傷，抗紫外線，保護皮膚免于損傷。7.增強肌肉能量人體內(nèi)適當含量的輔酶Q10對于維持肌肉功能是必需的。輔酶Q10的濃度低于正常值的20%時，細胞線粒體復(fù)合體功能活性嚴重下降，導(dǎo)致能量供應(yīng)不足，從而影響人體活動能力。每天補充100-150mg的輔酶Q10，可明顯改善肌肉營養(yǎng)失調(diào)人的狀況。輔酶Q10還可加速脂肪的代謝，清脂減肥，使肢體和大腦能量供應(yīng)充裕，精力旺盛。8.抑制他汀類藥物副作用他汀類藥物在抑制膽固醇合成的同時也會抑制體內(nèi)輔酶Q10的生成，老年病人身上更容易產(chǎn)生體內(nèi)輔酶Q10不足的現(xiàn)象，在使用他汀類藥物的同時一定要補充輔酶Q10，這樣能夠迅速緩解他汀類藥物引起的肌痛和疲勞，抵消與他汀類藥物有關(guān)的肌肉疼痛和肝臟損傷。9.抗腫瘤近年來的研究表明，輔酶Q10有抗腫瘤作用，此外輔酶Q10的補充對于經(jīng)歷阿霉素這樣心臟毒性藥物化療的癌癥患者也很重要。

第一點輔酶Q10含量多少，直接關(guān)系著心臟的安危，可以說，一切心臟病都從輔酶Q10缺失開始。德克薩斯大學研究證明，心臟病患者的輔酶Q10自身存量明顯低于正常人群；心臟病情越重，輔酶Q10含量就越低。為此，研究人員在對600名年過百歲的老人進行體檢時驚訝地發(fā)現(xiàn)，在這些壽星的血液中，輔酶Q10含量之高竟可與40歲的中年人相比。輔酶Q10無疑在“搶救心臟”中發(fā)揮了根本性、保護性、修復(fù)性、輔助性等不可代替、不可或缺的作用。四.人體為什么要補充輔酶q10

人體內(nèi)輔酶Q10含量下降25%時，許多疾病就會產(chǎn)生，特別是心臟疾??；更加可怕的是輔酶Q10含量下降超過75%時，生命就會終止。人體缺少輔酶Q10，通常容易患冠心病，心力衰竭，心律失常，心肌梗塞等多種心臟疾病。

輔酶Q10對心臟保健作用主要表現(xiàn)為，抗心肌缺血，增加心輸出量，降低外周血管阻力，有助于抗心衰和抗心律失常等，心臟病患者長期補充輔酶Q10，可根治心臟疾病。

第二點人體中輔酶Q10的總含量僅為500-1500mg，并隨著人體年紀的增長，輔酶Q10的含量逐漸下降。一般超過20歲體內(nèi)的輔酶Q10就會日漸稀少，到了60歲，體內(nèi)輔酶Q10更是只有20歲時的三分之一。

輔酶Q10作為唯一體內(nèi)合成的脂溶性抗氧化劑，在抗衰老、抗疲勞維持機體的青春及活力方面發(fā)揮著卓越的作用。對健康維持推薦的每日劑量為50mg，在治療各種疾病中需要更高的劑量。心臟、大腦是輔酶Q10展現(xiàn)神奇功效的場所，這兩個人體重要器官含有的輔酶Q10占人體總含量的60%。

衰老從心血管循環(huán)開始，心臟的勞損首當其沖，接著大腦的功能衰退。因此為了保護心臟，預(yù)防衰老，維持機體的青春及活力，我們就必須補充輔酶Q10。

飲食中的輔酶Q10攝取量很少，遇上胃腸功能不好的朋友，輔酶Q10的有效吸收率更加少。假如為了保證每天50mg的輔酶Q10補充量，讓您一天吃下3斤牛肉，或者4斤豬肉這是誰都無法接受的。雖然蔬菜中輔酶Q10含量并不低，可是每天要吃下8斤蔬菜，又有誰能做得到呢？

補充輔酶Q10刻不容緩，勢在必行！

二十世紀八十年代初期日本實現(xiàn)了從煙葉中提取茄呢醇為原料合成生產(chǎn)輔酶Q10，至使輔酶Q10成本大幅度下降，這對于輔酶Q10的應(yīng)用、普及和推廣起到了重要的推動作用。半化學合成法技術(shù)上比較成熟，已實現(xiàn)了工業(yè)化，產(chǎn)品成本低，價格適中。但是使用半化學合成法生產(chǎn)的產(chǎn)品雖然在價格上有優(yōu)勢，但在使用上比用生物提取法生產(chǎn)的產(chǎn)品有較大的差距。原因在于生物提取法生產(chǎn)的是天然的、有機的產(chǎn)品，易于被人體吸收轉(zhuǎn)化，而化學合成法生產(chǎn)的是人工化學合成的有機產(chǎn)品，生物活性極差，不易被人體吸收，難以充分發(fā)揮輔酶Q10的藥理作用。關(guān)于輔酶Q10化學合成方法一直是國內(nèi)外研究的熱點，近半個世紀來，經(jīng)歷了1977年發(fā)達國家實現(xiàn)了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10，近幾年微生物發(fā)酵提取法得到了長足的發(fā)展，這種全新的生物工程方法，既綜合了生物提取工藝和化學合成工藝兩種方法的優(yōu)點，又克服了它們的缺點，因此是最令人矚目的有希望實現(xiàn)工業(yè)化的方法。

微生物發(fā)酵提取法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)主要有兩個方面要求：（1）要求有穩(wěn)定的規(guī)?；a(chǎn)工藝的高質(zhì)量輔酶Q10的轉(zhuǎn)基因菌種；（2）要求有高精度分離儀器的技術(shù)。日本是世界上最早也是最主要的輔酶Q10生產(chǎn)國。據(jù)統(tǒng)計，全球90%的輔酶Q10來自日本。輔酶Q10產(chǎn)量最高的兩家日本公司是“日清制粉”和“協(xié)和發(fā)酵株式會社”。

中國從二十世紀七十年代開始進行輔酶Q10的技術(shù)研究，并很快建設(shè)了幾條生物提取法生產(chǎn)線，主要從豬心肌中提取，國內(nèi)采用生物提取工藝生產(chǎn)輔酶Q10單位主要有北京制藥廠、泰州生物化學制藥廠、青島生物化學制藥廠、杭州制藥廠、長沙生物化學制藥廠、浙江天臺縣制藥廠、貴陽生物化學制藥廠、個舊生物化學制藥廠、太原市生物化學制藥廠、大同市生物化學制藥廠等十幾家企業(yè)?？偵a(chǎn)能力在600kg左右。

中國是世界上主要的煙草生產(chǎn)國，中國有大量不能用于卷煙的廢次煙葉，未得到利用，造成環(huán)境污染和資源浪費。早在二十世紀七十年代后期中國就開始著手進行廢煙葉提取茄尼醇的研究與開發(fā)工作。

二十世紀九十年代初期，中國投入了大量的精力進行輔酶Q10新工藝的研究，并取得了可喜的成果。河南大學煙草化學科技開發(fā)研究所與商丘煙草精細化工廠合作共同研究開發(fā)了利用煙草提取茄尼醇，在多年研究的基礎(chǔ)上，于1996年元月正式實現(xiàn)工業(yè)化，可以年產(chǎn)100噸含量≥15%的茄尼醇粗品和20噸含量為≥75%的茄尼醇精品，為中國輔酶Q10的工業(yè)化生產(chǎn)打下了良好的基礎(chǔ)。

開發(fā)的半合成法工藝是以對甲基苯酚為原料通過溴代，醚化、氧化獲得甲基二甲氧基苯醒，然后與從煙草或馬鈴薯葉子中提取茄呢醇縮合得到輔酶Q10。該方法的關(guān)鍵是如何將側(cè)鏈連接到母環(huán)上。全合成法

1988年Eem和Kanan開發(fā)的全合成法生產(chǎn)輔酶Q10工藝是唯一成功的全合成法技術(shù)，但是由于合成線性不飽和側(cè)鏈存在一定難度。以及合成條件苛刻，與工業(yè)化還有一定的距離。

半合成法

醇一堿皂化制造法該工藝輔酶Q10的收率為61.2mg/kg新鮮豬心，這是國內(nèi)普遍采用工藝。在乙醇的存在下，長時間的皂化可能導(dǎo)致輔酶Q10中的甲氧基和乙醇中乙氧基換位，生成單或雙乙氧基衍生物，為了避免這些雜質(zhì)的生成?？梢杂肒OH代替NaOH和甲醇皂化，但也必須加入焦性沒石子酸，否則輔酶Q10在皂化過程中全部被破壞，加入量占起始原料的5%-7%，皂化過程中可以通入氮氣。醇一醚混合提取法，該工藝與醇一堿皂化制造法工藝相似，只是省去了皂化反應(yīng)。生物提取法是世界上最古老最基本的生產(chǎn)工藝，一段時間以來曾經(jīng)是輔酶Q10唯一的生產(chǎn)方法。但由于動植物中輔酶Q10含量低、各種化學成分復(fù)雜，原料來源受限制（主要從動物新鮮肝臟中提?。?，因此產(chǎn)品成本高、價格昂貴，規(guī)?；a(chǎn)受到了一定的限制。細胞培養(yǎng)法

植物細胞培養(yǎng)技術(shù)是將植物體的某一部分經(jīng)過無菌處理后，置于人工培養(yǎng)基上使其細胞增殖，進而按需要進行培養(yǎng)的技術(shù)。植物的各個部位，如根、莖、葉、花、果、花藥和花粉等都可以作為外植體來啟動細胞培養(yǎng)，所形成的脫分化細胞團稱為愈傷組織，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)稱為懸浮培養(yǎng)。

生物提取法

1977年實現(xiàn)了重組微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10。這種生產(chǎn)工藝被認為是最有前途的合成工藝，近幾年來微生物發(fā)酵法成為國內(nèi)外開發(fā)的熱點。紅極毛桿菌、脫氮極毛桿菌，甲烷微環(huán)菌等是生產(chǎn)輔酶Q10的主要菌種。

發(fā)酵法

由于輔酶Q10是微生物發(fā)酵所得的細胞內(nèi)產(chǎn)物,故其提取過程中首先需要進行細胞破壁,因此細胞破碎是提取輔酶Q10的關(guān)鍵步驟之一,直接影響著輔酶Q10的生物活性、收率和成本。

1.皂化提取法皂化提取法是將輔酶Q10提取物中含有的大量脂肪酸甘油酯及各種游離脂肪酸等非水溶性組分轉(zhuǎn)移到水相，而脂溶性的輔酶Q10則留在有機相，再使用有機溶劑抽提，從而提高其純度和提取量。常見的皂化提取法主要有醇堿皂化提取法和堿皂化提取法。（1）醇堿皂化提取法醇堿皂化提取法的一般方法為：首先向菌體中加入質(zhì)量分數(shù)為7%左右的焦性沒食子酸，再緩慢加入1.3~1.5倍提及的氫氧化鈉-乙醇溶液攪拌，再加入正己烷進行回流提取，迅速冷卻至室溫。然后用適量石油醚多次萃取，水洗至中性，再取水濃縮，真空弄碎旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，最后用無水乙醇溶解。醇堿皂化法中，由于乙醇的存在下，長時間的皂化可能導(dǎo)致輔酶Q10中甲氧與乙醇中乙氧基換位，生成單或雙乙氧基衍生物。輔酶Q10的提取（2）堿皂化提取法堿皂化提取法的一般方法為：首先向菌體中加入酸性水，水浴加熱回流3h后，緩慢加入稀釋一定倍數(shù)的氫氧化鈉，再回流一段時間，迅速冷卻至室溫。然后加入用有機溶劑浸提2~3次，取上清液水洗至中性，再取水濃縮，真空濃縮旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，最后用無水乙醇溶解。

常見的細胞破碎方法有：有機溶劑攪拌、研磨、超聲波、溶菌酶酶解輔助超聲凍融輔助超聲法等破碎方法。

生物制藥工藝課程維生素C的發(fā)酵制藥

又名抗壞血酸（Ascorbicacid）是細胞氧化-還原反應(yīng)中的催化劑，它釋放兩個氫原子后變成氧化型維生素C，有供氫體存在時，脫氫抗壞血酸可以接受兩個氫原子變成抗壞血酸，參與機體新陳代謝，增加機體對感染的抵抗力。用于防止壞血酸和抵抗傳染性疾病，促進創(chuàng)傷和骨折愈合，以及用作輔助藥物治療。維生素C

維生素C(多羥基不飽和內(nèi)酯衍生物)分子中有兩個手性碳原子，故有4種光學異構(gòu)體，其中L（+）抗壞血酸效果最好，其他三種臨床效果很低或無效。1.化學結(jié)構(gòu)

白色粉末，無臭、味酸、熔點190-192℃，易溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚，氯仿及石油醚等。它是一種還原劑，易受光、熱、氧等破壞，尤其在堿液中或有微量金屬離子存在時，分解更快，但干燥結(jié)晶較穩(wěn)定。2.性質(zhì)（1）化學合成法萊氏法化學合成（2）發(fā)酵法一步發(fā)酵、二步發(fā)酵（3）生物提取法從鮮棗、獼猴桃水果中提取維生素C當前生產(chǎn)維生素C主要采用的是微生物發(fā)酵法。3.維生素C的生產(chǎn)方法（1）萊氏法化學合成工藝1）工藝路線[轉(zhuǎn)化]

[酸化]HCl[氧化]NaOH,O2,KMnO4

[酮化]H2SO4丙酮[加氫]H2D-葡萄糖D-山梨醇雙丙酮-L-山梨糖維生素CL-山梨糖[酶菌氧化]O2雙丙酮-L-古龍酸2-酮-L-古龍酸

①山梨醇發(fā)酵菌種醋酸菌屬可使山梨醇氧化成山梨糖，一般用A.Suboxyclans和A.Melangenum。②發(fā)酵條件溫度為26-30℃，最適pH為4.4-6.8。pH4.0以下菌的活性受影響。用0.5%酵母浸膏為主要營養(yǎng)源，山梨醇濃度為19.8%，通氣量1800ml/min，30℃培養(yǎng)33h，山梨糖收率可達97.6%。氮源：無機氮源不能利用，使用有機氮源。金屬離子的影響：Ni2+、Cu2+能阻止菌的發(fā)育，鐵能妨礙發(fā)酵，為了使發(fā)酵順利進行，需用陽離子交換樹脂將山梨醇中的金屬離子去掉。2）工藝過程

整個合成過程中必須保持第4位碳原子的構(gòu)型不變；維生素C的總收率約60%。

C-4內(nèi)酯化、C-2烯醇化：酸轉(zhuǎn)化：配料比2-酮基-L-古龍酸：38%鹽酸：丙酮=1：0.4：0.3（質(zhì)量/體積）堿轉(zhuǎn)化：先形成2-酮基-L-古龍酸甲酯，加NaHCO3轉(zhuǎn)化生成維生素C鈉鹽，經(jīng)氫型離子交換樹脂酸化，在50-55℃下減壓烘干，得粗品維生素C。(2)兩步發(fā)酵工藝原理

兩步發(fā)酵工藝流程2-酮-L-古龍酸[內(nèi)酯化，烯醇化]

[生物轉(zhuǎn)化]

假單孢菌D-山梨醇維生素C（L-抗壞血酸）L-山梨糖[氧化]

醋酸桿菌1）D-山梨醇的化學合成

50%葡萄糖溶液在75℃下加入活性炭，用石灰乳液調(diào)節(jié)pH8.4，加鎳催化劑，通氫氣，壓力3.43MPa，反應(yīng)溫度140℃。反應(yīng)結(jié)束后，靜置沉降出去催化劑，反應(yīng)液經(jīng)離子交換樹脂、活性炭處理后，減壓濃縮，得到含量60-70%的D-山梨醇，無色透明或微黃色透明粘稠液體，收率約97%。2）2-酮-L-古龍酸的微生物發(fā)酵第一步發(fā)酵：黑醋酸桿菌（從D-山梨醇到L-山梨糖）第二步發(fā)酵：葡萄糖酸桿菌和巨大芽孢桿菌混合培養(yǎng)發(fā)酵罐：氣升式反應(yīng)器，100立方米。3）2-酮-L-古龍酸的分離純化發(fā)酵液中：2-酮-L-古龍酸8%，雜質(zhì)有菌絲體、蛋白質(zhì)和懸浮的固體顆粒等。除雜操作：加熱、離心。萊氏法是最早生產(chǎn)維生素C的方法,其以葡萄糖為原料,先經(jīng)黑醋菌發(fā)酵生成L-山梨糖,再經(jīng)丙酮化及NaClO氧化、水解得到2-酮-L古龍酸鈉,然后進行化學合成得到維生素C。此法存在著很多缺陷,如生產(chǎn)工藝復(fù)雜、勞動強度大、生產(chǎn)環(huán)境惡劣、易對人體造成傷害,因此人們不斷對此工藝進行改進。兩步發(fā)酵工藝

發(fā)酵：此法省略了酮化和NaClO氧化過程,簡化了工藝，極大地改善了操作環(huán)境。除主耗山梨醇消耗較高外，其他輔料消耗較低。且多為液體反應(yīng)，物料輸送方便，更有利于生產(chǎn)連續(xù)化和操作自動化。但此法仍存在很多缺點，如占地面積大、發(fā)酵基質(zhì)濃度低、在高濕高溫條件下染菌機率高、設(shè)備利用率低、后續(xù)處理能耗高等問題。在未來的工藝優(yōu)化過程中，除了進行發(fā)酵工藝改進外,更應(yīng)注重優(yōu)良菌種的選育。發(fā)酵液的提取工藝是維生素C生產(chǎn)行業(yè)中較為重視的問題。經(jīng)過兩次發(fā)酵后,發(fā)酵液的含量僅為6%～9%，且殘留有菌絲體、蛋白質(zhì)和懸浮微粒等，分離提純較為困難。傳統(tǒng)的處理方法有加熱沉淀法和化學凝聚法。針對以上兩種方法中存在的缺點和不足，一種新的處理方法———超濾法在維生素生產(chǎn)中得以應(yīng)用。此法具有操作方便、節(jié)能、不造成新的環(huán)境污染等優(yōu)點。此法與加熱沉淀法相比，可在常溫下操作，減少了有效成分的損失;且為后步樹脂交換提供了有利的條件,減少了樹脂的污染，從而有利于提高樹脂的