發(fā)酵工程制藥-氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)類藥物的發(fā)酵制藥

生物制藥工藝課程谷氨酸的發(fā)酵制藥

發(fā)展前景

2008年，我國(guó)氨基酸的總產(chǎn)量已超過(guò)120萬(wàn)噸，其中谷氨酸占97%，我國(guó)谷氨酸鈉的總產(chǎn)量已超過(guò)170萬(wàn)噸，比2005年增長(zhǎng)了23.75%，全國(guó)谷氨酸及其鹽銷售總收入高達(dá)177.9億元，行業(yè)實(shí)現(xiàn)利潤(rùn)12.6億元，各公司的利潤(rùn)普遍上升。由于國(guó)內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)企業(yè)普遍重視質(zhì)量管理，故出口谷氨酸及其鹽的數(shù)量逐年遞增，2006年，我國(guó)谷氨酸及其鹽的出口量已突破10萬(wàn)噸大關(guān)從而成為我國(guó)醫(yī)藥業(yè)又一拳頭產(chǎn)品。國(guó)內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)企業(yè)的谷氨酸產(chǎn)品已銷往包括英、法、意大利、西班牙、比利時(shí)、瑞士和美國(guó)在內(nèi)的世界57個(gè)國(guó)家，從而確立了全球第一谷氨酸生產(chǎn)大國(guó)地位。

生產(chǎn)流程

谷氨酸產(chǎn)生菌的擴(kuò)大培養(yǎng)

為了生產(chǎn)大批量的谷氨酸，就需要更多的谷氨酸生產(chǎn)菌，因此就必須對(duì)谷氨酸生產(chǎn)菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。我國(guó)主要使用菌株為北京棒狀桿菌ASI1.299.

擴(kuò)大培養(yǎng)普遍采用二級(jí)種子流程，即：

斜面菌種（33~34℃，培養(yǎng)18~24h

）→一級(jí)種子培養(yǎng)（1000mL三角瓶裝入適量培養(yǎng)基200ml，滅菌后置于沖程7.6cm、頻率96次／min的往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度33~34℃

）→二級(jí)種子培養(yǎng)（種子罐中培養(yǎng)，32~34℃

，7~8h，無(wú)雜菌）→發(fā)酵罐。活菌濃度達(dá)到108個(gè)/ml，活力旺盛，菌體健壯。

淀粉水解糖的制備

由于大部分產(chǎn)生菌不能直接利用淀粉和糊精，因此要將淀粉原料水解為葡萄糖，可采用雙酶法，先用淀粉酶將原料分解為糊精和低聚糖，再用糖化酶進(jìn)一步水解為葡萄糖。

谷氨酸的發(fā)酵機(jī)制及工藝控制

生產(chǎn)原料包括碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及管生長(zhǎng)因子等。發(fā)酵原料的選擇既要考慮生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)，還需要有利于谷氨酸的積累及易于提取。葡萄糖丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸天冬氨酸檸檬酸α-酮戊二酸谷氨酸反饋抑制優(yōu)先合成

增強(qiáng)反饋抑制

逆轉(zhuǎn)反饋抑制①②③CO2CO2乳酸磷酸烯醇丙酮酸

谷氨酸發(fā)酵條件控制1溫度的控制生產(chǎn)菌最適生長(zhǎng)溫度為30~32`C，谷氨酸形成最適溫度為34~37`C。2PH的控制前期控制在7.5左右，對(duì)抑制雜菌生長(zhǎng)有利，中后期控制在7.2左右，這樣谷氨酸脫氫酶活性最強(qiáng)，若后期PH過(guò)高，菌體自溶，谷氨酸變成谷氨酰胺。3菌齡及接種量控制一級(jí)種子菌齡11~12h，二級(jí)種子菌齡7~8h，接種量1%為好。

谷氨酸的提取等電點(diǎn)法是提取谷氨酸最簡(jiǎn)單的一種方法，此法操作簡(jiǎn)便，設(shè)備簡(jiǎn)單。1等電點(diǎn)法的原理PH<3.22谷氨酸以陽(yáng)離子形式存在。PH=3.22其分子內(nèi)部呈電中性，溶液中總靜電荷為零，谷氨酸分子間相互撞，結(jié)合成較大聚合體沉淀，此時(shí)谷氨酸溶解度最小。PH>3.22谷氨酸以陰離子形式存在，影響到谷氨酸析出的主要因素為：谷氨酸的含量、T、加酸速度，攪拌、菌體大小及多少。2操作要點(diǎn)發(fā)酵液

排入電桶測(cè)T、PH測(cè)氨基酸含量攪拌冷卻至30℃加鹽調(diào)PH形成晶核靜止4~6h放出上清液清除結(jié)晶深沉表層少量菌體取出氨基酸結(jié)晶離心分離常提高谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)率的措施一、選育高產(chǎn)菌種

途徑：可通過(guò)菌種自發(fā)突變過(guò)程中挑選出來(lái)，也可利用物理或化學(xué)誘變劑處理微生物細(xì)胞群，促使其突變，然后挑選出符合目的的育種誘變株，還可利用體外DNA重組、原生質(zhì)體融合等技術(shù)創(chuàng)造出高產(chǎn)菌。

優(yōu)勢(shì)：谷氨酸脫氫酶活力強(qiáng)、氧化還原氨基化反應(yīng)強(qiáng)、二氧化碳固定反應(yīng)強(qiáng)、異檸檬酸脫氫酶活力強(qiáng)、不分解和利用谷氨酸、耐高糖，高濃度谷氨酸。二、根據(jù)菌種特征控制最適宜的發(fā)酵條件

如：生物素、磷、PH、氧傳遞速度、氧化還原電位及溫度等。三、追加糖液法

即采用較低初糖濃度和大接種量以利于菌體迅速繁殖獲得生產(chǎn)需要的足夠強(qiáng)壯的菌體的一種方法。

噬菌體與雜菌的防治一、

谷氨酸發(fā)酵中噬菌體的污染與防治1.谷氨酸噬菌體的主要特征：具有非常專一的寄生性不耐熱性PH的穩(wěn)定性嗜氧性對(duì)干燥的穩(wěn)定性不耐藥性二、谷氨酸發(fā)酵污染噬菌體后的異?，F(xiàn)象1.發(fā)酵液光密度在初期開始上升，而后又下降或不上升2.發(fā)酵液PH逐漸上升，4~8小時(shí)內(nèi)可達(dá)8.0以上，且不下降3.不耗糖或耗糖緩慢4.泡沫大，粘度大，有時(shí)呈膠狀，可拔絲5.發(fā)酵周期長(zhǎng)，產(chǎn)酸低或不產(chǎn)酸三、防治噬菌體污染的主要措施1.嚴(yán)格控制活菌體的排放2.嚴(yán)防噬菌體進(jìn)入種子罐或發(fā)酵罐3.發(fā)酵罐中污染噬菌體后的搶救輪換菌種法滅噬菌體法放罐重消毒谷氨酸發(fā)酵中雜菌的污染與防治1.檢查雜菌的方法

顯微鏡檢查法、培養(yǎng)皿劃線檢查法、肉湯培養(yǎng)檢查法2.雜菌污染的防治（1）雜菌污染的主要原因分析種子帶菌罐體與管件滲漏所引起的染菌死角及空氣系統(tǒng)染菌（2）雜菌污染的防治與挽救一級(jí)種子經(jīng)平板檢查無(wú)菌后方可接到二級(jí)種子中二級(jí)種子冷卻，10攝氏度以下保壓12~16小時(shí)，平板檢驗(yàn)無(wú)雜菌后，再接入發(fā)酵罐。發(fā)酵0~6小時(shí)后，大幅度染菌，鏡檢發(fā)現(xiàn)球菌，應(yīng)放罐重消毒，消毒溫度適當(dāng)降低。發(fā)現(xiàn)染菌的罐，下次空罐消毒加入甲醛后，再用蒸汽熏蒸，甲醛的用量一般為0.12~0.17升/立方米。

由谷氨酸制成味精

谷氨酸的中和、脫色、和除鐵中和液的除鐵目前除鐵、鋅離子的方法主要由硫化鈉和樹脂法兩種。硫化鈉除鐵是利用其離子狀態(tài)下能與鐵、鋅生成沉淀物的原理除鐵。樹脂法除鐵是利用弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂，吸附鐵或鋅得以除去。谷氨酸的中和

在中和時(shí)，要控制投料比適當(dāng)，即濕谷氨酸與水之比為1：2，濕谷氨酸與純堿之比為1：0.3~0.4，中和溫度60~65`C，控制PH為6.7~7.0。中和液的脫色物理方法：活性炭脫色化學(xué)方法：離子交換脫色法中和液的濃縮和結(jié)晶1.中和液的濃縮：通常由兩種方法（1）降低溶液的溫度使溶質(zhì)的溶解度減小，達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)。（2）在溫度不變的情況下，蒸發(fā)掉溶液的一部分水，使溶液濃度升高，達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)。2.谷氨酸納的結(jié)晶析出基本過(guò)程：濃縮、起晶、整晶、育晶、放罐要求：雜質(zhì)含量少，透光度在百分之九十以上3.干燥、包裝和成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)生物制藥工藝課程谷胱甘肽的發(fā)酵制藥

谷胱甘肽（glutathione）是一種由3個(gè)氨基酸組成的短肽，存在于幾乎身體的每一個(gè)細(xì)胞中，但是谷胱甘肽必須在有產(chǎn)生的細(xì)胞及其前體（Vc和α-硫辛酸）的條件下才可以有效地在人體內(nèi)工作，谷胱甘肽能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)的功能，在細(xì)胞中，谷胱甘肽主要發(fā)揮抗氧化劑的作用。谷胱甘肽由谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸組成，分子中半胱氨酸的-SH是主要的功能性基團(tuán)。谷胱甘肽廣泛分布于自然界的生物體中(Wierzbicka等，1989)，主要存在于酵母、動(dòng)物肝臟、肌肉、血液中，許多植物，如蔬菜、豆類、谷物、薯類、菇類及細(xì)菌中也含有一定量的谷胱甘肽。GSH的簡(jiǎn)介及結(jié)構(gòu)谷胱甘肽的氧化與還原谷胱甘肽的理化性質(zhì)

晶體呈無(wú)色透明細(xì)長(zhǎng)粒狀，溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酞胺，而不溶于醇、醚和丙酮。谷胱甘肽固體較為穩(wěn)定，而水溶液在空氣中則易被氧化，兩分子還原型谷胱甘肽(GSH）的活潑巰基氧化縮合為二硫鍵，即得到氧化型谷胱甘肽（GSSG）。谷胱甘肽分子量為307．33，熔點(diǎn)189～193℃(分解)，晶體是無(wú)色透明細(xì)長(zhǎng)柱狀(板狀)，等電點(diǎn)(PI)為5．93，成品見光易分解，易氧化。在氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽中，只有還原型谷胱甘肽才具有生理活性，而生物體內(nèi)的氧化型谷胱甘肽需要還原后才能發(fā)揮其重要的生理功能。因此，我們?cè)谔崛」入赘孰臅r(shí)，可以在溶液中加入具有強(qiáng)還原性的物質(zhì)如維生素C等，當(dāng)存在這些強(qiáng)還原性的物質(zhì)時(shí)可以保護(hù)谷胱甘肽不容易被氧化。GSH的生理功能1.抗自由基,保護(hù)細(xì)胞2.解除外源性有毒物質(zhì)(包括藥物)的毒性3.促進(jìn)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)4.參與轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)丙氨基反應(yīng),維持肝細(xì)胞正常功能5.參與膽紅素代謝6.促進(jìn)膽酸代謝,減輕出血傾向7.是多種酶的輔基或輔酶GSH在疾病上的應(yīng)用易與碘乙酸、芥子氣（一種毒氣）、鉛、汞、砷等重金屬鹽絡(luò)合，也能與某些藥物（如撲熱息痛）、毒素（如自由基、重金屬）等結(jié)合，把機(jī)體內(nèi)有害的毒物轉(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)，排泄出體外。GSH與溶血性疾病的治療。保護(hù)紅細(xì)胞膜上的巰基免遭氧化物的損害，保護(hù)紅細(xì)胞膜的完整性，從而維持紅細(xì)胞的正常的結(jié)構(gòu)與功能。GSH與糖尿病的治療。SH參與葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌，血漿中GSH/GSSG的比率可影響細(xì)胞對(duì)葡萄糖的反應(yīng)性，此比率的增加可改善糖尿病患者外周胰島素的作用提高血液中GSH的水平，減少氧化損傷的程度和增加胰島素的敏感性。還參與肝炎、角膜炎、白內(nèi)障及視網(wǎng)膜疾病動(dòng)脈粥樣硬化病的治療。

生產(chǎn)成本和研究進(jìn)展目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上還原型谷光甘肽的原料藥價(jià)格在4000元/kg以上，而谷胱甘肽的生產(chǎn)成本約1500元/kg左右谷胱甘肽的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法。目前，化學(xué)合成法和提取法已經(jīng)工業(yè)化，酶轉(zhuǎn)化法正在進(jìn)行廣泛研究，尚未用作GSH的工業(yè)化生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法用于谷胱甘肽的生產(chǎn)是當(dāng)前世界上主要的生產(chǎn)方法，國(guó)外谷胱甘肽的主要產(chǎn)地在日本，國(guó)內(nèi)谷胱甘肽的研究起步較晚，現(xiàn)在主要還是在一些研究院校內(nèi)，處于研究階段，沒有形成一定的生產(chǎn)規(guī)模。谷胱甘肽的生產(chǎn)工藝·萃取法萃取法經(jīng)常用于從高含谷胱甘肽的動(dòng)植物組織中提取谷胱甘肽的一種常用方法，也是生產(chǎn)谷胱甘肽的經(jīng)典方法?！せ瘜W(xué)合成法基礎(chǔ)原料均用的是谷胱甘肽化學(xué)式中的三種主要成分即谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸?！っ阜ɡ蒙矬w含有谷胱甘肽合成酶L一谷氨酸．L一半胱氨酸及甘氨酸為底物，并加少量三磷酸腺苷即合成谷胱甘肽?！ぐl(fā)酵法谷胱甘肽在1888年，由deRey-Pailhade從酥母中分離出谷胱甘肽以后，谷胱甘肽從酵母中提取的工藝也越來(lái)越成熟，并且已經(jīng)成為目前生產(chǎn)谷胱甘肽普遍采用的方法。酵母發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽工藝流程圖誘變劑→酵母→高產(chǎn)酵母→熱水抽提→離心→調(diào)PH值→樹脂吸附→酸洗脫→新鮮的CuO沉淀→離心沉淀物→H2S置換→離心過(guò)濾→濃縮→脫色→噴霧干燥→成品菌種的選育：酵母菌選育抗乙硫氨酸突變株：γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶是催化谷胱甘肽合成的主要酶。他受谷胱甘肽的反饋抑制，乙硫氨酸是谷胱甘肽的結(jié)構(gòu)類似物，低濃度時(shí)促進(jìn)谷胱甘肽的合成，高濃度時(shí)要抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和谷胱甘肽的合成。選育抗鋅離子的突變株：zn是多種脫氫酶，脫羧酶和肽酶的輔因子，在低濃度時(shí)促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)能使谷胱甘肽還原酶活性中心變構(gòu)失活，抑制胞內(nèi)谷胱甘肽的繼續(xù)合成。培養(yǎng)基：碳源：葡萄糖蔗糖糖蜜葡萄糖是最佳碳源。氮源：牛肉膏蛋白胨酵母膏牛肉膏是最佳氮源。單一氮源對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和谷胱甘肽的產(chǎn)量明顯優(yōu)于有機(jī)氮源，混合無(wú)機(jī)氮源對(duì)谷胱甘肽的產(chǎn)量有明顯的提高。無(wú)機(jī)鹽離子：微生物在缺乏Mg時(shí)，不能合成谷胱甘肽；Mg過(guò)量會(huì)抑制谷胱甘肽的合成。在10mmol/L時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大。溫度：較高的溫度有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是低溫更有利于谷胱甘肽的合成。因此前期控制37培養(yǎng)菌體，后期降低溫度增加谷胱甘肽的合成。PH：細(xì)胞生長(zhǎng)最適PH和產(chǎn)物合成最適PH并不一致。一般細(xì)胞生長(zhǎng)最適PH為7.2，產(chǎn)物合成最適PH為6.7。溶氧：通氣量控制在5L/min時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速達(dá)到300r/min即可滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和谷胱甘肽合成對(duì)溶解氧的需求。前體物質(zhì)：1）谷氨酸半胱氨酸甘氨酸混合物。開始時(shí)加入會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和谷胱甘肽的合成油抑制作用，在發(fā)酵12小時(shí)以后（進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期）添加會(huì)提高谷胱甘肽的產(chǎn)量。