試驗二食品中總氮的測定

實驗二食品中總氮的測定（二）原理有機物中的氮在強熱和濃HSO作用下，生成（NH）SO，在凱氏定氮器中與堿作用，24424通過蒸餾釋放出氨，用硼酸將氨吸收后以鹽酸標準溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，計算蛋白質含量。（三）儀器與試劑定氮蒸餾裝置（如圖3-1），微量滴定管。2．硫酸銅，硫酸鉀，硫酸。2%硼酸溶液稱取20g硼酸溶解在少量蒸餾水中，再稀釋至1000ml?；旌现甘緞?份0.1％甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合。40%氫氧化鈉溶液40g氫氧化鈉溶解于蒸餾水中，再稀釋至100ml。0.05mol／L鹽酸標準溶液（四）操作步驟樣品處理精密稱取0.2?2.0g固體樣品或2?5g半固體樣品或吸取10?20ml液體樣品（約相當?shù)?0?40mg）,移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加人0.2g硫酸銅、3g硫酸鉀及20ml硫酸，稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45°角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。小心加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h。取下放冷，小心加20ml水。放冷，移人100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容置瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸按同一方法做試劑空白試驗。按圖3.1裝好定氮裝量，于水蒸氣發(fā)生瓶內裝水至約2/3處，加甲基紅指示液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠以防暴沸，用調壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內的水。向接收瓶內加入10m12%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插人液面下，吸取10.0ml樣品消化稀釋液由小玻杯流入反應室，以10ml水洗滌小玻杯并使其流入反應室內，塞緊小玻杯的棒狀玻塞。將10m140%氫氧化鈉溶液倒人小玻杯，提起玻塞使其緩緩流人反應室，立即將玻塞蓋緊，并加水于小玻杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾。蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內，蒸餾5min。移動接收瓶，使冷凝管下端離開液面，再蒸餾1min，然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05mol/L鹽酸標準溶液滴定至灰色或藍紫色為終點。同時吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。%3-1微■凱氏定氮蒸%3-1微■凱氏定氮蒸18裝?1—電爐；2—水蒸氣發(fā)生器;3—螺旋夾$4—小玻杯X="W—%>X竺X6°14xFX100式中：X—樣品中蛋白質的含量，％V.—樣品消耗鹽酸標準液的體積，mlV2—試劑空白消耗鹽酸標準液的體積，mlAf—鹽酸標準溶液的摩爾濃度，mol/L袒一樣品的質量（體積），牡mJF—氮換算為蛋白質的系數(shù)0.014—lmol/L鹽酸標準溶液1ml相當于氮克數(shù)蛋白質中的氮含量一般為15%?17.6%,按16%計算乘以6.25即為蛋白質含量，乳制品的蛋白質換算系數(shù)為6.38，面粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為5.95，大豆及其制品為5.71,肉與肉制品為6.25,大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83,芝麻、向日葵為5.30。（五）注意事項消化要在通風櫥內進行,消化時要把附在管壁上的食物用少量硫酸沖下,使消化完全。蒸餾時要隨時注意防止蒸餾器漏水漏氣等現(xiàn)象的發(fā)生。蒸餾時向反應室內加NaOH動作要快，玻璃塞塞嚴并立即用少量水密封，以免氨的逸出。3．嚴禁酸堿污染硼酸吸收液及沖洗用水。測定前應先用標準（NH4）SO做氮回收率的測定，借以驗證所用儀器，試劑及操作24等條件的可靠性。氮回收率應在95%與105%之間?？偟臏y定堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法GB11894—89Waterquality-Determinatlonoftotalnitrogen-Alkalinepotassiumpersulfatedigestion-UVspectrophotometricmcthod主題內容與適用范圍主題內容本標準規(guī)定了用堿性過硫酸鉀在120?124°C消解、紫外分光光度測定水中總氮的方法。適用范圍本標準適用于地面水、地下水的測定。本法可測定水中亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氨、無機銨鹽、溶解態(tài)氨及大部分有機含氮化合物中氮的總和。氮的最低檢出濃度為0.050mg/L,測定上限為4mg/L。本方法的摩爾吸光系數(shù)為1.47X103L?mol—l?cm—1。測定中干擾物主要是碘離子與溴離子，碘離子相對于總氮含量的2.2倍以上，溴離子相對于總氮含量的3.4倍以上有干擾。某些有機物在本法規(guī)定的測定條件下不能完全轉化為硝酸鹽時對測定有影響。定義2.1可濾性總氮：指水中可溶性及含可濾性固體(小于0.45“m顆粒物)的含氮量?？偟褐缚扇苄约皯腋☆w粒中的含氮量。原理在60°C以上水溶液中，過硫酸鉀可分解產(chǎn)生硫酸氫鉀和原子態(tài)氧，硫酸氫鉀在溶液中離解而產(chǎn)生氫離子，故在氫氧化鈉的堿性介質中可促使分解過程趨于完全。分解出的原子態(tài)氧在120?124C條件下，可使水樣中含氯化合物的氮元素轉化為硝酸鹽。并且在此過程中有機物同時被氧化分解?？捎米贤夥止夤舛确ㄓ诓ㄩL220和275nm處，分別測出吸光度A220及A275按式(1)求出校正吸光度A：A=A220—2A275 (1)按A的值查校準曲線并計算總氮(以NO3－N計)含量。試劑和材料除非(4.1)另有說明外，分析時均使用符合國家標準或專業(yè)標準的分析純試劑。水，無氨。按下述方法之一制備；離子交換法：將蒸餾水通過一個強酸型陽離子交換樹脂(氫型)柱，流出液收集在帶有密封玻璃蓋的玻璃瓶中。4.1.2蒸餾法：在1000mL蒸餾水中，加入0.10mL硫酸(p=1.84g/mL)。并在全玻璃蒸餾器中重蒸餾，棄去前50mL餾出液，然后將餾出液收集在帶有玻璃塞的玻璃瓶中。4.2氫氧化鈉溶液，200g/L：稱取20m氫氧化鈉(NaOH),溶于水(3.1)中，稀釋至100mL。4.3氫氧化鈉溶液，20g/L：將(4.2)溶液稀釋10倍而得。4.4堿性過硫酸鉀溶液：稱取40g過硫酸鉀(K2S2OB)，另稱取15g氫氧化鈉(NaOH)，溶于水(4.1)中，稀釋至1000mL，溶液存放在聚乙烯瓶內，最長可貯存一周。鹽酸溶液，1＋9。硝酸鉀標準溶液。4.6.1硝酸鉀標準貯備液，CN=100mg/L:硝酸鉀(KNO3)在105?110C烘箱中干燥3h，在干燥器中冷卻后，稱取0.7218g，溶于水(4.1)中，移至1000mL容量瓶中，用水(4.1)稀釋至標線在0?10C暗處保存，或加入1?2mL三氯甲烷保存，可穩(wěn)定6個月。4.6.2硝酸鉀標準使用液，CN=10mg/L：將貯備液用水(4.1)稀釋10倍而得。使用時配制。硫酸溶液，1＋35。儀器和設備常用實驗室儀器和下列儀器。5.2紫外分光光度計及10mm石英比色皿。5.3醫(yī)用手提式蒸氣滅菌器或家用壓力鍋(壓力為1.1?1.4kg/cm2)，鍋內溫度相當于120?124C。5.4具玻璃磨口塞比色管，25mL。所用玻璃器皿可以用鹽酸(1＋9)或硫酸(1＋35)浸泡，清洗后再用水(4.1)沖洗數(shù)次。樣品采樣在水樣采集后立即放入冰箱中或低于4C的條件本保存，但不得超過24h。水作放置時間較長時，可在1000mL水樣中加入約0.5mL硫酸(p=1.84g/mL)，酸化到pH小于2，并盡快測定。樣品可貯存在玻璃瓶中。試樣的制備取實驗室樣品(6.1)用氫氧化鈉溶液(4.3)或硫酸溶液(4.7)調節(jié)pH至5?9從而制得試樣。如果試樣中不含懸浮物按(7.1.2)步驟測定，試樣中含懸浮物則按(7.1.3)步驟測定。分析步驟測定7.1.1用無分度吸管取lO.OOmL試樣(CN超過100pg時，可減少取作量并加水(4.1)稀釋至10mL)置于比色管中。試樣不含懸浮物時，按下述步驟進行。加入5mL堿性過硫酸鉀溶液(4.4),塞緊磨口塞用布及繩等方法扎緊瓶塞，以防彈出。將比色管置于醫(yī)用手提蒸氣滅菌器中，加熱，使壓力表指針到1.1?1.4kg/cm2，此時溫度達120?124°C后開始計時。或將比色管置于家用壓力鍋中，加熱至頂壓閥吹氣時開始計時。保持此溫度加熱半小時。冷卻、開閥放氣，移去外蓋，取出比色管井冷至室溫。加鹽酸(1+9)1mL,用無氨水稀釋至25mL標線，混勻。移取部分溶液至10mm，石英比色皿中，在紫外分光光度計上，以無氨水作參比，分別在波長為220與275nm處測定吸光度，并用式(1)計算出校正吸光度A。7.1.3試樣含懸浮物時，先按上述7.1.2中a至d步驟進行，然后待澄清后移取上清液到石英比色皿中。再按上述7.1.2中e步驟繼續(xù)進行測定?？瞻自囼灴瞻自囼灣?0mL水(4.1)代替試料外，采用與測定完全相同的試劑、用量和分析步驟進行平行操作。注：當測定在接近檢測限時，必須控制空白試驗的吸光度Ab不超過0.03，超過此值，要檢查所用水、試劑、器皿和家用壓力鍋或醫(yī)用手提滅菌器的壓力。校準校準系列的制備：用分度吸管向一組(10支)比色管(5.4)中，分別加入硝酸鹽氮標準使用溶液(4.6.2)0.0,0.10，0.30，0.50，0.70，1.00，3.00，5.00，7.00，10.00mL。加水(4.1)稀釋至10.00mL。按7.1.2中a至e步驟進行測定。校準曲線的繪制：零濃度(空白)溶液和其他硝酸鉀標準使用溶液(4.6.2)制得的校準系列完成全部分析步驟，于波長220和275nm處測定吸光度后，分別按下式求出除零濃度外其他校準系列的校正吸光度As和零濃度的校正吸光度Ab及其差值ArTOC\o"1-5"\h\zAs=As220-2As275 (2)Ab=Ab220—2Ab275 (3)Ar=As—Ab (4)式中：AS220——標準溶液在220nm波長的吸光度；AS275——標準溶液在275nm波長的吸光度；Ab220——零濃度(空白)溶液在220nm波長的吸光度；Ab275——零濃度(空白)溶液在275nm波長的吸光度。按Ar值與相應的NO3-N含量?g)繪制校準曲線。結果的表示8.1計算方法按式(1)計算得試樣校正吸光度Ar，在校準曲線上查出相應的總氮pg數(shù)，總氮含量(mg/L）按下式計算:式中：m——試樣測出含氮量，Mg；V 測定用試樣體積，mLo精密度與準確度9.1重復性21個實驗室分別測定了亞硝酸鈉，氨基丙酸與氯化銨混合樣品；CW604氨氮標準樣品；L－谷氨酸與葡萄糖混合作品。上述三種作品含氮量分別為1.49,2.64和1.15mg/L,其分析結果如下：各實驗室的室內相對標準偏差分別為2.3,1.6和2.5%。室內重復測定允許精密度分別為0.074，0.092和0.063mg/Lo再現(xiàn)性上述實驗室對上述三種統(tǒng)一合成樣品測定。實驗室間相對標準偏差分別為3.1%,1.1%和4.2%；再現(xiàn)性相對標準偏差分別為4.0%，1.9%和4.8%；總相對標準偏差分別為3.8，1.9和4.9%o準確度上述實驗室對上述三種統(tǒng)一合成樣品測定,實驗室內均值相對誤差分別為6.3%,2.4%和8.7%o室內單內相對誤差分別為7.5%,3.8%和9.8%。實驗室平均回收率置信范圍分別為99.0±6.4%,99.0±5.1%和101±9.4%o附加說明：本標準由國家環(huán)境保護局規(guī)劃標準處提出。本標準由上海市環(huán)境監(jiān)測中心負責起草。本標準起草人戴克慧。本標準委托中國環(huán)境監(jiān)測總站負責解釋。實驗1總氮量的測定微量凱氏（Mirco-Kjeldahl）定氮法一、 目的1、 學習微量凱氏定氮法的原理2、 掌握微量凱氏定氮法的操作技術,包括標準硫酸銨含量的測定,未知樣品的消化、蒸餾、滴定及其含氮量的計算等。二、 原理凱氏定氮法常用于測定天然有機物（如蛋白質，核酸及氮基酸等）的含氮量。天然的含氮有機物與濃硫酸共熱時,其中的碳、氫二元素被氧化成二氧化碳和水,而氮則變成氨，并進一步與硫酸作用生成硫酸銨。此時程稱之為“消化”但是,這個反應進行得比較緩慢,通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應的沸點,并加入硫酸銅作為催化劑，以促進反應的進行。甘氨酸的消化過程可表示如下：CHCOOH+3HSOT2C0t+3SOt+4HO+NHt2 4 2 2 2 3NH22NH+HSOT（NH）SO2 4 42 4濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氮，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量，一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中的氫離子結合，生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。然后用標準無機酸滴定，直至恢復溶液中原來氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標準酸的當量數(shù)（相當于待測物中氨的當量數(shù)）計算出待測物中的氮量。（NH4）SO+2NaOHTNaSO+2NHOHTOC\o"1-5"\h\z2 4 2 4 4NHOHTHO+NH3t42NH+HBOTNHHBO3 3 3 4 2 3NHHBO+HCLTNHCL+HBO2 3 4 3 3滴定時用甲烯藍和甲基紅混合指示劑，其指示范圍為pH5?2~5.6,將NHHB0的藍色滴423至原來HB0的藍紫色即為終點。3 3本法適用范圍0.2~1.0毫克氮。相對誤差應小于2%。三、材料、試劑與器具（一）材料人的血清或豬的血清（二）試劑1、濃硫酸（化學噸）2、30%氫氧化鈉（分析純）溶液3、 0.9%NaCl溶液4、 硫酸鉀一硫酸銅混合物：硫酸鉀與硫酸銅（CuSO、5H0）以3：1（W/W）的配比混42合研磨成粉末。5、 2%硼酸6、 混合指示劑的配制：方法一：取50毫升0.1%甲烯藍無水醇溶液與200毫升0.1%甲基紅無水乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶備用，這種指示劑酸性時為紫色，堿性時為綠色，變色范圍窄且靈敏。方法二：0.1%溴甲酚綠乙醇溶液10毫升與0.1%甲基紅乙醇溶液2毫升混和即成。本指示劑的變色范圍為pH5.2T5.4T5.6紫紅色灰色綠色7、 0.0100MHCl8、 硼酸一指示劑混合液：取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示劑貯備液，搖勻后溶液呈現(xiàn)紫紅色即可。（約加1毫升左右混合指示劑）標準硫酸銨溶液（0.3毫克氮/毫升）（三）、器具1、凱氏燒瓶2、消化架3、吸量管（1毫升、2毫升）4、 量筒（10毫升）5、 凱氏定氮蒸餾裝置6、微量滴定管（3毫升、5毫升，可讀至0.02毫升）7、錐形瓶（50~100毫升）8、容量瓶（50毫升）四、操作步驟（一）樣品的處理血清樣品：取人血（或豬血），放于離心管中，于冰箱中放置過液，次日離心除去凝血塊，上層黃色透明清液即為血清。準確吸取血清1.0毫升加入0.9%NaCl4.0毫升，仔細混勻備用。固體樣品：某一固體樣品中的含氮量是100克該物質（干重中所含氮的克數(shù)）來表示（%）。因此在定氮前，應將固體樣品中的水份除掉。一般樣品干燥的溫度都采用105°C,因為非游離的水都不能在100C以下烘干。在稱量瓶中稱入一定量的磨碎的樣品，然后置105C的烘箱內干燥4小時。用坩堝將稱量瓶放入干燥器內，待降至室溫后稱重，按上述操作繼續(xù)烘干樣品。每干燥1小時后，稱量一次，直到兩次稱量的數(shù)量不變，即達恒重。（二）消化取2個50毫升的凱氏燒瓶，向第一號燒瓶內加2毫升稀釋血清溶液（或4毫升核酸制品溶液，或200毫克固體粉末）。注意，用吸量管直接將溶液（或用試管加入固體樣品）加至燒瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶頸上，向2號燒瓶加入2毫升水作空白對照。在每個燒瓶內加入硫酸鉀—硫酸銅混合物約0.2克，濃硫酸3毫升，小瓷片兩粒，搖勻。將燒瓶約60度角固定在鐵架上，每個瓶口放一小漏斗，在通風廚內的電爐上消化。在消化開始時，應控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內水汽蒸完，硫酸開始分解并放出so2白煙后，適當加強火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明綠色為止。消化完畢，待燒瓶內容物冷卻后，加蒸餾水10毫升（注意慢加，邊加邊搖）。冷卻后將瓶內容物轉入50毫升的容量瓶中，并用蒸餾水洗燒瓶數(shù)次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度搖勻，做上記號備用。（三）蒸餾1、儀器的洗滌：儀器應先經(jīng)一般洗滌，再經(jīng)水蒸氣洗滌。蒸餾器（圖1-1）有幾種，應用前需熟悉其使用方法。使用方法如下：開放自來水龍頭，使水E進入G,從K管流出（水不宜開得過大以免水從G管溢出）。開放P3,使水進入A室，漏斗D中加蒸餾水約10毫升入B室。用拇指將管口按緊，同時開放P],則B室中的水先從Y型管口沖出，隨后A室中水經(jīng)K管流出，一般情況下如此重復洗滌兩次即可。若蒸餾器內有氨存在，則應加入蒸餾水后，不加樣品蒸餾一次方可使用。（可用PH試紙檢查。）A為蒸氣發(fā)生室，P3為其開關，P]為出水開關，B為蒸餾室，與出氣室M相遇，M管插入盛有定量酸液的錐形瓶，B室內有Y型管，一端與A室相通，另一端經(jīng)P與漏斗D相連，4可經(jīng)此將樣品及試劑加入B室，F(xiàn)為指形冷凝管，E為進水管，水經(jīng)F、G、K而流出，蒸餾

時B室進消化好的樣品及NaOH,二者反應產(chǎn)生氨，B室經(jīng)M管進入錐形瓶中的酸吸收。圖1-1凱氏微量定氮蒸餾裝置行蒸餾。4、滴定：蒸餾完畢，用0.0100N標準鹽酸溶液滴定錐瓶內溶液至淡紫色或灰色，記錄所用鹽酸的量。（四）計算（A—B）X0.0100X14樣口口的總氮含量（克氮％）= x100CX1000若測定的樣品含氮量部分只是蛋白性，（如血清）則：樣品的總蛋白含量（克蛋白%）(A樣品的總蛋白含量（克蛋白%）(A—B)x0.0100x14x6.25Cx1000x100式中：A為滴定樣品用去的鹽酸平均毫升數(shù)；B為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數(shù)；C為稱量樣品的克數(shù)：0.0100為鹽酸的當量濃度（實際上，此項應按實驗中使用鹽酸的實際濃度填寫）；14為氮的原子量；6.25為常數(shù)（1毫升0.1N鹽酸相當于0.14