質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)原理、儀器試劑和操作步驟

本頁僅作為文檔封面，使用時可以刪除二本頁僅作為文檔封面，使用時可以刪除二?Thisdocumentisforreferenceonly-rar21year.March質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)原理、儀器試劑和操作步驟（總3頁）質(zhì)粒dna的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)原理、儀器試劑和操作步驟【原理】轉(zhuǎn)化是將外源dna分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。轉(zhuǎn)化所用的受體細(xì)胞一般是限制-修飾系統(tǒng)缺陷變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶（R-，M-）。將對數(shù)生長期的細(xì)菌（受體細(xì)胞）經(jīng)理化方法處理后，細(xì)胞膜、的通透性發(fā)生暫時性改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制和表達(dá)實(shí)現(xiàn)信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞具有了新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子（帶有異源DNA分子的細(xì)胞）。本實(shí)驗(yàn)采用CaCI2法制備感受態(tài)細(xì)胞。其原理是細(xì)胞處于0?4°C,CaCI2低滲溶液中，大腸桿菌細(xì)胞膨脹成球狀。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42C90秒熱激處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA得合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型，如氨芐青霉素耐藥（Ampr）得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含Amp的選擇性培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)過夜，即可獲得細(xì)菌菌落。本實(shí)驗(yàn)是將人BcI-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a擴(kuò)增菌，轉(zhuǎn)化后在含Amp的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，生長的菌落即為含重組質(zhì)粒的工程菌。含人BcI-2重組質(zhì)粒的DH5a菌用于質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增，獲得的質(zhì)粒將作為限制性內(nèi)切酶的酶切底物DNA?！驹噭┡c器材】?LB液體培養(yǎng)基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、lOgNaCI加水至1L，高壓滅菌消毒。.LB固體培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基中加%瓊脂粉，高壓滅菌消毒，待泠卻至不燙手背時鋪培養(yǎng)皿。.LCaCI2高壓滅菌消毒或過濾除菌。?氨芐青霉素用無菌水或生理鹽水配制成100mg/mI溶液，置-20C保存。5.人BcI-2重組質(zhì)粒它是EcoRI單酶切的pBIuescriptIIKS（-）載體與EcoRI單酶切的人BcI-2cDNA重組而成的，大小為4861bp，前者是一種由pUC19質(zhì)粒衍生而來的具有2961bp的質(zhì)粒載體。因此用EcoRI酶切則應(yīng)到空載pBluescriptIIKS(-)載體和人Bcl-2cDNA片段。配制成2g/1口l。?大腸桿菌DH5a此為DNA擴(kuò)增菌．恒溫水浴箱．超凈工作臺．高速冷凍離心機(jī)．恒溫?fù)u床11．恒溫箱12．消毒離心管．消毒tips．玻璃培養(yǎng)皿直徑90mm．玻璃涂布器．95%乙醇．標(biāo)記筆【操作步驟】1．細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞的制備將DH5a菌種劃線于LB瓊脂板上，37°C培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于5mlLB培養(yǎng)基中，37C振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)過夜。次日取菌液1ml接種至含有100mlLB培養(yǎng)基的燒瓶中，37C劇烈振蕩培養(yǎng)至約2?3h，待A600值達(dá)到?時將燒瓶置于冰浴10?15min。將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個滅菌處理過的冰預(yù)冷的50ml離心管中。4000Xg，4C離心10min，棄培養(yǎng)基，將管倒置于濾紙使最后的殘留液體流盡。加預(yù)冷的已過濾除菌的LCaCl2重懸菌體，置冰浴30min。4000Xg，4C離心10min，棄培養(yǎng)基。再加4ml預(yù)冷的LCaCl2，輕輕重懸菌體，置4C冰箱12?16h。2.DNA重組子的轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a本實(shí)驗(yàn)中的DNA重組子為人Bcl-2重組質(zhì)粒。在無菌條件下按每管取200口l新鮮感受態(tài)DH5a細(xì)菌置于無菌的5ml塑料離心管中，共2管，分別加入人Bcl-2重組質(zhì)粒（10ng）和消毒水（作陰性對照）各5口l，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰上放置30min。42°C，熱休克90s，中途不要搖動離心管，每管加800口l無抗生素的LB培養(yǎng)基，于37C空氣搖床中以150r/min速度振搖45min，使細(xì)菌復(fù)蘇。每管取200口l加至含氨芐青霉素（Amp）的LB瓊脂平板上，用玻璃涂布器涂布均勻，室溫放置2